鲜血。2007年1月1日；109(1): 339–342.
肿瘤形成
JAK2号机组V617F型：中国大医院人群的患病率
,1,2 ,1 ,1 ,1,三 ,1 ,4 ,1和1,三
徐雪松
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
2吉林大学中日协和医院临床实验室，长春；
张琪（音译）
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
罗健（Jian Luo）
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
舒兴
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
三俄克拉荷马市俄克拉何马大学健康科学中心病理学系；
李青山
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
桑福德·B·克兰茨
4田纳西州纳什维尔范德比尔特大学范德比特-英格拉姆癌症中心医学部血液/肿瘤科
傅雪琪
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
赵志庄Joe Zhao
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
三俄克拉荷马市俄克拉何马大学健康科学中心病理学系；
1吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春；
2吉林大学中日协和医院临床实验室，长春；
三俄克拉荷马市俄克拉何马大学健康科学中心病理学系；
4田纳西州纳什维尔范德比尔特大学范德比特-英格拉姆癌症中心医学部血液/肿瘤科
作者
通信：傅雪琪，吉林大学生命科学学院Edmond H.Fischer信号转导实验室，长春，130023；电子邮件：nc.ude.ulj@qxf; 或 贡献：X.X.、Q.Z.、J.L.和S.X.进行了研究；Q.L.和S.B.K.分析数据；X.F.和Z.J.Z.设计、分析数据并撰写论文。
收稿日期：2006年3月13日；2006年8月16日接受。
摘要
最近，JAK2V617F型在骨髓增生性疾病（MPD）患者中发现突变，包括大多数真性红细胞增多症（PV）患者。突变的JAK2增加了激酶活性，在小鼠模型中显示出致病性。在此，我们分析了从临床实验室随机采集的血样。令人惊讶的是，在总共3935个样本中，多达37个样本被发现JAK2突变呈阳性。然而，这些样本中只有一个样本的血液测试结果表明可能存在PV，但有几个样本患有非血液病。平均而言，突变样本的红细胞计数正常，但白细胞和血小板计数显著升高，尽管大多数都在正常范围内。数据表明JAK2V617F型突变显然比MPD更常见。它的发生可能是全血细胞异常和其他疾病的前奏，但它本身无法诊断MPD。
介绍
蛋白酪氨酸激酶是信号通路的中央调节器，是很有吸引力的治疗靶点。1-三最近，一些研究小组在真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和特发性骨髓纤维化中发现JAK2酪氨酸激酶的反复体细胞激活突变。4-8在慢性粒单核细胞白血病、非典型骨髓增生性疾病（MPD）、骨髓增生异常综合征、系统性肥大细胞增多症、慢性中性粒细胞白血病和急性髓系白血病中也很少出现这种突变。9-13这种突变导致JAK2假激酶结构域内缬氨酸到苯丙氨酸的取代。突变JAK2具有增强的酪氨酸激酶活性，并在小鼠骨髓移植模型中导致PV样表型。6,14,15然而，JAK2是否V617F型突变是这些疾病的唯一原因，也是为什么它与如此广泛的表型相关。之前的调查是为了确定JAK2V617F型在特定疾病的样本中。在本研究中，我们分析了从临床实验室随机采集的血样。
材料和方法
血液样本
从中国长春中日协和医院临床实验室随机采集了来自任何年龄、性别和疾病的捐赠者（所有中国人）的经鉴定的连续外周血样本，为期约6个月。机构审查委员会获得了吉林大学和俄克拉荷马大学健康科学中心的批准。
PCR扩增
从全血中提取基因组DNA。一个基因组DNA片段，包含JAK2号机组用引物P1和P1r通过聚合酶链反应（PCR）扩增出携带V617F突变位点的基因(A） ●●●●。PCR使用Taq DNA聚合酶或Phusion聚合酶（用于确认阳性样本）进行35个周期，94℃持续20秒，60℃持续20秒钟，72℃持续30秒。对于等位基因特异性PCR，初始PCR产物的0.2μL用于进一步PCR扩增，使用嵌套引物P2和P2r、突变特异性引物Pmr和非突变特异性引物Pnf(A） ●●●●。除30个周期外，PCR按上述方法进行。对于英国标准协会X1型16,17并对521bp（碱基对）的初始PCR产物进行凝胶纯化。消化3小时后英国标准协会X1，使用上述引物P2和Pmr通过等位基因特异性PCR扩增产物（图S1）。使用ABI3730毛细管测序仪（ABI Instruments，Foster City，CA）进行DNA测序。在整个实验中，使用携带521 bp JAK2基因组DNA的纯化质粒DNA作为对照。
JAK2等位基因特异性PCR检测和DNA测序V617F型突变PCR设计和引物序列。（B） 使用标准DNA质粒验证等位基因特异性PCR分析。含有野生型和JAK2的基因组DNA的521-bp片段V617F型用P1和P1r引物进行突变，并克隆到pBluescript-KS载体（Stratagene，La Jolla，CA）。总共4 ng质粒DNA混合物含有指定数量的JAK2第617页用P2、P2r、Pmr和Pnf的引物混合物对突变体进行PCR分析。（C-D）血液基因组DNA的等位基因特异性PCR分析。用引物P1和P1r进行PCR扩增基因组DNA，然后用等位基因特异性引物混合物P2、P2r、Pmr和Pnf进一步扩增。PCR产物在3%琼脂糖上进行分析，并用溴化乙烯染色进行可视化。预期PCR产物由i（453 bp）、ii（279 bp）和iii（229 bp）表示。在血液DNA样本（C-D）中，787、978和1385号被视为阴性，其余均被视为阳性。（E） 利用引物P1和P1r扩增的基因组DNA PCR产物的序列测定。用引物P1r从3′-侧进行测序。通过测量DNA测序数据的相对峰高，参照使用含有已知比例JAK2的标准DNA混合物获得的数据，确定总PCR产物中突变的百分比V617F型和野生型JAK2。
统计分析
使用Excel程序（Microsoft，Redmond，WA）进行统计分析。使用以下方法评估两组样本之间的差异t吨假设方差不相等的检验。P（P）小于.05（2尾）的值被认为是显著不同的。
结果和讨论
用于JAK2的初步筛选V617F型，我们依赖于巢式等位基因特异PCR方法，其引物如A使用携带突变和野生型DNA的DNA质粒验证了该方法的特异性和敏感性，如B.该方法可以明确检测到低至0.25%的突变。C-D显示了几个阳性和阴性样本的等位基因特异PCR分析。用这种方法，我们总共检测到38个JAK2V617F型-阳性样本。通过使用英国标准协会X1限制性内切酶消化方法（详情参见图S1，可从血液网站；请参阅在线文章顶部的补充数字链接）。因此，我们从总共3935份样本中鉴定出37份阳性样本，占0.94%。通过对引物P1和P1r获得的521-bp PCR产物进行DNA测序，我们验证了12个阳性样本，其中至少含有7%的突变DNA(E） ●●●●。剩下的25个样本中含有不到5%的突变，无法通过DNA测序明确确认。
整个组和JAK2的血液测试结果V617F型-阳性样本如所示在37 JAK2中V617F型-阳性样本中有23个具有特定年龄段。平均年龄为55.6岁（SD=13.6岁），明显高于整个样本的平均值(P（P）= .02). 大多数阳性样本的红细胞计数和血红蛋白水平正常。只有一名患者（编号1695）的血红蛋白水平略高于正常值，该患者的白细胞和血小板计数也升高，提示可能存在PV。18JAK2的平均白细胞和血小板计数V617F型-阳性样本为9.44×109/L（标准偏差=5.07×109/五十） 和272×109/L（标准偏差=99.6×109/五十） 分别显著高于整个样本(P（P）分别为.02和.001）。10份样本的血小板计数高于正常值，但没有一份达到ET的诊断水平。1911个样本的白细胞计数高于正常值，其中4个样本的血小板计数较高，但我们不知道这些是否代表继发性升高。我们收集了19个样本的详细临床信息，其中15个样本患有各种疾病，包括肾衰、胃癌、肺炎、血栓形成、冠心病、糖尿病、颈椎损伤、动脉硬化、脑缺血、脑梗死和骨折。重要的是，这19名捐赠者中没有一人被诊断患有MPD，也没有一人接受过已知会影响血液计数的化疗或放疗。
表1
| 性别 | 年龄，y | 白细胞计数，×109/L（左） | 红细胞计数，×1012/L（左） | 血红蛋白水平，g/L | 血小板计数，×109/L（左） | V716F，% | 诊断 |
|---|
| 整个样品，平均值±SD | — | 48.6 ± 16.6 | 7.39 ± 3.69 | 4.26 ± 1.19 | 128.3 ± 23.4 | 213.4 ± 84 | — | — |
| JAK2号机组V617F型正，平均值±SD | — | 55.6 ± 13.6 | 9.44 ± 5.07 | 4.40 ± 0.58 | 132 ± 19 | 272 ± 99.6 | — | — |
| 样品编号. |
| 224 | M（M） | 不适用 | 4* | 3.02* | 88* | 92* | 41 | 肾功能衰竭 |
| 500 | F类 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 86 | 不适用 |
| 548 | M（M） | 37 | 11.1† | 3.69* | 101* | 382† | < 5 | 胃癌 |
| 832 | M（M） | 58 | 8.8 | 5.44 | 156 | 249 | < 5 | 肺炎 |
| 860 | F类 | 不适用 | 4.7 | 4.67 | 145 | 202 | < 5 | 不适用 |
| 896 | F类 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 57 | 不适用 |
| 1255 | M（M） | 不适用 | 4.6 | 3.74* | 99* | 147 | 48 | 不适用 |
| 1381 | M（M） | 不适用 | 10 | 4.79 | 141 | 432† | < 5 | 不适用 |
| 1591 | M（M） | 41 | 20.1† | 3.74* | 118* | 216 | < 5 | 动静脉血栓形成 |
| 1644 | M（M） | 不适用 | 4.7 | 4.82 | 130 | 196 | < 5 | 不适用 |
| 1648 | F类 | 不适用 | 14.3† | 4.27 | 136 | 256 | < 5 | 不适用 |
| 1651 | F类 | 不适用 | 4* | 5.17 | 105* | 297 | < 5 | 不适用 |
| 1695 | M（M） | 不适用 | 15.2† | 5.39 | 166† | 521† | 7 | 不适用 |
| 1909 | M（M） | 61 | 8.4 | 4.33 | 123* | 275 | < 5 | 不适用 |
| 2026 | M（M） | 45 | 7.3 | 4.58 | 148 | 170 | < 5 | 不适用 |
| 2066 | F类 | 74 | 8.1 | 4.85 | 157 | 295 | < 5 | 不适用 |
| 2109 | F类 | 69 | 9 | 4.38 | 129 | 367† | < 5 | 不适用 |
| 2281 | F类 | 68 | 6.6 | 3.88 | 123 | 206 | < 5 | 不适用 |
| 2304 | F类 | 不适用 | 6 | 4.46 | 134 | 372 | < 5 | 不适用 |
| 2335 | M（M） | 44 | 3.1* | 4.63 | 145 | 174 | < 5 | 血管瘤 |
| 2629 | F类 | 不适用 | 9.2 | 4.05 | 121 | 387† | 30 | 不适用 |
| 2655 | F类 | 不适用 | 7.4 | 4.6 | 143 | 279 | < 5 | 不适用 |
| 2773 | M（M） | 53 | 4.5 | 4.77 | 143 | 301† | < 5 | 冠心病 |
| 2781 | M（M） | 54 | 15.6† | 4.75 | 141 | 454† | 8 | 不适用 |
| 2823 | M（M） | 43 | 6.1 | 4.94 | 154 | 234 | < 5 | 糖尿病 |
| 2881 | M（M） | 不适用 | 9.5 | 3.2* | 112* | 197 | < 5 | ND（无损检测） |
| 2908 | M（M） | 38 | 10.7† | 4.41 | 146 | 179 | < 5 | 颈椎损伤 |
| 2926 | M（M） | 66 | 9 | 4.04 | 124 | 246 | < 5 | 糖尿病 |
| 2943 | F类 | 65 | 5.8 | 4.05 | 132 | 190 | < 5 | 冠心病 |
| 2944 | F类 | 48 | 18.2† | 4.27 | 125 | 464† | 45 | ND（无损检测） |
| 3015 | F类 | 65 | 10.5† | 3.97 | 117 | 236 | 11 | 动脉硬化 |
| 3042 | M（M） | 50 | 3.5* | 4.48 | 124 | 145 | < 5 | 肺炎 |
| 3243 | M（M） | 45 | 26.2† | 4.45 | 132 | 273 | < 5 | ND（无损检测） |
| 3714 | M（M） | 73 | 12.6† | 4.9 | 151 | 254 | 8 | 脑缺血 |
| 3910 | F类 | 82 | 9.7 | 5.07 | 163 | 306† | 46 | ND（无损检测） |
| 3981 | M（M） | 34 | 12.2† | 4.99 | 136 | 216 | < 5 | 脑梗死 |
| 4120 | F类 | 66 | 9.6 | 3.39 | 105 | 310† | 10 | 骨折 |
总之，通过使用嵌套等位基因特异PCR和英国标准协会X1消化分析确定37个JAK2V617F型-阳性样本共有3935份，约占1%。其中12个样本（相当于0.3%）含有足够的突变，可通过DNA测序分析进行牢固检测。任何一个正突变的数字都出乎意料地高。JAK2号机组V617F型主要见于PV、ET和特发性骨髓纤维化，但在髓系恶性肿瘤中少见。4-8,9-13经典MPD相对较少。其中，PV的发病率最高，但其发生率在美国仅为0.002%，在亚洲要低得多。18因此，我们的研究表明JAK2V617F型突变比预期的MPD数量更常见，并且它可能发生在非血液疾病中。然而，数据并没有表明突变与血液病无关。这可能是广泛血液疾病的早期表现，尤其是尚未完全表现出来的MPD。
JAK2是一种酪氨酸激酶，参与调节细胞生长的信号通路。20,21导致融合解除JAK2活性调控的染色体易位与白血病有关。22-24研究表明JAK2V617F型在小鼠模型中导致PV样表型。6,14,15我们的数据表明，这种突变比MPD更常见，并且存在于许多其他未表现出MPD的患者中。有趣的是，许多JAK2V617F型携带者的白细胞或血小板计数升高。这些升高可能足以表明全血障碍发生前即将出现的临床问题。考虑到其激酶活性大大增强，突变JAK2应该具有致病意义。JAK2号机组V617F型可能不完全用于MPD的诊断，但它可能有助于MPD和其他疾病的早期识别、这些疾病的预后以及设计适当的预防和治疗方法。JAK2的发病率相对较高V617F型突变进一步表明它对人类健康的重要性。因此，需要进一步研究以确定其病理作用以及其发生与环境因素的相关性。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（批准号30470391）（X.F.）和国家卫生研究院（批准号HL076309和HL079441）（Z.J.Z.）的支持。
脚注
本文的在线版本包含数据补充。
内部血液本文的分析出现在这个问题的前面。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，本文特此标记为“广告”。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
工具书类
1.Blume-Jensen P，Hunter T.癌基因激酶信号传导。自然。2001;411:355–365.[公共医学][谷歌学者] 2Druker BJ、Talpaz M、Resta DJ等。BCR-ABL酪氨酸激酶特异性抑制剂在慢性粒细胞白血病中的疗效和安全性。N英格兰医学杂志。2001;344:1031–1037.[公共医学][谷歌学者] 三。Apperley JF、Gardembas M、Melo JV等。血小板衍生生长因子受体β重排慢性骨髓增生性疾病患者对甲磺酸伊马替尼的反应。N英格兰医学杂志。2002;347:481–487.[公共医学][谷歌学者] 4Baxter EJ、Scott LM、Campbell PJ等。人类骨髓增生性疾病中酪氨酸激酶JAK2的获得性突变。柳叶刀。2005;365:1054–1061.[公共医学][谷歌学者] 5Levine RL、Wadleigh M、Cools J等。真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓样化生伴骨髓纤维化患者酪氨酸激酶JAK2的激活突变。癌细胞。2005;7:387–397.[公共医学][谷歌学者] 6James C、Ugo V、Le Couedic JP等。导致构成性信号传导的独特克隆JAK2突变导致真性红细胞增多症。自然。2005;434:1144–1148.[公共医学][谷歌学者] 7Kralovics R、Passamonti F、Buser AS等。骨髓增生性疾病中JAK2的获得性功能突变。N英格兰医学杂志。2005;352:1779–1790.[公共医学][谷歌学者] 8赵锐，邢S，李忠，等。真性红细胞增多症获得性JAK2突变的鉴定。生物化学杂志。2005;280:22788–22792. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Steensma DP、Dewald GW、Lasho TL等。JAK2 V617F激活酪氨酸激酶突变在“非典型”骨髓增生性疾病和骨髓增生异常综合征中都是罕见事件。鲜血。2005;106:1207–1209. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Jones AV、Kreil S、Zoi K等。慢性骨髓增生性疾病中JAK2 V617F突变的广泛发生。鲜血。2005;106:2162–2168.[公共医学][谷歌学者] 11Scott LM、Campbell PJ、Baxter EJ等。V617F JAK2突变在除经典骨髓增生性疾病以外的癌症和髓系恶性肿瘤中罕见。鲜血。2005;106:2920–2921.[公共医学][谷歌学者] 12Jelinek J、Oki Y、Gharibyan V等。JAK2突变1849G>T在急性白血病中很少见，但在CMML、Philadelphia染色体阴性CML和巨核细胞白血病中也可以发现。鲜血。2005;106:3370–3373. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Levine RL、Loriaux M、Huntly BJ等。JAK2V617F激活突变发生在慢性粒单核细胞白血病和急性髓细胞白血病中，但不发生在急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病中。鲜血。2005;106:3377–3379. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Wernig G、Mercher T、Okabe R等。Jak2V617F的表达在小鼠骨髓移植模型中导致类真性红细胞增多症并伴有相关的骨髓纤维化。鲜血。2006;107:4274–4281. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Lacout C、Pisani DF、Tulliez M、Moreau Gachelin F、Vainchenker W、Villeval JL。JAK2V617F在小鼠造血细胞中的表达导致MPD模拟人PV继发性骨髓纤维化。鲜血。2006年5月2日作为内政部预出版10.1182/血液-2006-02-002030（现为《血液》，2006年；108:1652-1660）[公共医学][谷歌学者] 16Campbell PJ、Scott LM、Baxter EJ、Bench AJ、Green AR、Erber WN。人类骨髓增生性疾病JAK2 V617F突变的检测方法。方法分子医学。2006;125:253–264.[公共医学][谷歌学者] 17Bock O，Busche G，Koop C，Schroter S，Buhr T，Kreipe H。检测慢性骨髓增生性疾病骨髓环钻活检中Janus激酶2 JH2假激酶域的单一热点突变。分子诊断杂志。2006;8:170–177. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18斯皮瓦克JL。真性红细胞增多症：神话、机制和管理。鲜血。2002;100:4272–4290.[公共医学][谷歌学者] 19Tefferi A，Murphy S。原发性血小板增多症的当前观点：发病机制、诊断和治疗。血液Rev。2001;15:121–131.[公共医学][谷歌学者] 20Verma A、Kambhampati S、Parmar S等。癌症激酶的Jak家族。癌症转移评论。2003;22:423–434.[公共医学][谷歌学者] 21赵志杰，瓦因琴克W，坎茨SB，等。酪氨酸激酶和磷酸酶在真性红细胞增多症中的作用。赛明血液。2005;42:221–229.[公共医学][谷歌学者] 22.Reiter A、Walz C、Watmore A等。t（8；9）（p22；p24）是一种慢性和急性白血病的复发性异常，融合了PCM1和JAK2。癌症研究。2005;65:2662–2667.[公共医学][谷歌学者] 23.Lacronique V、Boureux A、Valle VD等。人类白血病中具有组成性激酶活性的TEL-JAK2融合蛋白。科学。1997;278:1309–1312.[公共医学][谷歌学者] 24Peeters P、Raynaud SD、Cools J等。t淋巴细胞中的t（9；12）和髓系白血病中的t。鲜血。1997;90:2535–2540.[公共医学][谷歌学者] 
