在过去的一个世纪里，通过对少数模式生物进行密集的基因筛选，人们对发育和生理过程的遗传基础了解了很多。由于它们的力量，这些模型中的正向遗传方法将继续在理解遗传网络方面发挥重要作用(戴维森2001). 此外，在实验室外数以百万计物种的惊人多样性中，存在着大量的表型变异，其遗传基础还相对未被探索(Carroll等人，2005年). 促进快速鉴定诱变诱导和自然表型变异基因的方法将有助于更深入地了解许多生物过程(费舍尔1930；Orr和Presgraves 2000).
遗传作图是破译表型变异分子基础的重要工具。长期以来，重组作图被用于将遗传标记与孟德尔性状的存在或不存在联系起来。同样的基本方法允许基因组区域和数量性状表型方差比例之间的统计关联(林奇和沃尔什1998；麦凯2001；Doerge 2002年). 此外，利用多代祖先重组的关联作图潜力开始被认为是一种直接绘制自然种群变异图的方法，而无需首先进行实验室杂交(Luikart等人，2003年；斯托兹2005；Breseghello和Sorrells 2006年). 所有这些方法都需要高通量、经济高效的方法来识别和基因型多态性。
基因分型方法传统上成本高昂且劳动密集，但新的高通量技术前景看好。等位基因特异性寡核苷酸微阵列允许在一次杂交中对数千个单核苷酸多态性（SNP）进行评分(Wang等人，1998年；Matsuzaki等人，2004年). 已开发出其他方法，使用标记的基因组DNA与短寡核苷酸阵列直接杂交(Winzeler等人，1998年；Borevitz等人，2003年). 与SNPs一样，单特征多态性（SFP）可以在短寡核苷酸阵列的可用性下以高密度被发现和分型。然而，它们广泛使用的障碍是巨大的。为了创造这些方法所需的物理资源，需要将先前的测序、标记识别的重新测序、寡核苷酸合成和其他昂贵的生产成本结合起来。对于非模型系统，这种高分辨率映射资源在当前方法中不可行。最近开发了其他基于微阵列的技术，不需要大量前期投资(Jaccoud等人，2001年；Wenzl等人，2004年). 虽然这些程序对于没有大量资源的非模式生物来说是一个有吸引力的选择，但标记物的数量较少限制了它们的应用。
我们在这里演示第页限制区一关联的D类NA（RAD）标记基因分型，这是一种可以在模型和非模型生物都容易产生的资源上识别和类型化大量标记的方法。首先，我们应用这些标记快速绘制模型生物体中的重组断点黑腹果蝇使用预先存在的基因组平铺路径微阵列。其次，我们通过提出一种使用RAD标记DNA快速生产低成本微阵列基因分型资源的方法，展示了这些标记的一个更强大的方面。我们制作了一个用于三脊背棘的RAD标记微阵列(针状腹股沟)这允许同时为批量和单个样本输入数千个标记。使用RAD标记的方法和开发RAD标记微阵列资源的方法可以大大提高在模型和非模型系统中识别性状遗传基础的速度。
结果
限制性位点相关DNA（RAD）标记
破坏限制性位点的单核苷酸多态性长期以来一直由多种遗传标记（如RFLP、AFLP）进行分析(Botstein等人，1980年；Vos等人，1995年). 目前基于限制性位点多态性的技术的一个缺点是，它们只筛选任何特定酶的一小部分可用限制性位点。我们开发了一种方法，可以并行筛选特定酶的几乎每个限制位点(). 基因组DNA用一种特殊的限制性内切酶消化，然后连接到生物素连接体。然后，DNA被随机剪切成比限制位点之间的平均距离小得多的片段，只剩下直接位于限制位点两侧的片段附着在连接子上。链亲和素珠用于固定这些片段，同时去除其余DNA。最初限制位点的消化用于从珠子中释放碎片。这个过程专门分离出DNA标签，直接位于基因组中特定限制性内切酶限制位点的两侧。我们所称的限制性位点相关DNA（RAD）标记可以通过检测微阵列上RAD-tag样本的差异杂交模式来识别和/或分型().
限制性位点相关DNA（RAD）标记可以通过检测微阵列上RAD标记的差异杂交模式来识别和分型。基因组DNA样本S1和S2包含基因组中不同位置的各种限制性内切酶的识别序列。深蓝色三角形代表特定酶的限制位点。其中一些限制性位点仅存在于一个样本中，因为多态性破坏了识别序列（红色星号）。这两个样品分别用一种特殊的限制性内切酶消化，然后连接到生物素连接体（浅蓝色椭圆）。DNA被随机剪切，只留下直接位于生物素连接子限制位点两侧的片段。使用链霉亲和素珠纯化这些片段，并在原始限制位点消化释放。含有基因座的多态性，如左边S2或正确的S1位点在纯化的RAD-tag样本中不包含该位点的标记，从而导致微阵列上RAD标记的差异杂交模式。
RAD标记快速将断点定位到果蝇属
我们首先确认了使用RAD标记进行基因分型的可行性，方法是在D.黑腹果蝇是一种具有丰富基因组资源的模式生物。我们之前设计了一种斑点、平铺路径微阵列，由3kb克隆组成，用于对果蝇属基因组(Hollich等人，2004年；Sandmann等人，2006年)这使得测试不同飞行路线之间RAD标记的行为成为可能。从两个多态性菌株（Oregon-R和Canton-S）的EcoRI消化基因组DNA中分离出RAD标签。将两个RAD-tag样本竞争性地直接杂交到基因组拼接阵列，以识别多态性标记。两个独立的重复试验的相关系数为第页= 0.94. 通过使用平均比率的双重截止值，我们在两个品系之间鉴定了1117个多态性阵列元素。
利用Oregon-R和Canton-S双亲的遗传物质创造了一种携带纯合重组第二染色体的家蝇。我们比较了重组品系与每一个亲本的RAD标签，从而推断染色体遗传模式(). Oregon-R与Canton-S杂交和重组品系与Canton-S杂交在2号染色体右侧产生了类似的标记模式，表明重组体中的染色体物质来自Oregon-R亲本。第二条染色体的左侧显示相反的模式，表明遗传物质来自Canton-S亲本。多态性模式显示RAD标记在3320000和3470000位点之间有明显的转换，表明重组断点位于150-kb区域。使用XhoI消化的基因组DNA重复实验。正如预测的那样，识别出了一组不同的标记，但重组断点映射到了同一区域。因此，RAD标记很容易通过与平铺路径微阵列杂交来识别，并用于快速准确地定位遗传断点。
中使用RAD标记的重组断点映射果蝇属在基因组平铺路径微阵列上鉴定了Oregon-R（OR）和Canton-S（CS）苍蝇之间的多态性RAD标记。黑色勾号在上面图示的第二条染色体代表EcoRI RAD标签的基因组位置，平均差异杂交大于两倍。刻度标记在下面染色体代表XhoI RAD标记，差异杂交>2.3倍。当重组系（Rec.）与OR亲本系进行比较时，发现了多态性标记左边与CS亲本系相比正确的染色体的臂。指示CS遗传的标记模式显示为染色体的蓝色区域，OR遗传显示为红色。箭头表示重组断点。拼接阵列中的大间隙显示为染色体的白色区域。
RAD标记微阵列是识别和分型RAD标记的廉价资源
在缺乏基因组平铺路径微阵列的情况下，如前面所述果蝇属实验表明，RAD标记物可以通过与cDNA或寡核苷酸微阵列杂交来鉴定。然而，这些微阵列的序列表示减少了可识别RAD标记的数量。在许多情况下，没有合适的预先存在的阵列来混合RAD标记。为了缓解这个问题，我们开发了一种新型阵列，用于RAD标记的最佳识别和分型。该微阵列由RAD标记本身组成，优先考虑那些信息性RAD标记(). 我们在三脊背胶中测试了这种阵列制作方法，刺五加，一种新兴的模式生物，缺乏果蝇属但具有多种表型(Bell and Foster 1994年；佩切尔2005；Cresko等人，2006年).
丰富的RAD标记微阵列生产和表征。RAD-tag样本S1和S2包含RAD标记的多态集。两个个体中都存在的RAD标记将不能作为信息标记。为了产生一个能键入大量信息标记的阵列，减法杂交被用来丰富样本特异性RAD标记。RAD-tag克隆库是从这些富集样本中生成的。这些克隆文库被用作聚合酶链式反应的模板，其产物被斑点化以产生RAD标记微阵列。为了识别信息标记，RAD-tag样品S1和S2被荧光标记，并直接竞争性地杂交到阵列中。
我们选择了两个多态性棘背鱼个体，一个来自祖先海洋种群（Rabbit Slough，RS），另一个来自衍生淡水种群（Bear Paw，BP；见Methods）。这两个群体的个体之前都曾被用于骨甲变异的实验性绘图研究(Cresko等人，2004年)，而BP群体为脊髓灰质炎基因组计划提供了源材料。从这些个体中分离出EcoRI RAD-tag样本，并在样本之间进行减法杂交，以丰富信息性RAD标签。在一次减法中，BP标记被用作驱动因素，以丰富RS样本的特定标记，并且还进行了倒数减法，以丰富BP特定标记。从每个个体的富集样品中提取9600个克隆的RAD-tag库。这些克隆集被用作PCR模板，其产物被发现为19200个元素，以创建丰富的RAD-tag微阵列。
RAD标记微阵列可以识别数千个多态性标记
我们通过竞争性直接杂交来自相同BP和RS个体的RAD-tag样本，从而确定了这种丰富的RAD标记阵列所键入的信息性标记的数量。实验复制品重复性高(). 两个实验重复的平均值的两倍截断导致通过RS和BP样本之间的差异杂交鉴定了～2000个阵列元素。正如预测的那样，杂交增加与BP-tag样本相关的阵列元件是从BP个体中专门分离出来的。RS-标签样本和RS-衍生阵列元素具有类似的特异性(；). 作为对照，我们研究了在RS和BP RAD-tag样品之间观察到的杂交差异是否是由于单个RAD标签的差异存在，或者仅仅反映了基因组内容的内在差异。将这些个体的基因组DNA剪切、标记并杂交到阵列中，无需RAD-tag分离。在RS和BP RAD-tag样本之间具有杂交差异的1990个元素中，只有112个元素在剪切基因组样本之间存在杂交差异，这表明阵列专门检测RAD标记的存在和缺失。
RAD标记微阵列表征和批量绘图实验。(A类)将来自BP（熊掌个体）和RS（兔子斯洛个体）的RAD标签进行荧光标记，并将其直接竞争性杂交到RAD标记微阵列上。散点图是两个实验重复。BP库中的数组元素显示在左边，上的RS库元素正确的.具有高比率的元件是专门来自RS库的；比率低的元素来自BP库。最小二乘最佳拟合回归方程(右下角计算平均杂交差异大于两倍的元素。(B)完整和低侧板表型。侧板复位表现为隐性孟德尔位点。(C)侧板表型的球分离分析。从完全平板池（CPP）和低平板池（LPP）分离的RAD标签被荧光标记，并直接相互竞争性杂交到RAD阵列。两个库中的元素一起显示。注意，RAD标记与全板等位基因相关的杂交差异比与低板等位蛋白相关的杂交差别更大。这是预期的，因为低板表型的隐性性质。
RAD基因分型方法通过整体分离子分析有效定位了粘性背侧大板位点
我们测试了RAD标记微阵列是否可以用于绘制刺猬自然种群之间表型差异的遗传基础。骨侧板的减少表现为隐性孟德尔位点，映射到连锁群（LG）IV，并在多个淡水种群中反复固定(；Colosimo等人，2004年,2005；Cresko等人，2004年). 由于表型很容易区分，并且之前已经绘制，我们将其用作使用新创建的富集RAD阵列进行遗传绘图的测试案例。
我们分析了一只脊髓灰质炎的RAD标记F类2定位分离侧板表型的家系。这个映射族是通过杂交产生的F类1是RS海洋鱼类与泥湖（MD）鱼类交配的产物。与BP种群相似，MD是一个衍生淡水种群，进化出低侧板表型。制作了两个基因组DNA池，一个来自16个具有完整侧板表型的个体，另一个来自数量相等的具有低侧板表型鱼类。从每个样本池中分离出RAD-tag样本，进行差异标记，并将其竞争性杂交到RAD-tag-微阵列中。正如整体分离物分析所预期的那样，在最初的RS与BP杂交实验中确定的1990个标记中，只有一小部分与侧板表型相关().
我们确定了RAD标记的基因组位置，这些标记在批量实验中具有最大的杂交差异（参见方法）(Birney等人，2006年). 正如预期的那样，一组六个标记聚集在LG IV的3-Mb区域，非常靠近Stn183，该标记最初与阿拉斯加种群的侧板表型有关(Cresko等人，2004年)，中心距埃达之前确定的侧板轨迹(；Colosimo等人，2005年). 令人惊讶的是，第二个由七个RAD标记组成的簇也被发现位于距离埃达。另外三个标记位于远离两个簇的位置。为了验证第二个聚类的相关性，我们为RAD标记RS009H08（OrSSR256）附近的微卫星标记设计了引物，并对76个个体进行了分型F类2用于RAD批量映射的RS×MD家族后代。所有18个低板个体都是低板等位基因的纯合子，所有58个完全板个体都至少有一个完整板等位蛋白的拷贝。只有两个区域中的一个区域的低板等位基因没有纯合子个体。这些数据与两个与侧板表型相关的不同区域或一个显示RAD标记非常非随机分布的大关联块一致。
RAD标记的整体分离分析确定了与侧板表型相关的两个区域。在完整板池与低板池的批量实验中，对16个杂交差异较大的RAD标记（黑色小条）进行测序，并将其放置在连锁组IV上(A类)6个标记聚集在周围的3-Mb区域埃达之前确定的侧板轨迹。7个标记也聚集在25Mb位置附近的2-Mb区域，表明该区域也与侧板表型相关。该星团中心附近的一个微卫星标记OrSSR256证实了这一结果。(B)单个RAD标记数据证实了批量映射结果。八个样本中的每个样本的RAD-tag样本F类2在一个杂交实验中，个体直接与BP（熊爪个体）和RS（兔泥鳅个体）的标签进行比对。这些RAD-tag杂交模式可用于确定个体基因型（开盒，纯合BP；灰盒，杂合；黑盒，纯合子RS）（原始数据见补充图1）。列代表个人；行表示标记。四个完整的平板个体中的一个（04）在周围的RAD标记处是杂合的埃达（存在完整板和低板标记），但25-Mb簇上的完整板等位基因和19Mb的两个标记是纯合的，这表明在埃达簇和标记为19 Mb。个体03在RS004K08缺乏完整的平板等位基因，但在RS001J15和周围的簇中有一个完整的平板等位基因埃达，表明RS001J15和RS004K08之间发生了重组事件，RS004K03和周围星团之间的区域发生了另一次重组事件埃达微卫星标记证实了RS001J15和RS004K08之间的重组事件，并进一步定位了OrSSR252和OrSSR255之间的第二次重组事件。
RAD批量绘图结果通过分析重组个体得到证实
RAD-tag样本是从4个RS×MD的完整个体和4个低板个体中分离出来的F类2家庭。每个RAD-tag样本F类2在一个杂交实验中，个体直接与BP个体的标签进行比对，在另一个实验中与RS个体进行比对。如预期，在两个集群内（大约埃达或第二个25 Mb左右的簇），所有完整的平板个体都至少有一个完整的平板等位基因，而所有低平板个体都是低平板等位蛋白的纯合子(). 个体基因型还表明，八分之二的个体在两个集群之间发生了重组事件。一个完整的平板个体在其中一个集群中是完全平板等位基因纯合子，但在另一个集群中是杂合子()，表明发生了单一重组事件。另一个完整的板状个体在一个集群中是杂合的，在中部部分区域是纯合的低板状个体，在另一个集群是杂合个体()与两个簇之间的双重组或两个单重组事件一致。我们设计并评分了五个新的微卫星标记，以确认RAD标记检测到的这些重组模式。这些数据证实，整体分析选择性地确定了与侧板表型完全相关的两个区域。
讨论
RAD标记
目前基于限制性位点多态性的基因分型技术只筛选特定酶的限制性位点的一个子集中的多态性。这里提出的RAD方法，是一种结合了消化和随机剪切的方法，可以分离出与基因组中几乎每个特定限制位点对应的DNA标签。RAD标记图谱可以通过微阵列杂交在单个或批量样品之间进行比较。
特定酶的独特信息标记数量将由SNP频率和基因组大小决定。对于识别6 bp核苷酸序列的限制性内切酶，我们估计在平均SNP频率为0.5%的个体或菌株之间，信息RAD标记的平均出现频率将低于每100 kb。对于大多数真核生物基因组，理论上有数千个多态RAD标记可用于任何特定的酶。与此相一致的是，在树干RAD阵列上看到的重复标记数量很少，这表明近2000个标记只占可用标记总数的一小部分。此外，使用每一种额外的限制性内切酶都可以获得几乎线性的标记添加。因此，RAD标记允许在几乎任何基因组中发现高密度多态性。
常见微阵列格式的RAD标记基因分型
我们证明，RAD标记可以通过与预先存在的基因组平铺路径微阵列杂交来快速识别和分型(Hollich等人2004；Sandmann等人，2006年). 使用这种方法，我们能够在D.黑腹果蝇RAD标记可以通过与大多数类型的微阵列杂交来识别。然而，随着阵列上序列表示的减少，标记密度将降低。使用表达或平铺阵列进行RAD标记基因分型的主要优点是，这些阵列不是特定于群体或菌株的子集，而是适用于任何个体的通用基因分型平台。此外，随着高密度耕作路径阵列的广泛应用，它们可能成为RAD标记基因分型的强大平台。
快速创建高分辨率RAD标记微阵列基因分型资源
我们证明，RAD标记本身可以用作生产专用阵列的材料来源，从而实现RAD标记的最佳识别和键入。由于RAD标记容易受到各种分子生物学操作的影响，DNA减法技术可用于富集特定样本中的RAD标记，而不是另一个样本中的标记，从而大大增加阵列上的信息标记数量。浓缩RAD标记微阵列的生产技术简单且成本低廉。该过程所需的试剂广泛可用，由此产生的PCR产物库可用于生成数千个RAD阵列。
我们为三棘棘棘棘鱼开发的丰富RAD标记阵列鉴定了近2000个多态RAD标记。这里使用的富集技术产生了约10%的阵列元素信息标记率，与我们在这些相同鱼类的未富集RAD标记阵列上测量的结果相比，其富集倍数超过了三倍（数据未显示）。使用优化的减法方法，可以以更高的信息标记率定期生成库。丰富的RAD标记阵列可实现高通量、高密度的遗传标记鉴定和基因分型，成本极低（每次分析不到50美元），且初始投资很少。
RAD标记分析加速了三棘棘棘棘鱼的生物学发现
由于在行为、形态和生活史特征方面存在丰富的表型变异，三叉戟一直是生物学研究的主题(Wootton 1976年；贝尔和福斯特1994；Cresko等人，2006年). 虽然人们对脊背鲸的表型进化过程已经了解了很多，但由于缺乏遗传和基因组工具，对这种进化的发育遗传学基础的理解受到了阻碍(Kingsley等人，2004年). 这些资源中的一些最近的开发已经开始允许在这种小鱼身上解决广泛的进化遗传问题(佩切尔2005；Cresko等人，2006年). 为了充分探索这些问题，需要一个高通量、低成本的平台，用于在众多刺鱼杂交和种群中进行基因分型。为了解决这一不足，我们开发了第一个基于微阵列的标签鱼映射资源。我们为三棘棘棘棘锥虫制作的富集RAD标记阵列允许快速识别之前确定的负责侧板表型的区域。更重要的是，有了大量的标记，导致了一个先前未知的区域的识别，该区域似乎也与侧板表型相关。
个体的基因分型显示了一个额外的复杂性；在两个区域中只有一个区域的低板亲本等位基因纯合子的个体在我们家中没有代表性，而在这两个区域的所有低板亲代等位基因纯合的个体都具有低侧板表型。这些数据提出了两个有趣的假设。这两个区域的基因座之间的上位性相互作用可能导致合成致死性，从而导致表型的遗传模式看起来类似于单个孟德尔基因座。在完整的平板鱼而不是低平板鱼中出现重组事件表明，这两个区域在遗传上是分离的，合成致死性阻碍了低平板鱼重组体的恢复。或者，这些种群有一个染色体重排，而实际上这两个集群非常接近。虽然必须进行后续工作，以进一步研究新确定区域的遗传性质以及它在其他杂交和种群中的重要性，但我们的结果确实证明了这项技术有能力促成更多的生物学发现，即使是在显然很了解的生物学问题上。
从绘图研究一开始就能够对大量标记进行评分，这为刺鱼性状的遗传分析提供了几个明显的优势。与现有微卫星标记密度相比，RAD标记密度的数量级更高，有助于发现侧板区域的复杂遗传模式。即使在整个基因组中有更多的微卫星标记可用，但需要逐个标记进行分析，这意味着初始筛选将涉及这些标记的子集。随后的微卫星基因分型工作将只集中在基因组的一个区域，可能会模糊其他的遗传关联。此外，RAD分析初始阶段可用的高密度标记为在自然群体中进行全基因组扫描提供了可能性，以识别最近衍生群体中的选择特征，或将表型与分离表型的群体中的特定标记相关联。最后，该技术的成本效益将允许在许多具有类似性状的种群中进行遗传分析，为量化棘背鱼的平行表型进化在多大程度上基于发育遗传途径的平行进化提供了重要数据。
结论
长期以来，对性状遗传基础感兴趣的生物学家一直局限于对一小部分特定生物体的深入研究。由于缺乏遗传工具，对许多物种知之甚少，其中最重要的是一个有效的基因分型平台。本文描述的RAD技术并不是针对粘蝇甚至果蝇的，但可以用于大多数模式生物和非模式生物的遗传分析。生物种类繁多，可用于解决各种各样的生物问题，这种方法提供了将快速、高分辨率基因分型应用于最适合特定生物问题的生物的能力。
方法
限制性相关DNA（RAD）标签分离
基因组DNA（2μg）在37°C下用40单位（U）的EcoRI（新英格兰生物实验室[NEB]）在100μL反应中消化2小时。样品用苯酚/氯仿萃取并沉淀。用TE将样品体积增加到200μL，并用等量的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Sigma）萃取，然后用氯仿：异戊醇（24:1）（Simma）萃取。样品在40μg糖原（发酵剂）、0.3 M NaOAC和2.5体积的乙醇存在下沉淀。将颗粒重新悬浮在10μL的连接混合物1中（1×T4 DNA连接酶反应缓冲液[NEB]，1μM生物素化EcoRI连接剂：5′-Bio-TTCGACGCGCATCTGGA CAGG-3′，5′-Phos-AATTCCTGTCCAGATGGAGCGTC-3′；集成DNA技术）。在添加酶之前，样品在50°C下加热2分钟，并在室温下冷却10分钟。然后向每个样品中添加100单位的T4 DNA连接酶（高浓度，NEB），并在16°C下培养样品1.5小时。如上所述，用苯酚/氯仿萃取样品。现在加入生物素连接剂后，使用Branson声波仪450（占空比80，输出1.2）随机剪切样品，20个脉冲，然后快速旋转，在冰上停留1分钟，再增加20个脉冲。这种超声处理方案产生的DNA片段主要为250–500 bp长。然后按照上述方法沉淀样品，并将颗粒重新悬浮在100μL TE中。直接侧翼EcoR1限制位点的DNA现已纯化。根据制造商的方案制备了50微升Dynabeads M-280链霉亲和素（Invitrogen）。将片段DNA添加到混合珠中，并在室温下孵育20分钟，间歇混合。将珠子固定，并去除上清液。用200μL的结合和洗涤缓冲液（5 mM Tris，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）洗涤珠子三次，然后用200μL TE洗涤一次。将珠子固定化，去除上清液，并将珠子重悬于100μL的1×NEBuffer EcoR1和40U的EcoRI（NEB）中，以释放纯化的DNA。样品在37°C下孵育1小时，间歇混合。为了回收纯化的DNA，将珠固定，并将上清液转移到新的试管中。用苯酚/氯仿萃取样品并如上所述沉淀，然后将颗粒重新悬浮在20μL TE中。这些RAD-tag样品通过凝胶电泳进行分析。我们估计，通常从每个样本中分离出约50 ng RAD-tag DNA。XhoI RAD-tag隔离如上文所述，并进行了以下修改：（1）使用XhoI（NEB）；（2） 连接混合物1含有生物素化XhoI连接物（5′-Bio-TTTCG CTCGCATGGACAGC-3′，5′-Phos-TCGGCTGTCCAGATGGCGCGTCG-3′），用于替代生物素化EcoRI连接物。
荧光标记和杂交
在加入荧光染料之前，对RAD-tag样品进行扩增。约5 ng RAD标签样品在25°C下与1 U Klenow片段（NEB）在50μL反应中最终修复15分钟。如上所述，用苯酚/氯仿提取样品并沉淀，并将颗粒重悬于10μL连接混合物2（1×T4 DNA连接酶反应缓冲液[NEB]，1μM钝端接头A:5′-GCGGGTGACCCGGGAGATCT GAATTC-3′，5′-Phos-GAATTCAGATC-3′）中。向每个样品中添加100单位的T4 DNA连接酶（高浓度，NEB），并在16°C下培养样品1.5小时。样品在65°C下热失活10分钟。五微升结扎样品用作PCR模板。PCR反应在含有以下物质的100μL体积中进行：模板（如所述）、1×嗜热缓冲液（NEB）、5 U taq（NEB，0.2μM 5′-GCGGGACCGATCTGAATTC-3′和0.2 mM dNTPs（发酵剂）。热循环条件包括：55°C 2 min，72°C 5 min，94°C 5 min.，18–22个循环（94°C 1 min，55°C 1 min.，72°C 1 min），72°C5 min。扩增产物用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。使用Bioprime plus阵列CGH基因组标记系统（Invitrogen），250毫微克扩增的RAD-tag样品用作荧光核苷酸（Alexa Fluor 555或647）的随机-基于时间的掺入模板。标记反应是根据制造商的协议进行的，并进行了以下修改：（1）使用了半尺寸反应。（2） 在37°C条件下，孵化时间增加至>4小时。（3） 在淬灭反应后，将两个直接竞争杂交的标记反应合并并通过一个纯化柱纯化。将纯化的样品干燥并重新悬浮在42μL微阵列杂交缓冲液中（50%甲酰胺，5×SSC，1%十二烷基硫酸钠，1μg/μL小牛胸腺DNA[Invitrogen]）。杂交样品在95°C下变性5分钟，并在24×60-mm m系列举重滑片下杂交到微阵列（伊利科学公司）。将微阵列放入用20μL蒸馏H制备的微阵列杂交室（Corning）中2每端O，以保持恒定湿度。将培养箱在42°C下培养12–16小时。培养后，将载玻片分别置于1×SSC、0.05%SDS、0.2×SSC和0.05×SSC中清洗5分钟，并通过离心干燥。使用GenePix 4000a微阵列扫描仪（Axon Instruments）立即扫描阵列，生成Alexa Fluor 555和647信号强度的图像。
丰富的RAD库制作
为了制备驾驶员样品，在25°C下，在50μL与1 U Klenow片段（NEB）的反应中，对～5 ng RAD标签样品进行15分钟的最终修复。用苯酚/氯仿萃取样品并如上所述沉淀，将小球重新悬浮在10μL连接混合物3中（1×T4 DNA连接酶反应缓冲液[NEB]，1μM钝端连接剂B:5′Bio-GCGGGAGATCTGAATTC-3′，5′-Phos-GAATCAGATC-3′）。将100个单位的T4 DNA连接酶（高浓度，NEB）添加到每个样品中，并将样品在16°C下孵育1.5小时。样品在65°C下热失活10分钟。五微升结扎样品用作PCR模板。PCR反应在含有以下物质的100μL体积中进行：所述模板、1×Thermopol缓冲液（NEB）、5 U Taq（NEB，0.2μM 5′-Bio-GCGGTGACCGGAGATCTGAATTC-3′和0.2 mM dNTP（发酵剂）。热循环条件包括：55℃2 min，72℃5 min，94℃5 min、24个循环（94℃1 min，55℃1 min、72℃1 min），72℃5min。扩增产物用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。
为了制备测试样品，在25°C下与1 U Klenow片段（NEB）在50μL反应中对～5 ng RAD-tag样品进行15分钟的最终修复。用苯酚/氯仿萃取样品并如上所述沉淀，然后再悬浮在10μL的连接混合物4中（1×T4 DNA连接酶反应缓冲液[NEB]，1μM钝端连接剂C:5′-CTGCTGAA TTCAAGCTT-3′，5′-Phos-AGAGCTTGAATTCGAGT CAG-3′）。将100个单位的T4 DNA连接酶（高浓度，NEB）添加到每个样品中，并将样品在16°C下孵育1.5小时。样品在65°C下热失活10分钟。五微升结扎样品用作PCR模板。PCR反应在含有以下物质的50μL体积中进行：所述模板，1×PCR缓冲液-Mg（Invitrogen），1.5 mM MgCl2、2.5 U铂taq（Invitrogen）、0.2μM 5′-CTGCTGAATTCAAGCTTCT-3′和0.2 mM dNTPs（发酵剂）。热循环条件包括：94℃2 min、20个循环（94℃1 min、55℃1 min和72℃1 min）、72℃5 min。扩增产物用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。
遵循减法杂交条件Sive和St John（1988）经过以下修改：（1）使用100 ng测试仪和2μg驱动器，并在乙醇沉淀（发酵剂）之前添加10μg糖原。（2） 将杂交转移到HB-SDS后，将这些样品与三种100μL Dynabeads M-280链霉亲和素（Invitrogen）的变化孵育15分钟，以去除驱动分子和杂交分子。进行了两轮减法。沉淀减去的测试样品，并将颗粒重悬在20μL的TE中。在PCR反应中使用5微升样品作为模板。所用的引物和反应条件与制备测试DNA所述的相同。扩增产物用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。这种减法的乘积称为富集RAD-tag样本。
微阵列生产
使用TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen）克隆了50纳克富集的RAD标签样品。将克隆挑选到96个培养皿中，每个培养皿中含有125μL LB+卡那霉素，并在37°C下培养6小时。用384孔板从这些克隆样品中制备15%的甘油储备。其中一微升用作PCR模板。PCR反应在含有以下物质的50μL体积中进行：所述模板、50 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM Tris（pH 8.3）、0.1%Triton X-100、2%DMSO、0.2μM 5′-CTGCTGAATTCAAGCTTCT-3′、0.1 mM dNTPs（发酵剂）和1.25 U Taq（NEB）。热循环条件包括：94°C 5分钟，44个循环（94°C 1分钟，62°C 1 min，72°C 80秒）和72°C 5 min。将PCR产物转移到384孔微阵列印刷板中，干燥，并在室温下密封储存。打印前，将样品重新悬浮在10μL打印缓冲液（3×SSC，1.5 M甜菜碱）中。样品排列在GAPSII微阵列载玻片上（Corning）。然后将印版密封并储存在−80°C下。印刷后，将载玻片暴露于300 mJ UV下，并在室温下存放在干燥剂中。在杂交之前，将载玻片在50%甲酰胺、5×SSC、1%SDS、1 mg/mL BSA中在42°C下预杂交1 h，并处理以降低背景(Raghavachari等人，2003年). 将载玻片立即放入“刚煮沸”的蒸馏H中2O搅拌2分钟，并通过离心进行干燥。
鱼类协议
用于制作阵列的鱼来自阿拉斯加马塔努斯卡-苏西特纳区野生脊索鱼的采集线。一个系来自淡水种群（熊爪湖；N61.6139，W149.7529），另一个系来源于溯河产卵种群兔子沼泽（N61.5595，W149.2583）。使用一条熊爪湖衍生鱼BP（750.00.0001）和一条兔泥鳅衍生鱼RS（612.00.0001）制作阵列（参见Cresko等人，2004年更多信息）。这个F类2映射分析中使用的鱼是两个之间的完全同胞杂交的后代F类1个人。这些F类1它们的父母是由兔泥鳅和另一淡水种群泥湖（N61.5625，W148.9486）的鱼杂交而成的。与熊爪湖的棘鱼相似，泥湖棘鱼始终表现出较低的侧板表型。按照中所述进行杂交和饲养Cresko等人（2004）使用DNeasy Tissue Kit（Qiagen）从活鱼个体的胸鳍夹中分离基因组DNA。表型分析，包括骨准备和评分，按照Cresko等人（2004）.
