美国国家科学院院刊。2007年1月30日；104(5): 1604–1609.
巨噬细胞炎症反应期间诱导MicroRNA-155
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瑞安·M·奥康奈尔
*加利福尼亚理工学院生物系，330 Braun，1200 East California Boulevard，Pasadena，CA 91125；和
康斯坦丁·塔加诺夫
*加利福尼亚理工学院生物系，330 Braun，1200 East California Boulevard，Pasadena，CA 91125；和
马克·波丁
*加利福尼亚理工学院生物系，330 Braun，1200 East California Boulevard，Pasadena，CA 91125；和
程根宏（Genhong Cheng）
†加利福尼亚大学微生物、免疫学和分子遗传学系，加利福尼亚州洛杉矶Charles East Young Drive South 650号，邮编：90095
大卫·巴尔的摩
*加利福尼亚理工学院生物系，330 Braun，1200 East California Boulevard，Pasadena，CA 91125；和
*加利福尼亚理工学院生物系，330 Braun，1200 East California Boulevard，Pasadena，CA 91125；和
†加利福尼亚大学微生物、免疫学和分子遗传学系，加利福尼亚州洛杉矶Charles East Young Drive South 650号，邮编：90095
David Baltimore撰稿，2006年12月4日
.作者贡献：R.M.O.和K.D.T.设计的研究；R.M.O.和K.D.T.进行了研究；R.M.O.、M.P.B.、G.C.和D.B.贡献了新的试剂/分析工具；R.M.O.、K.D.T.、M.P.B.、G.C.和D.B.分析数据；R.M.O.和D.B.写了这篇论文。
- 补充资料
配套图
GUID:BF0DBA14-2D7D-4FBA-A6C4-7BD8C1743D21
指南：5FCEA342-878E-4A83-BF5E-fa5a8fa689e
摘要
哺乳动物对感染的炎症反应涉及数百个基因的诱导，这一过程必须经过仔细的调控，才能清除病原体，并防止不受调控表达的后果，如癌症。最近，microRNAs（miRNAs）已成为一类与癌症相关的基因表达调控因子。然而，炎症、先天免疫和miRNA表达之间的关系才刚刚开始探索。在本研究中，我们使用微阵列技术鉴定暴露于聚核糖核酸酶：聚核糖胞苷酸或细胞因子IFN-β后在小鼠原代巨噬细胞中诱导的miRNAs。miR-155是受试者中唯一被两种刺激显著上调的miRNA。一些Toll样受体配体也通过髓样分化因子88或TRIF依赖性途径诱导其表达，而IFN的上调被证明涉及TNF-α自分泌信号。激酶JNK的药理学抑制阻断了miR-155对多核糖肌苷：多核糖胞苷酸或TNF-α的诱导，表明miR-155-诱导信号使用JNK途径。总之，这些发现表明miR-155是广泛炎症介质的共同靶点。重要的是，由于已知miR-155具有致癌基因的功能，这些观察结果确定了炎症和癌症之间的潜在联系。
关键词：癌症、炎症、先天免疫、细胞因子
哺乳动物的先天免疫反应为抵御病原体提供了关键的第一道防线。微生物配体的检测是通过模式识别受体实现的，例如巨噬细胞和树突状细胞上高水平表达的Toll样受体（TLR）(1). TLR在进化上从果蝇属已知约11个哺乳动物TLR，可识别微生物世界中保存的广泛不同化学结构(2). 病原体识别后，TLRs通过髓细胞分化因子88（MyD88）家族的衔接蛋白发出信号，激活几个下游信号转导途径，如NF-κB、MAPKs和IRF家族成员(三). 激活后，这些通路协调几个功能不同的基因亚群的上调(4)通过转录和转录后机制(5). 这些基因编码的蛋白质，如细胞因子IFN-β、IFN-γ和TNF-α，旨在启动微生物清除。然而，在病理情况下，这些细胞因子及其激活的途径也可能在癌症和自身免疫等疾病中发挥作用(6–8). 虽然已经对这种感染的“炎症”反应进行了详细的研究，但这个复杂系统的几个调节方面仍需要进一步的识别和理解。
哺乳动物microRNAs（miRNAs）是一种非编码RNA寡核苷酸，在进化过程中高度保守，最近成为基因表达的有力调节器(9). 大约500个编码miRNAs的基因已经在哺乳动物中被鉴定出来，并被证明在时间和空间上都受到调控。miRNAs由RNA聚合酶II转录，作为初级转录物的一部分(10,11)由Drosha和DGCR8加工成较小的RNA分子，然后由Exportin 5从细胞核输出(12,13). 在到达细胞质后，初级miRNA经过Dicer的进一步处理，随后被装载到RISC复合体上(14). 一旦成熟，miRNAs特异性地与靶细胞mRNAs的3′UTR结合，导致mRNA降解或翻译抑制(9).
从功能上讲，哺乳动物的miRNAs在不同组织的细胞发育和分化中起着关键作用(15). 因此，miRNA水平失调与包括结肠癌、乳腺癌和肺癌在内的几种恶性肿瘤有关(16–18). 血源性细胞也表达某些驱动其发育的miRNAs(19,20)在白细胞衍生的肿瘤中发现了miRNA表达的改变，包括儿童Burkitt淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病(16,17). 尽管有这些观察结果，目前尚不清楚白细胞中miRNA的表达在细胞转化开始时是如何改变的。
由于炎症刺激对基因表达的深刻影响，先天免疫反应具有调节miRNA水平的潜力。最近，我们小组使用微阵列技术来确定TLR4配体脂多糖（LPS）是否可以影响人类THP-1单核细胞中miRNA的表达(21). 三种miRNA上调，包括miR-132、miR-146和miR-155。miR-146的进一步表征表明，它受NF-κB调节，可能作为IRAK1和TRAF6表达的负调控因子。这些发现表明，miRNAs水平可以被细菌内毒素改变，并可能参与调节先天性免疫反应。
为了测试病毒相关刺激是否诱导特异性miRNAs的表达，我们扩展了我们的微阵列研究。miR-155被鉴定为多核糖肌苷：多核糖胞苷酸[poly（I:C）]和IFN-β的特异性靶标。进一步研究表明，一些TLR配体通过MyD88或TRIF信号通路增加miR-155的表达，而IFN需要TNF-α自分泌信号通路来上调miR-155。抑制JNK可阻断poly（I:C）和TNF-α对miR-155的诱导，表明MAPK信号在miR--155水平的调节中发挥作用。我们的发现揭示了miR-155是炎症反应的一个组成部分，并表明这种致癌miRNA可能被证明是炎症和癌症之间的联系。
结果
我们的观察始于对microRNA阵列进行筛选，以确定巨噬细胞对与病毒感染相关的刺激作出反应时上调的microRNA。巨噬细胞从小鼠骨髓中成熟，并用合成病毒中间体poly（I:C）（双链RNA）或宿主抗病毒反应细胞因子IFN-β刺激。在治疗6小时后，提取总RNA并用于测定200种成熟形式的独特小鼠和人类miRNA的表达水平。miR-155被鉴定为唯一由poly（I:C）和IFN-β显著诱导的miRNA(A类)，这是基于使用P（P）值0.01作为显著性的临界值。为了确认miR-155诱导的有效性，将用于微阵列的一部分RNA转化为cDNA并进行定量PCR（qPCR）。与微阵列结果一致，miR-155由poly（I:C）和IFN-β强烈诱导，Northern印迹证实了这一结果(B类). 受这些刺激，小核RNA U6相对不变(C类)而poly（I:C）和IFN-β靶基因IP10是由这两者诱导的(C类). 实验产生的一些巨噬细胞也被抗原特异性抗体染色，并通过FACS分析，以检测巨噬细胞标记CD11b以及刺激24小时后多聚（I:C）和干扰素-β靶基因CD86的上调(天). 这些数据表明，巨噬细胞通过强烈上调miR-155来对病毒信号作出反应，miR-155是一种从其他研究中已知具有致癌基因功能的miRNA(17,18,22–25).
巨噬细胞抗病毒反应期间诱导的miRNAs的微阵列分析。(A类)用培养基（m）、2μg/ml poly（I:C）[p（I:C]或1000单位/ml IFN-β刺激WT小鼠巨噬细胞6小时。提取RNA并用于进行微阵列分析，以确定200个哺乳动物miRNAs的表达水平。数据显示在显示对数的散点图上10-Cy3-标记的介质对照和用Cy5-标记的IFN-β刺激的样品的两个通道上每个探针的转换信号强度(左侧)或聚（I:C）(赖特). (B类)RNA用于A类通过qPCR分析miR-155的表达，并在相同条件下通过Northern blot分析进行单独实验。(C类)RNA用于A类通过qPCR检测小核RNA U6的表达，作为负荷控制或IP10 mRNA的表达，以确保poly（I:C）和IFN-β的等效刺激。(天)巨噬细胞的一部分产生于A类分别用培养基、poly（I:C）或IFN-β刺激，并使用FACS检测CD11b和CD86的表达，以确保适当的巨噬细胞发育和激活。
miR-155存在于BIC基因中(17)人类21号染色体和小鼠16号染色体(26). 人类BIC的基因组结构由三个外显子组成，其转录物通过选择性聚腺苷酸化被转录并加工成两个大小不同的mRNA分子。然而，BIC缺乏大ORF，因此不太可能编码蛋白质。相反，它的唯一功能可能是产生编码在外显子3内的miR-155(A类). 为了监测miR-155诱导的动力学，在poly（I:C）或IFN-β刺激原代巨噬细胞后的48小时内，检测BIC mRNA和成熟miR-155。作为对poly（I:C）的反应，BIC mRNA在2小时后可检测到，在8小时后仍升高，并且在刺激后24和48小时仍呈降低水平(B类). 聚（I:C）诱导miR-155的表达模式与BIC相似，但在24小时和48小时时仍保持最高水平(C类). 干扰素-β在2小时内未诱导BIC mRNA，但在8小时内检测到，在24和48小时内几乎检测不到(B类). miR-155的IFN-β诱导遵循与BIC相同的延迟诱导模式，在8小时达到最高水平，刺激后24和48小时缓慢下降(C类). 这些发现提供了证据，证明miR-155水平的调节涉及poly（I:C）或IFN-β对BIC mRNA的上调。此外，miR-155是poly（I:C）诱导信号传导的直接早期靶基因，而其诱导在IFN-β刺激下游相对延迟。
聚（I:C）和干扰素-β诱导BIC mRNA和成熟miR-155的动力学。(A类)人类BIC非编码RNA基因基因组结构的无标度描述以及miR-155（155）在外显子3中的位置。E、 外显子；一、 内含子。(B类)在用2μg/ml poly（I:C）或1000单位/ml IFN-β刺激后，用寡核苷酸dT引物逆转录，然后用PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，分析48小时内巨噬细胞BIC mRNA的表达。引物设计用于靶向miR-155以外的BIC序列。L32 mRNA检测作为对照。(C类)RNA来自B类也用于通过qPCR在48小时内检测成熟miR-155。
TLR3是poly（I:C）的受体(27). 因此，对其他TLR配体进行了测试，以确定它们是否也能诱导miR-155。用任一聚（I:C）刺激巨噬细胞；LPS，通过TLR4发出信号(28,29); 低甲基化DNA（CpG），TLR9配体(30); 或Pam3CSK4，一种激活TLR2的合成脂蛋白(31). 6小时后，从这些细胞中提取RNA并通过Northern印迹分析(A类)或将相同的RNA转换为cDNA并通过qPCR进行分析（数据未显示）以确定miR-155水平。所有四种TLR配体均诱导miR-155的强表达，而在单独使用培养基处理的细胞中，Northern印迹法未检测到miR-155(A类). 因此，已知能够识别病毒和其他病原体的病原体相关分子模式的TLR可以强烈诱导miR-155。
TLR通过MyD88或TRIF依赖的信号通路诱导miR-155表达。(A类)用培养基（m）、2μg/ml poly（I:C）[p（I:C]、5 ng/ml LPS、2μg/ml Pam3CSK4（P3C）或100 nM CpG刺激WT（WT）小鼠巨噬细胞6 h，并用miR-155特异性探针进行Northern blot分析。(B类)WT、MyD88−/−，或TRIF−/−用培养基、poly（I:C）、LPS、CpG或Pam3CSK4刺激巨噬细胞6 h，用qPCR检测miR-155的表达。(C类)WT或IFNAR−/−用培养基、poly（I:C）、LPS、CpG或Pam3CSK4刺激巨噬细胞6 h，用qPCR检测miR-155的表达。
TLR信号通过MyD88衔接蛋白家族传递(三). 在这些适配器中，已知TLR2和TLR9信号需要MyD88，而TLR3使用TRIF。适配器也可以发挥部分冗余作用；例如，TLR4通过MyD88或TRIF发出信号(三). 为了测试这些适配器对miR-155的TLR诱导的需求，用不同的TLR配体刺激TRIF或MyD88缺陷的巨噬细胞，6小时后用qPCR检测miR-155.经CpG（TLR9）或Pam3CSK4（TLR2）处理的巨噬细胞需要MyD88而不是TRIF来诱导miR-155，而poly（I:C）（TLR3）需要TRIF，但不是MyD88(B类). TLR4在缺乏任一单个衔接子的情况下上调miR-155(B类). 这些结果证实了所用TLR配体的特异性，并证明MyD88或TRIF依赖的信号通路足以诱导miR-155。
TLR应答基因的一个子集需要IFN-β自分泌/旁分泌信号进行诱导(4). 由于miR-155同时受到TLR和IFN-β的上调，我们测试了是否需要IFN-β自分泌/旁分泌信号传导来诱导miR-155的TLR。然而，WT和IFNAR−/−qPCR检测巨噬细胞对poly（I:C）、LPS、CpG或Pam3CSK4的反应增加了miR-155的表达(C类). 这些数据表明，TLR不需要产生IFN-β来早期上调miR-155。
与干扰素β类似，干扰素γ在病毒和细菌感染时产生，并在巨噬细胞活化中发挥重要作用(32). IFN-γ刺激6小时后也在巨噬细胞中诱导miR-155(A左边). 由于与poly（I:C）相比，IFN对BIC mRNA和成熟miR-155的诱导延迟，因此IFN可能使用蛋白质中间产物上调miR-155。我们注意到最近的一项研究确定了IFN-γ刺激巨噬细胞后TNF-α自分泌/旁分泌信号的作用(33). 使用TNFR1−/−巨噬细胞，我们发现在没有TNFR1信号传导的情况下，与在WT细胞中观察到的诱导相比，IFN-β和IFN-γ不能上调miR-155(A左边). 此外，TNF-α足以以TNFR1依赖的方式诱导miR-155的表达(A正确)并且诱导miR-155的动力学比IFN-β更快[支持信息（SI）图6]. 此外，IFN-β和IFN-γ均诱导TNF-αmRNA表达(B左侧)而IFN-β诱导的IP10在TNFR1中保持不变−/−巨噬细胞(B右侧)表明这些细胞仍能对干扰素治疗产生反应。最后，poly（I:C）诱导TNF-α表达(C左)，该TLR3配体在刺激后6小时内不需要TNF-α自分泌信号来诱导miR-155(C右). 总之，这些发现确定TNF-α是miR-155的诱导剂，并表明IFN需要TNF-β自分泌/旁分泌信号来上调巨噬细胞中的miR-155。
干扰素通过TNF-α自分泌/旁分泌信号诱导miR-155表达。(A类)重量（WT）和TNFR1−/−用培养基（m）、1000单位/ml IFN-β、50 ng/ml IFN-γ或10 ng/ml TNF-α刺激小鼠巨噬细胞6 h，用qPCR检测miR-155。(B类) (左侧)用培养基、IFN-β或IFN-γ刺激WT巨噬细胞6 h，用qPCR分析TNF-αmRNA。(赖特)WT和TNFR1−/−用干扰素-β刺激巨噬细胞6小时，并通过qPCR检测IP10 mRNA的表达。(C类) (左侧)用培养基或2μg/ml poly（I:C）刺激WT巨噬细胞6 h，并通过qPCR检测TNF-α的表达。(赖特)WT和TNFR1−/−用培养基或poly（I:C）刺激巨噬细胞6小时，并通过qPCR测定miR-155。
为了确定参与miR-155诱导的下游信号通路，我们进行了启动子序列分析，以确定BIC基因启动子区域内的转录因子结合位点，这些位点在小鼠和人类之间是保守的。从转录起始位点上游延伸约75 bp的区域在小鼠和人类之间显示约85%的序列同源性，并包含AP-1的两个共识结合序列（数据未显示）。已知该转录复合物被炎症刺激激活，如TLR配体和TNF-α，并需要JNK的信号传导(1). 为了测试JNK通路是否参与miR-155诱导，我们刺激了用JNK抑制剂（sp600125）和poly（I:C）或TNF-α处理过的巨噬细胞4小时。刺激后4小时，经车载处理的细胞上调miR 155水平，而JNK抑制剂以剂量依赖的方式阻断了两种刺激对miR-155的诱导(). 作为对照，ERK抑制剂uo126没有减少miR-155的聚（I:C）诱导（数据未显示）。这些发现表明，JNK通路参与上调miR-155表达，以响应poly（I:C）或TNF-α。
JNK的药理抑制阻断了poly（I:C）和TNF-α对miR-155的诱导作用。用5或25μg/ml的二甲基亚砜或sp600125预处理WT小鼠巨噬细胞30分钟，随后在载体或抑制剂存在的情况下用培养基、2μg/ml聚（I:C）或10ng/ml TNF-α刺激。4h后收集RNA，用qPCR检测miR-155的表达。
讨论
miRNA水平的失调与多种癌症有关，包括那些涉及白细胞的癌症。然而，环境因素（如炎症配体）改变miRNA表达的能力才刚刚开始探索。我们的微阵列筛选确定miR-155是我们测试的200个miRNA中唯一由poly（I:C）和IFN-β诱导的miRNA。除poly（I:C）外，其他TLR配体通过MyD88-或TRIF-依赖性信号通路诱导miR-155，细胞因子IFN-β和IFN-γ通过TNF-α自分泌/旁分泌信号通路诱导。因此，我们的研究确定并表征了miR-155是主要巨噬细胞对不同类型炎症介质反应的一个组成部分，扩大了我们最初的观察，即在人类THP-1单核细胞中由LPS诱导miR-155(21). 因为miR-155是已知的致癌基因(17,18,22–25)这些发现对先天免疫和癌症生物学都有启示。
尽管TLRs诱导miR-155作为一个即刻早期基因，但由于需要TNF-α自分泌/旁分泌信号，IFN诱导miR--155的作用较弱，并且表现出延迟动力学。最近有人描述了这种信号环路的存在，当时有研究表明TNFR1是IFN-γ诱导巨噬细胞一氧化氮所必需的(33). 这种系统使干扰素能够诱导TNF-α靶基因，包括miR-155，以及已建立的干扰素应答基因(34). 尽管目前尚不清楚该途径是否也与巨噬细胞以外的其他细胞类型相关(35)，它强调了暴露于传染性病原体后反应的细胞因子网络的复杂性。
众所周知，干扰素系统在感染后为所有有核细胞提供抗病毒能力(34). 尽管在这种反应中诱导的蛋白编码基因已经被很好地研究过，但miRNAs的参与还没有被研究过。有趣的是，我们的microRNA阵列筛选仅将miR-155确定为巨噬细胞中IFN-β信号的重要靶点。如前所述，诱导需要TNF-α自分泌/旁分泌信号。这些观察结果表明，miRNAs可能不是已知的典型JAK/STAT通路的直接靶点，该通路可对数百个抗病毒基因进行IFN信号转导。然而，尽管我们的屏幕上包含了200个独特的miRNA，但目前在miRNA注册库中有近500个miRNA，还有许多需要测试。还可能有一部分被分析的miRNAs在RNA处理水平上受到调节，因此，它们的成熟形式没有被检测到。最近在大脑中观察到miR-138的这种现象(36). 这种情况可能需要额外的信号来激活处理，并且可能仅在感染活的完整病原体时发生。
重要的是要确定哪些与免疫相关的宿主mRNA受到miR-155的调节，或者miR-155是否可以直接靶向病毒基因组或转录物，正如miR-32所做的那样(37). 迄今为止，miR-155的唯一特征性靶点是成纤维细胞中的血管紧张素II I型受体(38). 除了miR-155外，我们之前还发现，暴露于LPS后，人类THP-1单核细胞中的miR-146和miR-132水平较高(21). miR-146的进一步表征表明，它可以减弱固有信号蛋白IRAK1和TRAF6的表达，从而确定miR-146在TLR信号传递过程中可能的调节作用。虽然明确定义miR-155以及髓系细胞中表达的其他miRNAs的生理作用仍然是一项未完成的任务，但这些发现提供了证据，证明miRNAss是感染性病原体诱导的抗菌基因程序的一部分。
我们的数据表明，激活AP-1复合物的JNK途径参与了TLRs和TNF-α对miR-155的诱导，可能是通过编码BIC基因的miR-155的转录激活。尽管BIC的人类和小鼠启动子区域在转录起始位点附近都含有AP-1的结合位点，但在上游还有一些NF-κB家族成员的推测结合位点（参考文献。39以及我们未发布的数据）。然而，NF-κB在上调miR-155水平中的作用尚不清楚。一组研究报告称，IκBα显性活性蛋白的过度表达不会阻止BCR介导的Ramos B细胞中BIC的诱导(39)而另一项基因芯片研究发现，对具有组成活性NF-κB的淋巴瘤细胞施用IKK抑制剂后，BIC转录物减少(40). JNK和NF-κB都参与了肿瘤的发生(41,42)miR-155可能是这些转录因子在此过程中的重要靶点。
miRNAs和微生物诱导的炎症都与癌症有关(8,16). 我们目前的研究结果表明miR-155可能是两者之间的联系。编码miR-155的基因BIC最初被鉴定为鸡白细胞病病毒在诱导B细胞淋巴瘤过程中常见的逆转录病毒整合位点，表现出高BIC表达(22,25). miR-155在人类B细胞淋巴瘤和其他肿瘤中也有高水平表达(17,18,24,39,43)而小鼠B细胞中miR-155的强制过度表达足以触发小鼠B细胞淋巴瘤(23). 这些数据表明，miR-155的不当表达会促进癌症，因此了解miR-155的水平是如何调节的很重要。虽然我们表明，广泛的炎症介质可以在巨噬细胞和单核细胞中诱导miR-155，但已知B和T淋巴细胞在BCR或TCR激活后分别上调miR-155(39,44). 与巨噬细胞一样，B和T细胞也表达多种TLR，这些TLR可以诱导miR-155的表达，并有助于生理和病理反应。此外，确定miR-155是否也参与了髓细胞衍生的癌症，如急性髓细胞白血病，将是一个有趣的问题。
本研究发现，miR-155的上调是由于暴露于广泛的炎症介质所致，强调避免致癌转化是需要快速解决炎症反应的关键理由。
材料和方法
细胞培养和试剂。
如前所述，从小鼠胫骨和股骨分离骨髓细胞(4). 简而言之，使用红细胞裂解缓冲液（加利福尼亚州圣地亚哥Invitrogen）对红细胞进行裂解，将剩余的骨髓细胞置于含有10%FBS、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素的DMEM中，并以先前确定的浓度补充巨噬细胞集落刺激因子调节培养基。细胞在含有5%CO的加湿培养箱中培养237°C时。培养7天后，用特定抗体对部分巨噬细胞进行染色，并用FACS进行分析，以确保正确分化（CD11b+80层/四层+CD11c公司−)并随后用于实验。使用含有以下物质之一的新鲜DMEM刺激初级巨噬细胞：5 ng/ml 055-B5 LPS（西格玛，密苏里州圣路易斯）、100 nM CpG 1668寡核苷酸（Invitrogen）、2μg/ml Pam3CSK4（Invit罗gen），2μg/ml poly（I:C）（新泽西州皮斯卡塔韦阿默沙姆制药公司）、1000单位/ml mIFN-β（明尼阿波利斯研发系统公司）、，50 ng/ml mIFN-γ（加利福尼亚州圣地亚哥Ebioscience）或10 ng/ml m TNF-α（瑞士巴塞尔罗氏）。将化学抑制剂sp600125和uo126溶解在二甲基亚砜中，并以不同浓度使用（加利福尼亚州拉霍亚Calbiochem）。
老鼠。
WT、MyD88−/−、TRIF−/−、IFNAR−/−，和TNFR1−/−所有小鼠均具有C57BL/6基因背景，在加利福尼亚大学实验动物医学部设施中繁殖和饲养，并根据动物研究委员会批准的既定方案进行捕杀。
微阵列分析。
微阵列筛选程序与所述相同(21). 使用mirVana RNA分离试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）收集来自受刺激巨噬细胞的RNA；对30μg小RNA进行富集，使用mirVana miRNA标记试剂盒（Ambion）进行追踪，并用Cy3（对照样品）或Cy5（刺激样品）荧光染料进行标记（Amersham Pharmacia）。接下来将受刺激样品和对照样品混合，并用miRNA阵列载玻片孵育14小时。环氧涂层载玻片（斯科特-奈克斯特里翁，路易斯维尔，肯塔基州）采用机器人技术制备成一式四份，用于检测200个与不同哺乳动物miRNA互补的小鼠和人类序列（mirVana miRNA探针组；Ambion）。杂交后，使用Gene Pix 5.0软件（Axon Instruments）用GenePix 4200A扫描仪（加利福尼亚州福斯特市Axon仪器公司）扫描微阵列。将原始数据导入Resolver基因表达数据分析系统4.0版（西澳大利亚州西雅图Rosetta Biosoftware）进行进一步处理。
信使RNA检测。
使用TRIzol试剂（Invitrogen）从骨髓源性巨噬细胞中获取总RNA，并根据制造商的协议使用iScript（Invit罗gen）将1μg总RNA转化为cDNA。使用7300 real-time PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）和TNF-α、IP10和L32的基因特异性引物进行基于Sybergreen的实时qPCR(4,45). 所有qPCR数据均已归一化为L32值。为了检测BIC和L32mRNA的表达，将cDNA进行PCR，并在含有1μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上耗尽。用于检测BIC的引物序列为5′-ttggccctctctctctctct-3′（正向）和5′-gcgtgtctctctctctctctctctctctctctctctctctctcctt-3′（反向）。
微RNA检测。
为了通过Northern印迹检测miR-155，根据制造商的方案（Invitrogen）使用TRIzol试剂提取RNA。在12%聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳分离15微克总RNA，使用溴化乙锭染色观察tRNA，以确保RNA的质量和相对数量。然后将总RNA转移到GeneScreenPlus膜上（马萨诸塞州波士顿PerkinElmer）使用半干式Transblot电泳仪（加州大力士Bio-Rad）。RNA通过紫外线辐射交联到膜上。根据制造商的说明（Ambion），使用ULTRAHybOligo溶液进行杂交。探针序列与成熟型miR-155互补，并用γ标记-32P.清洗后，使用STORM磷光成像仪对膜进行成像。根据制造商的说明（Ambion），使用mirVana qRT-PCR miRNA检测试剂盒检测miR-155和U6。
流式细胞术。
为了检测CD86或CD11b的表达，用藻红蛋白结合抗CD11b或FITC-结合抗CD86（Ebiosciences，San Diego，CA）在FACS缓冲液（1×PBS/0.1%BSA/2%FBS/0.1%正常小鼠血清）中对去红细胞的脾细胞进行染色，并用多聚甲醛固定（1%最终浓度）。使用FACScan流式细胞仪（Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ）分析表面表达。
促销员分析。
使用来自Genomatix（德国慕尼黑）的启动子分析软件来鉴定BIC启动子内的假定结合位点。
致谢
我们感谢Bruce Beutler（加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所）提供TRIF突变小鼠，Shizuo Akira（日本大阪大阪大学）提供MyD88缺陷小鼠；Arash Shahangian帮助巨噬细胞培养和RNA制备；以及Jose Luis Riechmann、Vijaya Rao、Jaclyn Shingara和David Brown为微阵列工作提供帮助。这项工作得到了加州理工学院Millard和Muriel Jacobs遗传学和基因组实验室以及美国国立卫生研究院的资助。
缩写
| 微小RNA | 微小RNA |
| 液化石油气 | 脂多糖 |
| 我的D88 | 髓系分化因子88 |
| 聚（I:C） | 聚核糖肌苷聚核糖胞苷酸 |
| 定量聚合酶链式反应 | 定量PCR |
| TLR公司 | Toll样受体。 |
工具书类
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