美国国家科学院院刊。1999年8月3日；96(16): 9136–9141.
NF-κB介导的Bcl-x和Bfl-1/A1上调是B淋巴细胞CD40生存信号传导所必需的
加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心和分子生物学研究所微生物和分子遗传学系，邮编90095
*H.H.L.和H.D.对这项工作做出了同等贡献。
由加利福尼亚大学洛杉矶分校Lutz Birnbaumer传达
收稿日期：1999年5月6日；1999年6月10日接受。
摘要
激活CD40对于胸腺依赖性体液免疫反应和拯救B细胞凋亡至关重要。CD40的许多作用被认为是通过改变基因表达来实现的。除了已知的CD40调节抗凋亡分子Bcl-x外，我们还鉴定了一个相关的抗凋亡分子A1/Bfl-1为CD40诱导基因。通过过度表达NF-κB的主要活性抑制剂来抑制NFκB通路，可消除CD40诱导的Bfl-1和Bcl-x基因上调，并消除CD40拯救Fas诱导的细胞死亡的能力。在Bcl-x的上游启动子区域内，发现一个潜在的NF-κB结合序列支持NFκB依赖的转录激活。此外，在缺乏NF-κB信号的情况下，Bcl-x生理水平的表达可保护B细胞免受Fas介导的凋亡。因此，我们的结果表明CD40介导的细胞存活是通过Bcl-2家族成员的NF-κB依赖性上调进行的。
CD40是肿瘤坏死因子（TNF）受体（TNFR）超家族的50-kDa糖蛋白成员，TNFR是一个I型受体家族，有20多个已知成员，介导多种生物过程(1). 对X连锁高IgM综合征（HIGMX）、相应CD40配体（CD40L）基因的遗传缺陷以及缺乏CD40或CD40L基因的小鼠的研究表明，在T和B细胞接触期间，CD40和CD40L之间的相互作用对于胸腺依赖性抗原反应的所有事件（如Ig产生）至关重要，同种转换、体细胞超突变和B细胞记忆的诱导(2–5). 最近发表的研究表明，CD40/CD40L相互作用在T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和内皮细胞的激活中也起着重要作用(6). 然而，CD40/CD40L相互作用这些生物效应的分子机制仍有待阐明。
B细胞中CD40信号的一个重要方面是其控制凋亡的能力(7). 分离的生发中心B细胞在培养中自发发生凋亡，当用抗CD40抗体或CD40L处理时，能够长时间存活。此外，已知CD40可分别从表面IgM（sIgM）和Fas介导的凋亡中拯救未成熟B细胞（如WEHI 231细胞）和成熟B细胞(8–10).
许多研究表明，CD40的抗凋亡功能是通过上调Bcl-x的表达介导的L（左）基因，Bcl-2蛋白家族的抗凋亡成员(11–13). 该家族包括其他抗凋亡成员，如Bfl-1/A1、Mcl-1和Bcl-w，以及促凋亡成员，例如Bax、Bad、Bid和选择性剪接的Bcl-xS公司(14). 研究表明外源性Bcl-x的过度表达L（左）（以下简称Bcl-x）能够通过各种刺激，如Fas激活、sIgM交联和暴露于各种细胞死亡化学诱导物，阻止B细胞凋亡(15).
我们实验室以及其他实验室的研究已经确定，TNF受体相关因子（TRAF）适配器蛋白，尤其是TRAF 2，对于CD40信号通路的激活至关重要，如NF-κB和应激活化蛋白激酶（SAPK）通路(16). NF-κB途径激活许多相关转录因子，统称为Rel家族，包括五个哺乳动物成员：NF-κ的B1（p50）、NF-κ子B2（p52）、c-Rel、RelA（p65）和RelB(17). 这些分子通常以非活性异/同二聚体的形式存在于与抑制性IκB（NF-κB抑制剂）分子复合的细胞质中。对来自RelA-缺陷小鼠的成纤维细胞系或过度表达显性活性IκB-α突变体的细胞系的研究表明，NF-κB信号通路发挥着重要的抗凋亡作用，该功能需要蛋白质合成(18–20).
为了确定CD40信号上调的基因，我们的实验室通过代表性差异分析筛选发现，抗凋亡Bcl-2家族成员Bfl-1/A1通过CD40激活上调。与Bcl-x一起，这是已知的第二个被CD40信号上调的Bcl-2相对物。使用过度表达超表达、主要活性IκB的细胞系，可以确定NF-κB信号通路对于CD40诱导的这些抗凋亡Bcl-2家族成员的上调以及CD40介导的Fas诱导的B细胞凋亡的挽救至关重要。我们的结果还确定了Bcl-x基因启动子内的一个潜在NF-κB结合区域，该区域结合NFκB亚单位并支持NF-κ子B介导的转录，如报告基因分析所评估的那样。最后，通过使用表达不同水平外源性Bcl-x的细胞系，还表明CD40活化诱导的Bcl-x水平足以保护缺乏功能性NF-κB活性的细胞免受Fas介导的细胞死亡。因此，我们的研究通过将NF-κB信号通路的激活与抗凋亡Bcl-2家族成员的上调联系起来，在CD40介导的抗凋亡中提供了一个关键环节。
材料和方法
化学品和抗体。
用于检测Bcl-x（sc 634）和超转移检测的抗体来自圣克鲁斯生物技术公司，但抗c-Rel抗体除外，该抗体来自南希·赖斯（国家癌症研究所/弗雷德里克癌症研究与发展中心）。CH11、G28.5和抗FLAG抗体分别来自Upstate Biotechnology、American Type Culture Collection（弗吉尼亚州马纳萨斯）和Babco（加利福尼亚州里士满）。4-羟氨苄（4-OHT）购自Calbiochem。
质粒构建。
将5′-FLAG标记的IκB突变体在框架内融合到突变体雌激素受体配体结合域（ER）的5′端，并将嵌合体克隆到Hin公司dIII型/生态pCDNA3的RI位点生成pCDNA3-IκBm-ER结构。通过PCR克隆人Bcl-x产生pEBB-uro-Bcl-x-HA结构，然后将其插入巴姆HI和不是带有3′流感血凝素（HA）标签的pEBB-尿-HA框架内的I位点。对于荧光素酶分析，Bcl-x启动子的650 bp区域，相对于转录起始位点，跨越−640到+9，插入到Xho公司我和Hin公司pGL2-Basic荧光素酶载体（Promega）的dIII位点。相对于转录起始位点，NF-κB突变体启动子的内部缺失跨越了从−84到−46的两个潜在NFκB顺式元件。
细胞培养和转染。
细胞系保存在添加10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。对于电穿孔，在250 V/975μF下对细胞进行脉冲处理，然后在1 mg/ml活性G418（Mediatech，Washington DC）或2.5μg/ml嘌呤霉素（Sigma）中选择并维持细胞。293T细胞维持在补充有10%FBS的DMEM（GIBCO/BRL）中，并通过使用标准磷酸钙方法转染。
表征差异分析。
两个20×10的相同培养物6Daudi细胞，密度为5×105每毫升细胞在1μg/ml的G28.5存在或不存在的情况下培养14小时。Poly（A）+通过使用商业mRNA分离试剂盒（Pharmacia）从全细胞中提取RNA，并通过使用Superscript逆转录酶（GIBCO）产生cDNA。表征差异分析基本上如前所述(21,22). 进行两轮杂交-PCR扩增，将第二轮减法的产物克隆到pSKII Bluescript（Stratagene）中进行测序。
电泳迁移率测定。
对于凝胶位移分析，细胞按照文本所示进行处理。制备核提取物并用于与γ结合反应-32P标记MHC II NF-κB特异性发夹寡核苷酸(23)或使用γ-32使用先前发布的协议，P标记的退火正反义寡核苷酸编码Bcl-x启动子从−84到−46(24). Bcl-x探针的感测链序列为GGCGGGGACTGCCCAGGGAGTGACTTTCCGAGGAAGAGAGAG。对于超转移，在添加放射性标记的寡核苷酸探针之前，将1μl适当的抗体添加到核提取物中冰上20分钟。
阶梯分析。
对于DNA梯状排列，细胞在5 ml培养基中用适当的刺激物刺激24小时，然后使用先前公布的方案处理样品(25).
荧光活化细胞分选仪（FACS）分析。
用低渗碘化丙啶溶液（3.4 mM柠檬酸钠/0.3%Triton X-100/0.1 mg/ml碘化丙锭/20μg/ml核糖核酸酶a）对细胞进行染色，并立即用于FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）上的细胞周期分析。
结果
人B细胞中CD40诱导基因Bfl-1的鉴定。
CD40信号传导被认为可以激活许多下游通路，从而激活特定转录因子，包括SAPK/JNK通路、p38激酶通路、细胞外信号调节激酶（ERK）通路和NF-κB通路。为了鉴定介导CD40激活的复杂生物反应的靶效应基因，进行了代表性差异分析。
Daudi细胞是一种人类B细胞淋巴瘤细胞系，用抗人CD40抗体G28.5刺激14小时，或在相同条件下无刺激培养。使用从两个细胞池中分离的cDNA，通过两轮杂交-PCR扩增进行筛选，然后亚克隆代表CD40诱导基因的减去产物进行测序。在已鉴定的基因中，有许多已知的CD40诱导分子，如细胞间粘附分子-1和各种II类MHC链。
通过这一过程，我们鉴定了一种称为Bfl-1/A1/GRS的蛋白质。Bfl-1是凋亡调节蛋白Bcl-2家族的成员，在发育和成年生活中在各种组织中表达。据报道，它在一些癌细胞系中过度表达(26)并显示出保护细胞免受凋亡，并与腺病毒E1A蛋白协同转化培养细胞(27). 除Bfl-1外，我们的筛选还分离出了另一个Bcl-2家族成员Bcl-x，它以前被认为是由CD40诱导的抗凋亡分子。
为了证实Bfl-1在B细胞中的诱导作用，我们从三种人类B细胞系Daudi、Ramos和BJAB（图。A类). 在所有三种细胞系中，CD40刺激16小时后，Bfl-1 RNA显著增加。因此，与Bcl-x的表达一样，Bfl-1的表达似乎对B细胞中的CD40刺激有强烈反应。
Bcl-x和Bfl-1是快速诱导的主要应答基因。(A类)在存在或不存在G28.5的情况下培养16小时的三个人类B细胞系中，证实了Bfl-1的CD40诱导性。用密度为1×10的1μg/ml G28.5处理所有细胞6每毫升细胞数。每条通道装载18微克总RNA，Northern印迹与人类Bfl-1探针杂交。剥离Northern印迹，并检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达作为标准。(B类)通过检测G28.5刺激不同时间后的基因表达，确定Daudi细胞中Bfl-1和Bcl-x诱导的动力学。为了确定CD40介导的这些基因诱导中新蛋白合成的需求，用25μg/ml的蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）预处理细胞30分钟，然后在CHX存在下用G28.5抗体刺激不同时间。用密度为1×10的1μg/ml G28.5处理所有细胞6每毫升的细胞数。每条通道装载18微克总RNA，Northern印迹与人类Bfl-1或Bcl-x探针杂交。剥离Northern印迹，并检测GAPDH的表达作为标准。
快速和瞬时CD40介导的Bfl-1和Bcl-x诱导与新蛋白合成无关。
由于细胞凋亡的激活是通过预成型成分的加工快速发生的，因此CD40对抗凋亡分子的诱导也必须迅速才能有效。我们通过分析G28.5刺激后不同时间点收集的RNA样本，研究了CD40刺激Daudi细胞中Bcl-x和Bfl-1的时间调控。使用可溶性CD40配体作为刺激物观察到相同的结果（数据未显示）。如图所示。B类，这两种分子都被CD40刺激快速诱导，在激活后4-8小时达到峰值表达水平，随后两种转录物的水平在稍后时间点下降。然而，在蛋白质水平上，即使在24小时内，Bcl-x仍被强烈诱导（图。C类).
表达IκB-ER的细胞在NF-κB信号传导中具有功能性阻滞，并且不会上调Bcl-x和Bfl-1对CD40激活的反应。(A类)在存在或不存在1μg/ml G28.5抗体的情况下刺激细胞25分钟，然后按照前面所述处理核提取物。然后使用6微克核提取物与放射性标记的MHC II寡核苷酸进行结合分析。在G28.5介导的激活之前，用200 nM合成雌激素预处理4-OHT诱导的细胞3小时。(B类)Daudi、Daudi-IκB-ER、Ramos和Ramos-IκB-ER细胞用4-OHT预处理45分钟，然后在4-OHT单独或4-OHT加G28.5培养8小时。每条泳道装载18微克总RNA，Northern印迹与人类Bfl-1或Bcl-x探针杂交。剥离Northern印迹，并以甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达为标准进行检测。(C类)Daudi、Daudi-IκB-ER、Ramos和Ramos-IκB-ER细胞用4-OHT预处理2小时，然后用G28.5在4-OHT存在下刺激不同时间。1×10的总细胞提取物6每个通道加载细胞，并进行Western blotting检测Bcl-x的表达。
为了确定这些基因的诱导是否需要合成中间因子，我们在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）的存在下刺激Daudi细胞不同的时间段。对这些细胞产物的Northern blot分析表明，在没有新蛋白质合成的情况下，Bcl-x和Bfl-1转录物继续合成（图。B类); 然而，CHX的使用以不同的方式影响这两个基因的表达。虽然Bcl-x的诱导量保持不变，但Bfl-1对CD40刺激的反应减弱，这表明Bfl-1的完全诱导需要转录因子的参与，其活性对蛋白质合成抑制敏感。这些结果表明，这两个基因的调控机制并不完全相同，但它们有一个共同的快速和短暂的诱导期，并没有被蛋白质合成抑制所消除。
建立NF-κB阻断的Daudi和Ramos稳定细胞系。
除了我们的数据显示通过CD40信号上调Bfl-1和Bcl-x外，Bfl-1也被各种刺激物诱导，如TNF-α、脂多糖、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和IL-1，而Bcl-x被CD40和sIgM信号上调(11,28–30). 所有这些刺激都具有通过NF-κB进行信号传递的共同特征。由于NF-κB信号传导与凋亡调节之间已建立的联系，我们试图确定NF-κ的B信号传导在CD40介导的Bcl-2家族成员上调中的作用。
为了确定这一作用，我们建立了具有NF-κB信号通路功能块的人类B细胞系。该策略涉及一种嵌合融合蛋白的过度表达，该融合蛋白由一个显性活性的IκB-α突变体（32和36位丝氨酸-丙氨酸突变）与突变的雌激素受体配体结合域（ER）融合而成(31). IκB突变体不能在关键丝氨酸残基处磷酸化，因此，在IκB-激酶复合物激活后，它不是蛋白质体降解的靶点。融合的ER在暴露于合成雌激素4-OHT时可诱导相关基因的激活。将FLAG-IκB突变体ER构建物克隆到pCDNA3表达载体中，并稳定转染Daudi和Ramos细胞。分离单个克隆，并选择那些通过Western分析表达构建体的克隆（数据未显示），通过电泳迁移率偏移分析进行进一步表征。
为了确定IκB-ER结构是否具有阻断NF-κB信号传导的功能，通过电泳迁移率变化分析，评估未经处理或用人CD40激活G28.5抗体处理的细胞核提取物与放射性标记的MHC II NF-κ的B寡核苷酸探针（H2探针）的结合活性。如图所示。A类经G28.5抗体处理的亲代Ramos和Daudi细胞的核提取物能够产生代表可诱导NF-κB活性的凝胶移位复合物。这些凝胶移位复合物在4-OHT存在下也同样强烈地形成（数据未显示），表明该药物不干扰NF-κB信号传导。然而，在表达IκB-ER结构的稳定Daudi和Ramos克隆中，CD40介导的NF-κB诱导在4-OHT存在下被完全消除。在缺乏4-OHT的情况下，这些细胞系的NF-κB诱导也显著降低，表明系统中存在一些渗漏。由于4-OHT处理对NF-κB活性产生最大抑制，因此所有后续实验都是在4-OHT存在的情况下进行的。
NF-κB通路对CD40介导的Bcl-x和Bfl-1诱导至关重要。
使用上述NF-κB阻断的细胞系，我们通过Northern blot分析检测了CD40对Bcl-x和Bfl-1的调节。在4-OHT存在下，未刺激Daudi和Ramos亲代细胞，以及Daudi-IκB-ER和Ramos-IκB-ER细胞，或用G28.5抗体处理8小时。如图所示。B类，在4-OHT处理的Daudi-IκB-ER和Ramos-IκB-ER细胞中，这两个基因对CD40处理的反应被抑制，但在亲代Daudi和Ramos细胞中没有，这表明这些细胞需要NF-κB信号传导来诱导这两种基因。
在4-OHT存在的情况下，通过CD40刺激相同细胞系不同时间段，在蛋白水平上检测Bcl-x的表达。与上述结果一致，Western blot分析表明，CD40不能诱导NF-κB阻断细胞系中Bcl-x的表达（图。C类). 我们还观察到，尽管在IκB-ER细胞中，在RNA和蛋白质水平上Bcl-x的诱导作用被完全消除，但其基础表达没有受到影响。这表明，在该基因的基线表达中，其他转录因子可能能够替代NF-κB，或者即使在4-OHT存在的情况下，也有足够的NFκB漏失活性，以实现低水平Bcl-x表达。
Bcl-x启动子中的核因子-κB共有序列结合核因子-kb B复合物并支持转录活性。
利用稳定细胞系进行的Northern和Western blot分析强烈支持NF-κB信号在CD40介导的Bfl-1和Bcl-x上调中的作用。与这些结果一致，对人类Bcl-x启动子的目视检查确定了两个串联的、潜在的NF-kb B结合位点，一个起始于相对于转录起始位点的位置−77，序列为GGGACTGCCC，另一个起始位置−62，序列为GTGACTTTCC。跨越两个潜在NF-κB结合位点的放射性标记寡核苷酸与来自未刺激和G28.5刺激Daudi细胞的核提取物一起使用，以通过电泳迁移分析评估结合。如图所示。A类用G28.5抗体刺激的亲代Daudi细胞的核提取物能够产生多个带移，可能对应于与探针结合的不同NF-κB二聚体复合物；然而，表达IκB-ER结构的稳定细胞系的提取物没有产生诱导性变化，这表明NF-κB活性在CD40活化时必须与Bcl-x NF-κ的B探针结合。用抗p50、抗p65和抗-Rel抗体检测到超位移带，但用其他抗Rel抗体检测到的超位移带很弱（如果有的话），这表明凝胶位移复合物主要由p50、p65和c-Rel组成。进一步的凝胶位移分析表明，与下游位点相比，NF-κB与上游位点跨越位置−77至−68的结合更强（数据未显示）。
Rel成员能够通过与NF-κB顺式元件结合，通过Bcl-x启动子介导转录激活。(A类)与Bcl-x启动子内假定的NF-κB结合位点结合的NF-кB复合物主要由p50、p65和c-Rel组成。如前所述进行核提取和结合反应。在结合反应前20分钟，将适当的抗体添加到冰上的核提取物中，进行超转移。(B类)p65能够通过Bcl-x启动子介导转录激活。在pGL2-Basic荧光素酶报告载体中克隆了一个与转录起始位点（Bcl-x WT启动子）相关的跨越−640到+9的Bcl-x启动子片段和另一个缺失NF-κB结合序列的片段（Bcl-xκB-启动子。用100 ng的报告质粒和2μg p65/RelA表达载体或2μg的pBABE-puro对照载体转染293T细胞。转染后36小时采集样本，并评估荧光素酶活性。
还进行了荧光素酶报告分析，以评估Rel家族成员驱动Bcl-x启动子转录的能力。将跨越Bcl-x 5启动子区的650 bp DNA片段插入pGL2-Basic荧光素酶载体（Bcl-xWT）。另一名内部缺失跨越潜在NF-κB结合区（Bcl-xκB-）的报告人也被创造出来。293T细胞转染了指定的报告人（图。B类)和p65表达DNA载体或控制载体DNA。与对照转染样品相比，与来自Bcl-x WT启动子的p65共转染上调报告活性22.3倍（SD=3.1），而p65共感染上调报告活性仅为来自Bcl-xκB-报告子的2.6倍（SD=0.36）。在瞬时转染的Jurkat细胞中观察到类似的结果（数据未显示）。这些实验表明，Rel成员能够直接激活Bcl-x启动子的转录。
NF-κB活性是保护B细胞免受Fas介导凋亡所必需的。
为了研究NF-κB信号在CD40介导的细胞死亡拯救中的作用，我们研究了NF-κ的B通路是否对CD40介介导的Fas活化细胞死亡的抑制至关重要。亲代Ramos细胞以及IκB-ER稳定细胞系要么未经处理，要么用G28.5抗体处理，要么使用人Fas活化抗体CH11处理，要么同时用G28.5和CH11处理。孵育24小时后，采集样品并对其进行凋亡标记物处理，包括寡核小体DNA梯状排列（图。A类)和子G的分析1通过碘化丙啶染色和FACScan细胞周期分析（图。B类).
在NF-κB信号缺失的情况下，CD40介导的Fas诱导的凋亡救援被阻断。电池（6×106)在5 ml培养基中，未经处理或用1μg/ml G28.5、500 ng/ml CH11 Fas活化抗体处理24小时，或两者兼而有之。收集细胞，DNA片段(A类)和子G1分数(B类)按照中所述进行分析材料和方法.
用CH11抗体处理的野生型Ramos细胞显示出凋亡细胞的特征性阶梯状轮廓，并且具有高亚G1分数（15.3%）。CD40激活后，此特征被抑制，从而降低亚G1在Ramos IκB-ER细胞中，DNA阶梯和增加的亚G1用CH11抗体治疗后仍能观察到分数，但用G28.5抗体联合治疗不能抑制阶梯过程或降低亚G1分数，表明IκB-ER细胞中的CD40活化不能挽救细胞死亡。Daudi细胞对Fas介导的杀伤不敏感（数据未显示），因此，未用于评估CD40介导的对该过程的抑制。这些结果表明，在Ramos细胞中，CD40介导的对Fas激活的细胞死亡的抑制需要通过NF-κB信号通路发出信号。
在缺乏NF-κB活性的情况下，Bcl-x在生理诱导水平的表达能够保护Fas介导的细胞死亡。
如前几节所示，CD40介导的Fas诱导凋亡的挽救通过NF-κB依赖途径进行，该途径可能涉及Bcl-x和Bfl-1的上调。为了确定Bcl-x对CD40介导的抗凋亡的作用，我们将外源性HA标记的Bcl-x导入Ramos IκB-ER细胞，然后测定单个克隆对Fas介导的细胞死亡的敏感性。HA-tagged Bcl-x蛋白的迁移速度略慢于内源性Bcl-x蛋白，从而可以对分离克隆中的表达水平进行比较分析（图。A类). 在CD40刺激8-16小时后，Ramos IκB-ER-Bcl-x克隆A表达外源性Bcl-x，其表达水平与亲代Ramos细胞中的表达水平相似。然而，Ramos IκB-ER-Bcl-x克隆B在相对较低水平上表达外源性Bcl-x。
外源性Bcl-x的表达可防止Fas介导的细胞死亡。(A类)用pEBB-uro-Bcl-x-HA构建物电穿孔转染Ramos IκB-ER细胞，通过限制稀释平板和嘌呤霉素筛选分离稳定克隆。然后通过Western分析评估外源性Bcl-x的表达，并将其与内源性Bcl-x水平进行比较，后者在G28.5抗体激活CD40后上调。(B类)在未经治疗或用CH11治疗24小时后，评估父母Ramos、Ramos IκB-ER和RamosⅠκB-ER-Bcl-x克隆A和B的DNA片段。(C类)子G1未经治疗或用CH11抗体治疗24小时后，在Ramos细胞、Ramos IκB-ER细胞和Ramos I-κB-ER-Bcl-x克隆A和B中进行碘化丙啶染色后，通过FACScan分析评估该分数。
为了确定Bcl-x对Fas介导的死亡的保护作用，用人Fas活化CH11抗体刺激亲代Ramos细胞、Ramos IκB-ER细胞和两个表达Bcl-x的IκB-ER细胞系24小时，并通过DNA分层和碘化丙啶染色评估细胞死亡。如图所示。 B类和C类经CH11抗体处理后，父母Ramos和Ramos IκB-ER细胞系均诱导凋亡。Ramos IκB-ER-Bcl-x克隆A表达接近生理诱导水平的外源性Bcl-x，对Fas介导的细胞死亡具有抗性，而表达较低的Ramos IκB-ER-Bcl-x克隆B仍然对Fas介导的细胞凋亡敏感。其他克隆表达外源Bcl-x的水平介于克隆A和克隆B中的水平，同样在中间水平受到保护（数据未显示）。这些结果表明，CD40激活诱导的Bcl-x水平足以介导其对抗Fas激活的抗凋亡作用。
讨论
除了在炎症和免疫方面的作用(17)，转录因子Rel家族的成员也被认为在防止程序性细胞死亡中发挥重要作用。在RelA中观察到对TNF治疗的细胞毒性增强−/−成纤维细胞和巨噬细胞，以及各种细胞，包括成纤维细胞、纤维肉瘤细胞和淋巴瘤细胞，其中NF-κB信号传导或蛋白质合成被特异性地通过主要负性通路成分的过度表达或通过环己酰亚胺的使用而被阻断(18–20). 综上所述，这些结果表明，NF-κB可能通过上调特定基因产物来防止细胞死亡，而凋亡可以通过激活预先形成的半胱天冬酶级联反应在缺乏新蛋白合成的情况下进行。事实上，NF-κB家族的快速诱导动力学特征对其与转录依赖性凋亡途径竞争的能力至关重要。
NF-κB调节大量基因，包括许多炎症细胞因子和粘附分子(32)，但在最近鉴定出一些候选分子之前，该途径抗凋亡作用的介体一直是个谜，包括抗凋亡抑制剂凋亡分子1和2（c-IAP 1和2）、TRAFs 1和2、IEX-1L和A20(33–36). 尽管最近有人建议IAP家族成员作为caspase的直接抑制剂，但其作用机制，当然还有TRAF、A20和IEX-1L的作用机制尚不清楚。
在这里，我们报告了作为NF-κB信号转导靶点的Bcl-2家族两个抗凋亡成员的鉴定。我们发现在多个B细胞系中，Bfl-1由CD40信号传导诱导（图。A类). 此外，Bcl-x被认为是B细胞中CD40反应性凋亡抑制剂(11–13). Bcl-x和Bfl-1均由CD40激活快速诱导（图。B类)通过NF-κB依赖的信号通路（图。B类).
我们还确定了Bcl-x启动子中的NF-κB共有序列，以及由抗p50/NF-κB1、c-Rel和p65/RelA抗体识别的诱导核复合体，在受刺激的对照细胞中与该序列结合，但在4-OHT处理的IκB-ER表达细胞中没有结合（图。A类). 此外，由Bcl-x上游启动子区驱动的荧光素酶报告子构建对p65表达有强烈反应；然而，这种反应被从启动子中去除假定的NF-κB结合序列所抑制（图。B类). 因此，我们已经证明Bcl-x启动子包含一个结合NF-κB转录因子并支持该家族成员转录激活的元件。
CD40信号传导增加NF-κB活性，并在B细胞的活化、增殖和分化中发挥重要作用(三,37). 激活增殖的生发中心B细胞在迁移到生发中心外围时，经历了Ig可变区的体细胞超突变过程，然后进行抗原驱动的高亲和力克隆选择。低亲和力克隆，以及那些通过突变过程获得自我活性的克隆，被认为是通过细胞凋亡而被移除的。CD40刺激能够挽救生发中心B细胞免于程序性细胞死亡(7). Fas的交叉链接导致B细胞死亡，而CD40信号可以对此提供保护(9). 有趣的是，CD40也被报道上调成熟B细胞中Fas的表达，因此，在某些条件下，CD40实际上使其对Fas介导的杀伤更敏感(38). 因此，CD40激活通过增加Fas表达来增强Fas的死亡信号，同时通过诱导基础水平以上的Bcl-x和可能通过表达额外的抗凋亡分子（如Bfl-1）来防止这种效应。然而，CD40本身的这种保护作用本质上是暂时的，除非也存在其他刺激，如通过高亲和力抗原结合刺激sIgM，否则Fas的长时间激活可以克服它(39). 这与我们证明Bcl-x和Bfl-1在RNA水平瞬时诱导的数据一致（图。B类). 我们证明NF-κB通路的阻断导致Bcl-x和Bfl-1诱导的丢失（图。B类)，消除CD40对Ramos B细胞中Fas介导的凋亡的保护作用（图。).
当Bcl-x被重新导入NF-κB阻断的细胞时，它们受到保护，免受Fas连接的凋亡影响（图。). 这种保护作用所需的异位Bcl-x蛋白水平大致相当于CD40治疗在NF-κB信号完整的细胞中诱导的内源性Bcl-x水平。结合上述数据，这些结果表明NF-κB介导的Bcl-x表达诱导足以使CD40保护B细胞免受Fas介导的凋亡。
NF-κB诱导抗凋亡蛋白的能力与其细胞保护性质一致。有趣的是，能够防止Fas介导的杀伤的Bcl-x表达水平仅比基线高出几倍，强调了这种平衡在数量上的精细性。由于NF-κB通路必须迅速反应以抵消凋亡信号的放大，因此蛋白质表达水平的定量微小变化足以达到这一目的可能很重要。最后，尽管Bcl-x的生理水平足以防止细胞凋亡，但事实上，Bfl-1也由CD40强烈诱导，这表明该蛋白也可能在保护B细胞方面发挥作用。由于NF-κB对细胞凋亡的反应必须迅速，几乎没有错误的余地，因此诱导两个Bcl-2家族成员（其中一个足够）可能代表预防性的抗细胞凋亡活性储备。
致谢
我们感谢David Baltimore、Charles Sawyers和Stephen Smale博士对这份手稿的批评性阅读和宝贵建议。我们还感谢Chris Denny博士和David Chang博士就代表性差异分析方案和Shomyseh Sanjabi提供的技术建议，以及Thomas Parks博士、Katrina Catron博士、Joshy Jacob博士和Nancy Rice博士提供的宝贵试剂。这项工作得到了Margaret E.Early和Stop Cancer基金会的支持。H.H.L.和H.D.得到了加州大学洛杉矶分校医学科学家培训计划培训拨款（GM 08042）的支持。
缩写
| IκB | NF-κB抑制剂 |
| TNF公司 | 肿瘤坏死因子 |
| TRAF公司 | TNF受体相关因子 |
| 哈 | 血凝素 |
| 4欧姆 | 4-羟基他莫昔芬 |
| 急诊室 | 雌激素受体配体结合域 |
| sIgM公司 | 表面IgM |
注释
在编写这份手稿的过程中，两项独立的研究表明，通过其他刺激物，NF-κB信号通路上调了Bfl-1/A1(40,41).
工具书类
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