摘要
背景：肝星状细胞（HSC）是一种主要的纤维生成细胞类型，在慢性肝病期间有助于胶原蛋白积聚。随着人们对开发抗肝纤维化治疗方法的兴趣日益浓厚，有必要建立能够保存人肝干细胞体内表型的细胞系，以阐明人肝纤维化的途径。我们建立了两个名为LX-1和LX-2的人HSC细胞系并对其进行了表征，并将其特征与原代人星状细胞的特征进行了比较。
方法和结果：LX-1和LX-2是由SV40 T抗原永生化（LX-1）或低血清条件下的自发永生化产生的。免疫细胞化学显示，这两种细胞都表达α平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和胶质纤维酸性蛋白。与原发性HSC相似，这两种细胞系都表达调节肝纤维化的关键受体，包括血小板衍生生长因子受体β（βPDGF-R）、肥胖受体长型（Ob-R）L（左）)和盘状结构域受体2（DDR2），以及参与基质重塑的蛋白质；西方分析测定的基质金属蛋白酶（MMP）-2、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-2和MT1-MMP。LX-2降低了TIMP-1的表达。LX-2（而非LX-1）在PDGF作用下增殖。这两种细胞系都表达α1（I）前胶原和HSP47的mRNA。通过定量逆转录聚合酶链反应测定，转化生长因子β1刺激增加了其α1（I）前胶原mRNA的表达。LX-2，而不是LX-1，细胞是高度可转染的。这两个品系都具有典型的星状细胞的维甲酸表型。微阵列分析显示，原发性HSC与LX-1（98.4%）或LX-2（98.7%）的基因表达有很强的相似性，并且表达了多个神经元基因。
结论：LX-1和LX-2人HSC株为肝脏疾病的研究提供了有价值的新工具。这两条线路都保留了HSC的主要特征。LX-2的两个独特优势是其在无血清培养基中的活性和高转染性。
关键词：纤维化、伤口愈合、肝脏、肌成纤维细胞、星状细胞
肝星状细胞（HSC）（以前称为伊藤细胞、脂肪细胞或脂肪储存细胞）是一种主要的细胞类型，在其活化为成纤维性肌纤维母细胞样细胞后导致肝纤维化。1–三随着对星状细胞生物学的深入了解，越来越需要能够忠实再现其体内表型的可再生细胞培养模型。事实上，我们目前对星状细胞行为的大部分知识都是通过动物模型和原代培养研究获得的，尤其是从大鼠身上获得的。当在无涂层塑料上培养时，星状细胞会自发激活，这与它们在体内的反应密切相关。4然而，为了确定其与人类疾病的相关性，必须验证啮齿动物模型在人类星状细胞中阐明的机制。
使用人类星状细胞的一个重要限制是，适合细胞分离的人体组织很少且不可预测的可用性，以及这些分离物的中等产量和常见杂质。克服这些困难的一种方法是从整个组织切片中传代成纤维细胞样生长物，这通常是活化的HSC与其他类型的肝细胞（包括大血管内皮细胞和血管平滑肌细胞）的异质混合物。除了细胞的异质性外，外植体生长的实用性还受到细胞除非永生化所经历的有限传代次数的限制。5此外，人类肝脏中的分离物因制剂而异，因此很难直接比较研究结果。
为了克服这些物种特异性和培养变异性问题，并提供稳定和无限的同源人类HSC来源，我们建立了两个新的永生化HSC细胞系，LX-1和LX-2。这些细胞系具有广泛的特征，并保留了细胞因子信号、神经元基因表达、维甲酸代谢和纤维化的关键特征，因此非常适合于基于培养的人类肝纤维化研究。
方法
材料
Pronase来自Roche Molecular Biochemicals（美国印第安纳州印第安纳波利斯）。培养基199（M 199）、牛血清白蛋白（BSA）和IV型胶原酶来自Sigma-Aldrich Co.（美国密苏里州圣路易斯）。Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、Ham的F-12培养基、Nycodenz和Trizol试剂来自Gibco BRL（美国纽约州大岛）。青霉素-葡萄霉素、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA和我-谷氨酰胺购自Fisher（美国新泽西州斯普林菲尔德）。转化生长因子β1（TGF-β1）来自R&D Systems Inc.（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）。
对于免疫细胞化学，α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、CD68和因子VIII相关抗原的单克隆抗体来自Dako Corporation（Carpintia，California，USA）。猿猴病毒40大T抗原（SV40 T抗原，单克隆抗体）来自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。抗波形蛋白和抗纤毛酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体来自NeoMarkers（美国加利福尼亚州弗里蒙特）。抗兔IgG荧光素和抗鼠IgG（H+L）Texas Red购自Vector Laboratories Inc.（Burligame，California，USA）。DAPI来自Molecular Probes（美国俄勒冈州尤金）。
对于西方分析，先前描述了盘状结构域受体2（DDR2；R2-JM）抗体。6肥胖受体长型（Ob-RL（左）)抗体（H300）来自Santa Cruz Biotechnology，基质金属蛋白酶（MMP）-2抗体来自Sigma-Aldrich，MT1-MMP、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-1和TIMP-2来自Chemicon（Temecula，California，USA）。血小板衍生生长因子受体β（βPDGF-R）的单克隆抗体来自Transduction Laboratories（美国新罕布什尔州纽宁顿）。
造血干细胞的分离和培养
如前所述，分离HSC。724小时后，分离的HSC在含有10%胎牛血清（FBS）的M199中培养，此后每隔3-4天培养一次。当培养物汇合时，将其胰蛋白酶化（0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）并以1:3的比例传代。随后每7-10天进行一次传代。
转染和永生
将传代至第3代的HSC进行胰蛋白酶消化，并在10 cm的培养皿中以约40%的密度进行培养。第二天，用质粒pRSVTag转染第4代细胞，该质粒在肉瘤病毒（RSV）启动子的控制下编码SV40大T抗原。将质粒DNA（10μg）与30μl富金（罗氏）在1 ml无血清培养基中混合15分钟，然后添加到保存在4 ml含有10%FBS的新鲜M199培养基中的HSC培养基中。24小时后取出转染培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养物三次，以去除任何残留的富金试剂，然后用含有10%FBS的M199培养基替换。随后将培养物传代七次，此时细胞在形态上与正常传代细胞不同，并且增殖性更强。LX-1细胞系是从原始T抗原永生化培养物的单个克隆中建立的。LX-2细胞系是通过选择能够在降低血清条件（1%FBS）下生长的LX-1细胞亚系而建立的。从外生长物中扩增出一个克隆，命名为LX-2。LX-2细胞系在含有2%FBS的DMEM中培养。LX-1细胞系在含10%FBS的DMAM中培养。
为了测定LX-2细胞的转染效率，将2.5μg表达增强型绿色荧光蛋白pEGFP-C2的质粒（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市克隆泰克）与7.5μl富金在0.25 ml无血清培养基中混合15分钟。将此混合物添加到在六孔培养皿上培养的LX-2细胞中，培养皿中含有2 ml含2%FBS的DMEM。用倒置显微镜观察细胞的亮视野和绿色荧光图像
免疫细胞化学
将细胞置于12孔培养皿中的玻璃盖玻片上（Fisher Scientific），并生长至约50%的汇合处，持续三天，以促进细胞粘附。然后用无血清冷培养基（DMEM）清洗细胞两次，然后在PBS中的4%多聚甲醛中固定10分钟。固定后，用PBS冲洗细胞两次，然后用含有0.1%Triton X-100的PBS渗透15分钟。然后用PBS清洗两次，并用封闭溶液（PBS中5%的BSA）培养30分钟。初级抗体（在封闭溶液中稀释为1:100）与细胞孵育1小时。用PBST（PBS中0.2%吐温20）洗涤三次后，用荧光素标记的抗鼠IgG（Vector Laboratories；在封闭缓冲液中稀释1:200）培养细胞一小时。用PBST洗涤细胞三次，然后用DAPI（分子探针；PBS中1:5000）染色一分钟，用PBST清洗三次，再用PBS清洗两次。用尼康Eclipse E600荧光显微镜观察细胞。
蛋白质分析
HSC和LX-1细胞在DMEM/10%FBS中培养。LX-2细胞在DMME/2%FBS内培养。用冷PBS清洗10cm培养皿中生长的细胞三次，并在0.4 ml冷裂解缓冲液（20 mM Tris 7.4，150 mM NaCl，1%TX-100）中收集，用蛋白酶抑制剂（Complete，EDTA free；Roche）进行超声处理，然后离心。测定上清液中的蛋白质浓度（DC蛋白质测定；Biorad，Hercules，California，USA）。将样品调节至1×Laemmli加载缓冲液，30μg样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至硝化纤维素。膜在TBS Tween缓冲液中封存和清洗，然后与Western Lightning Plus（美国马萨诸塞州波士顿的Perkin Elmer）一起开发。
为了检测βPDGF-R，在蛋白质印迹之前，首先用βPDGF-R单克隆抗体对裂解物进行免疫沉淀。为了进行免疫沉淀，用1 ml冷裂解缓冲液从10 cm培养皿中收集细胞。清除的裂解产物与抗体和蛋白G sepharose（UltraLink；Pierce，Rockford，Illinois，USA）在4°C下孵育过夜。用裂解缓冲液洗涤三次后，通过在1×莱姆利负载缓冲液中再悬浮并煮沸10分钟来洗脱树脂。为了测定LX-2细胞分泌的明胶酶（MMP-2）活性，如前所述进行明胶酶谱分析。8
比较定量实时RT-PCR
将HSC、LX-1和LX-2细胞置于直径为60 mm的培养皿中，并培养至70%的汇合处。在TGF-β1治疗（2.5 ng/ml，20小时）之前，将细胞血清饥饿并补充0.2%BSA 48小时。LX-1细胞额外补充0.5%FBS。对照细胞也被血清饥饿。根据制造商的说明，用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，California，USA）提取总RNA。简单地说，用试剂溶解细胞，加入氯仿，用异丙醇沉淀细胞RNA。用75%乙醇洗涤后，将RNA颗粒溶解在无核酸酶的水中。
使用逆转录系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）将总RNA逆转录成互补DNA（cDNA）。将7.7μl无核酸酶水中的RNA（1μg）添加到2.5μl 10×逆转录酶缓冲液、10μl 25 mM MgCl2、2.5μl 10mM dNTP、1.0μl随机引物、0.5μl RNase抑制剂和0.8μl AMV逆转录酶中，总体积为25μl。反应在25℃下进行10分钟（退火），在42℃下进行60分钟（cDNA合成），在95℃下进行5分钟（酶变性）。
使用ABI Prism 7700序列检测系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行比较定量实时聚合酶链反应（PCR）。每个PCR反应中使用cDNA（1μl）。家政基因β-actin被用作正常化和H的参考基因2O用作阴性对照。α1（I）前胶原的引物对（正/反义）为5′-AAC ATG ACC AAA AAC CAA AAG TG-3′和5′-CAT TGT TTC CTT CTT CTG G-3′；HSP47:5′-ATG-AGA AAT TCC ACC ACA AGA TG-3′和5′GAT CTT CAG CTG CTC TTT GGT TA-3′；β-肌动蛋白：5′-GAT GAG ATT GGC ATG GCT TT-3′和5′-GAG AAG TGG GGT GGC TT-3′。PCR反应由铂Taq聚合酶（Invitrogen）催化，而SYBR Green I DNA结合染料（Molecular Probes）在40个循环中的每个循环中都会产生荧光信号，与双链DNA的数量成比例（95°C下变性15秒；56°C下退火15秒；72°C下延长40秒）。琼脂糖凝胶电泳对PCR产物的分析证实了PCR反应的特异性和DNA产物的均一性。
细胞增殖试验
在无血清条件下，通过以下方法检测LX-2细胞对BB-PDGF刺激的增殖反应[三H] 胸腺嘧啶掺入，如前所述。9
视黄醇生物学分析
LX-1和LX-2细胞对视黄醇的摄取和加工
在电镀和过夜培养后，用两种不同浓度（2μM和10μM）的视黄醇在黑暗中处理细胞24小时。为此，用少量乙醇（小于水体积的1%）稀释视黄醇浓缩储备溶液，并将其添加到含有300μM棕榈酸的培养基中，以帮助酯化，然后用力搅拌。培养后，取下三份培养物中的培养基，将细胞刮入2ml冰冷的PBS中。然后在分析前将样品储存在−20°C下。对照细胞在乙醇载体培养基中培养。
视黄醇和视黄醇酯的HPLC分析
如Yamada及其同事所述，采用反相高压液相色谱法（HPLC）分析视黄醇和视黄醇酯，10使用Waters 510高效液相色谱泵（Waters Associates，Milford，Massachusetts，USA），以1.8 ml/min的流量运行，Ultrasphere C18柱（5μm；4.6 mm×25 cm）（美国加利福尼亚州富勒顿贝克曼仪器公司）和Waters 996光电二极管探测器。在325nm处监测视黄醇和视黄醇酯，并使用视黄醇或视黄醇酯类与内标醋酸视黄酯的已知质量质量比相关的标准曲线进行量化。这种HPLC方法可以检测和定量不同的视黄酯，包括棕榈酸视黄酯、油酸视黄酯、硬脂酸视黄酯、亚麻酸视黄酯和肉豆蔻酸视黄酯。
微阵列分析
RNA制备
使用Qiagen（Valencia，California，USA）RNeasy柱和柱上DNase处理，从在含有10%FBS的DMEM中生长至80%汇合的HSC和LX细胞中提取RNA。RNA在无RNase的水中洗脱，A260/A280比率>2.0。总RNA的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳验证（NorthernMax-Gly；Ambion，Austin Texas，USA）。
生物素标记cRNA（靶）制剂
为了合成cDNA，将5μg总RNA与T7引物和Superscript II逆转录酶（Invitrogen）混合，并在42°C下培养1小时。将第一条cDNA与大肠杆菌DNA聚合酶I和RNase H，并在16°C下孵育2小时。根据制造商的协议，使用QIAquick试剂盒（Qiagen）纯化双链cDNA。纯化的cDNA在pH 8.5的10 mM Tris-HCl中洗脱，并在Speed-Vac中干燥。为了合成cRNA，纯化的cDNA与生物素标记的11-UTP和11-CTP在37°C下进行隔夜体外转录反应。按照制造商的方案，通过Rneasy柱纯化（Qiagen）纯化和回收RNA。RNA在无核糖核酸酶的水中洗脱，并在260nm处用紫外分光光度法定量。生物素标记的cRNA的大小分布在生物分析仪（美国加利福尼亚州福斯特市安捷伦）上进行了验证，长度范围为500到2000个核苷酸（数据未显示）。cRNA的平均产量约为每反应100μg。生物素标记的cRNA在94°C下加热20分钟，在镁的存在下破碎，得到长度约为50-200个核苷酸的片段。
杂交和加工
将片段生物素标记的cRNA（10μg）与CodeLink杂交缓冲液（总体积260μl）混合，并注入复制品（2）CodeLink-UniSet人类I生物阵列。将阵列加载到托盘上，并在Innova培养箱中以300 RPM的转速在37°C下摇晃过夜。阵列被单独冲洗，然后放置在严格清洗中一个小时。接下来，将每张载玻片在3.4 ml链霉亲和素Alexa 647（分子探针）工作溶液中培养30分钟，然后在240 ml TNT缓冲液中清洗载玻片四次。最后清洗时，将载玻片在240 ml试剂级水中冲洗两次。然后用N干燥载玻片2气流。
数据收集和图像分析
使用GenePix系列A扫描仪（Axon Instruments，Foster City，California，USA）进行斑点检测，并使用CodeLink软件进行斑点定量。这里简要描述了关键的量化参数：对单个光斑强度进行局部背景减法，然后根据总体阵列强度对每个阵列进行缩放。中位数归一化后，使用一组阴性对照探针计算阴性对照阈值，如前所述。11,12
统计分析
对归一化数据集进行过滤，以排除强度低于每个阵列负阈值的克隆。然后进一步过滤每个细胞系的阵列实验，以排除两个技术复制品之间差异表达大于1.5倍的克隆。每个克隆的技术复制和SNOMAD（微阵列数据的标准化和非标准化）基因表达数据分析工具（可在http://pevsnerlab.kennedykrieger.org/smograminput.html)用于标准化成对细胞系的数组数据，以使其更具可比性。简单地说，对数据集进行对数变换，并使用R“lowess”函数校正平均局部方差。最后，计算每个克隆的z得分（即相对于特定表达水平下的对数值方差量的标准偏差单位）。13z分数大于5或小于−5且表达率大于五倍的克隆被视为差异表达。使用比较定量逆转录（RT）-PCR对几个差异表达的克隆进行了验证。
结果
人肝星状细胞的分离和永生化
HSC通过胶原酶/蛋白酶处理从约15 g的正常肝组织楔块中获得，然后在Nycodenz密度梯度上进行分离，以分离肉质和富含脂质的星状细胞，如方法部分所述。将原代培养物接种到未涂布的塑料盘中，三天后进行胰蛋白酶消化，并进行传代培养。将这些细胞再传代三次，以去除潜在的污染肝细胞、内皮细胞和库普弗细胞，这些细胞通常无法在胰蛋白酶化和传代培养后存活。然后通过免疫细胞化学对第4代HSC进行α-SMA（活化HSC的标记物）的检测，以评估其纯度。所有细胞的α-SMA均为阳性，而CD68或因子VIII相关抗原（分别是枯否细胞和内皮细胞的标记物）则无免疫染色。在分离的Kupffer细胞和内皮细胞中对CD68和因子VIII相关抗原进行阳性对照免疫染色，证实了这些标记物的特异性（数据未显示）。
为了永生化，将第4代细胞的培养物转染质粒pRSV-Tag，该质粒在肉瘤病毒启动子的控制下表达SV40大T抗原。为了选择永生化细胞，我们考虑到原代传代HSC仅在有限数量的传代中存活，而且它们的复制速度较慢，大约需要7天的倍增时间。我们进一步假设永生化细胞的生长速度将比其来源的原代传代HSC更快，因为SV40大T抗原能够抑制G1细胞周期生长停滞（Ali和DeCaprio综述14). 将T抗原转染的培养物以1:10的稀释度进行传代培养，以期永生化细胞最终将主导培养群体。经过七轮传代后，培养物出现了明显的形态变化。细胞体积较小，伸展较少，增殖率显著增加，培养倍增时间仅为24小时。通过限制稀释，分离并扩增单细胞克隆。一个名为LX-1的克隆被扩大用于进一步研究。
通过施加选择压力，在还原血清（1%FBS）中培养早期传代的LX-1细胞亚群，建立了另一个永生化HSC细胞系LX-2。其基本原理是建立一种在缺乏血清生长因子支持的情况下仍能存活的细胞系，这是原发性造血干细胞的特征。四个分离的早期传代LX-1细胞池在还原血清中生长，一天后几乎所有细胞都从培养皿中分离出来。三天后，将培养物中剩余的细胞在富含生长因子的培养基（10%胎牛血清）中重新培养数周，直到它们汇合，然后再次在还原血清中生长。经过四轮连续的筛选程序后，我们在四分之一的原始培养池中确定了在1%FBS中稳定生长的细胞培养物。这些细胞在形态上表现为均质，无论血清浓度如何，增殖缓慢，培养倍增时间约为3-4天。LX-2细胞系在低血清培养基中保持并扩增了50代。
为了确定细胞系是否表达SV40大T抗原，对其进行免疫细胞化学分析（图1). SV40大T抗原主要定位于LX-1细胞的细胞核，而LX-2细胞为阴性，表明T抗原表达缺失（图1). 西方分析证实了这一发现（数据未显示）。作为对照，细胞与DAPI共染色以识别细胞核（图1).
SV40大T抗原（TAg）在LX-1细胞系中的表达。对LX细胞进行免疫细胞化学分析（见方法）。SV40大T抗原在LX-1细胞的细胞核中检测到，但在LX-2细胞中没有检测到。细胞与DAPI共染色以识别细胞核。
中间丝的表达
细胞系还通过免疫细胞化学检查中间丝蛋白α-SMA、波形蛋白和GFAP的表达，这些蛋白通常在HSC中表达（图2). LX-1和LX-2细胞均表达α-SMA，这是活化HSC的标志物。细胞骨架网络中的两个细胞系中均存在波形蛋白（间充质起源细胞类型的标记）和GFAP（星状细胞亚群的标记）。西方分析也证实了这些蛋白的表达（数据未显示）。
通过LX-1和LX-2表达中间丝。对LX细胞进行免疫细胞化学分析（见方法）。LX-1和LX-2细胞均表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP），并形成细胞骨架网络。细胞与DAPI共染色以识别细胞核。
受体的表达：PDGF-R、OB-RL（左）和DDR2
PDGF是一种由a链和B链两条多肽链组成的二聚体，是对活化HSC最有效的有丝分裂原。在三种可能的二聚体形式（AA、AB和BB）中，BB-PDGF在刺激HSC增殖和迁移方面最有效，这与PDGF受体β亚基的主要表达一致，后者优先对PDGF B链作出反应。15两种LX细胞系均表达βPDGF-R亚单位，该亚单位与原代人HSC表达的PDGF受体的β亚单位和NIH3T3细胞表达的更高分子量形式相结合（图3). 这一发现表明，这些细胞系代表活化的HSC，因为PDGF-Rβ亚单位在静止细胞中不表达。9,15尽管两种细胞系都表达βPDGF-R，但BB-PDGF配体的刺激仅增加了LX-2的增殖（图3)但不包括无血清培养基中的LX-1（数据未显示），根据三H-胸腺嘧啶掺入。
血小板衍生生长因子受体β（βPDGF-R）的表达和LX-2细胞对BB-PDGF的反应。（上图）免疫沉淀/西方分析（见方法）检测到LX-1和LX-2细胞中βPDGF-R亚单位的表达。以NIH3T3细胞和传代人肝星状细胞（HSC）为对照。（底部）BB-PDGF配体（1和10 ng/ml）在无血清培养基中刺激LX-2细胞增殖，根据三H-胸腺嘧啶掺入（cpm）。
除了PDGF受体外，我们还鉴定了另外两个受体，DDR2和Ob-RL（左），在两条LX线上（图4). DDR2是我们之前在大鼠星状细胞中发现的一种受体酪氨酸。6,16通过western blot测定，人类HSC表达DDR2（图4). DDR2蛋白在两种细胞系中均表现为双倍体，而原代HSC主要只表达分子量较高的物种。较低的条带可能代表一种没有酪氨酸磷酸化的受体形式，正如我们之前在大鼠HSC中记录的那样。6,16
通过西方分析检测受体和基质重塑蛋白的表达。对LX细胞系和原代肝星状细胞（HSC）的盘状结构域受体2（DDR2）和长型肥胖受体（Ob-R）的表达进行了比较L（左）)对于基质重塑蛋白MT1-MMP、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-2和TIMP-1（参见方法）：每个样品装载40μg细胞裂解物蛋白。
Western blot还显示约200 kDa Ob-R的表达L（左）人类HSC和细胞系中的蛋白质（图4). 通过Ob-R发出信号L（左）瘦素受体的长型和信号传导活性亚型增强了啮齿动物HSC的成纤维反应。17–19此外，我们实验室最近的一项研究记录了Ob-R的表达L（左）大鼠HSC中的蛋白质。19
基质重塑蛋白：MMP-2、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2
基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制剂（TIMPs）在肝纤维化中的表达增加，并有助于纤维化的进展和消退。20基质金属蛋白酶-2（也称为明胶酶A）是由HSC在培养中激活时表达和分泌的。21MMP-2蛋白酶活性在细胞表面受到调节，涉及形成一种三分子复合物，将前MMP2与MT1-MMP（也称为MMP-14）和TIMP-2结合。该复合物的所有三种成分均由活化的HSC表达。
我们检测了LX-1和LX-2细胞系这种调节MMP-2活性的三分子蛋白复合物的表达。全细胞裂解物的西方分析显示了所有三种成分（图4, 5). 然而，MMP-2的前体和活性形式均在原代HSC中检测到，而大多数前MMP2形式在两个LX细胞系中检测到。还评估了LX-2细胞分泌MMP-2的情况，但无法在LX-1细胞中进行评估，因为它们在无血清条件下快速死亡，需要测定MMP-2分泌（血清中含有大量MMP-2）。将LX-2培养物的血清饥饿16小时，并对采集的条件培养基进行明胶酶谱分析。由于十二烷基硫酸钠诱导的蛋白质构象变化揭示了潜在的活性，这种分析方法可以检测明胶酶的活性，甚至原酶的活性。检测到明胶酶活性，其对应于通过western blot检测到的高分子量形式（pro-MMP-2）（图5).
基质金属蛋白酶（MMP）-2蛋白的表达和活性。（上图）Western分析检测到原代肝星状细胞中MMP-2的前体和活性形式。在LX细胞中，主要检测到前MMP-2：每个样品中装载40μg来自细胞裂解物的蛋白质。（底部）LX-2细胞条件培养基的明胶酶谱显示分泌了前MMP2。
还评估了抑制胶原蛋白降解的TIMP-1蛋白的表达。随着HSC在培养中被激活，TIMP-1和TIMP-2的表达显著增加。与LX-1和原代HSC相比，LX-2细胞仅表达少量TIMP-1蛋白（图4). 然而，我们只检测了TIMP在细胞裂解物中的表达，并且由于TIMP通常是分泌的，因此在培养基中可能有相当数量的TIMP。对于TIMP-2，其在细胞裂解物中的检测可能是由于其与细胞表面的MT1-MMP相关。尚不清楚为什么TIMP-1在HSC和LX-1细胞裂解物中丰富，但在LX-2细胞裂解物却不丰富（图4). 然而，LX-2中TIMP-1的产生受到瘦素的刺激，瘦素是肝脏中的促纤维化激素。22
α1（I）前胶原和HSP47 mRNA的表达
为了评估细胞系产生与纤维化相关的I型胶原的能力，对α1（I）前胶原和HSP47 mRNA进行了比较定量实时RT-PCR。HSP47是胶原生物合成所需的一种胶原特异性伴侣蛋白，参与前胶原的加工、成熟和分泌。23HSP47 mRNA在人HSC、LX-1和LX-2细胞系中表达，LX-1的表达量比LX-2高50%。LX细胞也比作为阴性对照的肝癌细胞系Huh7和HepG2表达更多的HSP47 mRNA（图6). α1（I）前胶原的表达与原代HSC和LX细胞系中HSP47的表达水平平行（图6).
HSP47（A）和α1（I）前胶原（B）mRNA表达。采用定量实时逆转录聚合酶链反应（见方法）检测并比较原代肝星状细胞（HSC）、LX细胞、肝癌细胞Huh7和HepG2 HSP47（A）和α1（I）前胶原（B）mRNA的表达。原代HSC的表达水平被用作1的参考点，并显示了折叠差异。误差条代表平均值（SEM）（n=3). 除LX-2细胞外，所有细胞均在Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）/10%胎牛血清（FBS）中培养，该培养基仅含1%胎牛血清。
TGF-β1刺激LX细胞系α（1）I前胶原mRNA
TGF-β1是原发性HSC的一种强效促纤维化细胞因子，可刺激α（1）I前胶原mRNA的表达。通过比较实时RT-PCR评估，TGF-β1治疗LX-1和LX-2细胞可使α1（I）前胶原mRNA的表达增加3-4倍（图7).
转化生长因子β1（TGF-β1）增加肝星状细胞（HSC）（A）、LX-1（B）和LX-2（C）细胞中的α1（I）前胶原mRNA。通过定量实时逆转录聚合酶链反应（见方法）测量其对α1（I）前胶原mRNA水平的影响，检测原代HSC和LX细胞对TGF-β1的反应性。未经治疗的对照组被用作参考点，设定为1，显示TGF-β1治疗（2.5 ng/ml，持续20小时）后的折叠诱导。误差条代表平均值（SEM）（n=3).
LX-2细胞可高度转染
研究培养的星状细胞的一个主要技术限制是其转染效率一直很低，通常低于1%。这给这种细胞类型的研究带来了很大的限制，因为无法通过基因（及其显性阴性）的异位过度表达进行分子遗传操作。已报告HSC病毒感染24,25但这很耗时。相比之下，使用商业试剂Fugene，LX-2细胞的转染效率相对较高，大于30%（图8). LX-1和原发性人类HSC对Fugene的效率低于1%（数据未显示）。
LX-2细胞的转染效率。将六孔培养皿中80%融合的LX-2细胞转染Fugene和2.5μg表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-C2（Clontech）。（A） 转染LX-2细胞的明亮视野图像。（B） 同一区域细胞的荧光图像。
LX-1和LX-2细胞系代谢类视黄醇
分析LX-1和LX-2星状细胞吸收和酯化视黄醇（2μM和10μM）的能力。在未经处理的细胞中，未检测到视黄醇酯和极低水平的视黄醇。（在含有10%FBS的培养基中，视黄醇的浓度约为0.1μM，远低于视黄醇（2μM）的生理浓度。）如图9所示在视黄醇孵育过程中，视黄醇和视黄醇酯均在LX-1和LX-2星状细胞中积累，在添加较高浓度的视黄醇时积累更大。这两种细胞株都积累了视黄醇，并将其转化为视黄醇酯，达到相似的程度。视黄酯仅存在于细胞内，在培养基中未检测到。因此，LX-1和LX-2系的维甲酸代谢与大鼠肝星状细胞中的报道相似。26
LX-1和LX-2细胞积累并酯化视黄醇。向LX-1（A）和LX-2（B）细胞培养基中添加0（对照）、2或10μM视黄醇24小时。然后用冰冷的磷酸盐缓冲盐水清洗细胞并收获。如方法部分所述，通过高压液相色谱法测量细胞中视黄醇和视黄醇酯的水平。
基因芯片分析LX-1和LX-2细胞系与原代HSC的基因表达
为了通过LX-1和LX-2获得更全面的基因表达特征，我们通过使用Amersham Codelink扫描约10000个基因探针（克隆）的微阵列分析，将其mRNA图谱与原代HSC进行比较。在检测到的2211个克隆中，LX-1和原代HSC的表达均高于阴性阈值，其中36个克隆有差异表达（98.4%相似表达），在检测到2240个克隆中LX-2和原代造血干细胞的表达均超过阴性阈值，28个克隆有差别表达（98.7%相似表达）。在LX-1和LX-2细胞系的2692个克隆中，有18个克隆表达差异（99.3%表达相似）。因此，两个LX细胞系之间差异表达的基因更少。
与原发性HSC相比，LX-1和LX-2中有18个基因的表达存在类似差异（表1–3). LX-1和LX-2细胞系均显示p21的表达减少，这可能是预期的，因为它们的永生表型已通过实时PCR得到证实（未显示）。CDC2、胸苷激酶1、TGF-βI诱导的68kDa蛋白、CSE1L（染色体分离1样）和survivin的表达增加也与永生表型相一致，所有这些都被证明可以促进增殖或抗凋亡。这些基因的差异表达不仅仅是T抗原过度表达的结果，因为LX-2细胞不表达T抗原。两种LX细胞系的LTBP2（潜在的TGF-β结合蛋白2）和ITGA7（整合素α7）的表达也降低。
表1
LX-1和LX-2细胞系与原代肝星状细胞（HSC）的差异基因表达：基因在LX-1与LX-2中表达相似，但与原代HSC的差异表达
表3
LX-1和LX-2细胞系与原代肝星状细胞（HSC）的差异基因表达：与原代HSC相比，仅LX-2中的基因差异表达
与原发性HSC相比，LX-1中特异性差异表达的基因包括PIG11（p53诱导基因11）、CTGF（结缔组织生长因子）和聚糖（表1）–3). LX-1中PIG11的表达减少与T抗原对p53的失活一致。在LX-2细胞中特异性差异表达的基因包括催产素受体和卵泡抑素样1。
越来越多的证据表明肝星状细胞具有神经元表型。27事实上，大量神经元相关基因在原代人类星状细胞以及LX-1和LX-2细胞中表达（表4).
表4
原代人星状细胞及LX-1和LX-2细胞系神经基因的表达
讨论
我们建立了两个人类肝星状细胞系，并通过微阵列表征了它们的整体基因表达。这些细胞系为研究肝纤维化机制和检测抗纤维化化合物提供了重要工具。LX-1细胞表达SV40大T抗原，而LX-2细胞无持续T抗原永生化；到目前为止，这两个通道至少稳定了50次。两个LX系的表型与体内“活化”细胞的表型最为相似。例如，LX系GFAP的表达在慢性肝病中更为典型，HSC和门静脉肌成纤维细胞都表达这种中间丝28而在正常肝脏中，大多数人HSC对该中间丝无免疫反应性。29除GFAP外，LX细胞还表达受体βPDGF-R、DDR2和Ob-RL（左）在活化的HSC中表达，但在静止细胞中不表达。尽管有这种激活的表型，但LX-1和LX-2系可以通过基质凝胶（未显示）或低血清中的生长而停止生长30这与我们报道的永生大鼠星状细胞系HSC-T6的结果类似。15
两种细胞系均表达PDGF受体的β亚单位，但只有LX-2细胞对BB-PDGF诱导的增殖有反应。对LX-1不敏感的一个潜在解释是，细胞已经被血清衍生或自分泌PDGF最大限度地刺激。与原代活化HSC类似，LX-2细胞在含有0.2%BSA的无血清培养基中仍能存活，而LX-1细胞则相反。LX-1和LX-2细胞对TGF-β1（肝脏疾病中的一种主要纤维生成细胞因子）有反应。TGF-β1在肝纤维化动物模型和慢性肝病患者中升高。31,32
HSC的特点是其表达特定的标记基因，但在体内，其表型具有相当大的异质性和可塑性。28,29,33–35这种异质表达模式可能反映了微环境的局部影响，包括细胞外基质、可溶性自分泌和旁分泌因子以及细胞间通讯。
根据定义，已建立的细胞系在分子表型上与培养的原代细胞存在一定差异，因为它们是永生的。在迄今为止描述的其他三种人类星状细胞系（除LX-1和LX-2外）中，只有hTERT-HSC细胞系源自密度梯度纯化的HSC，类似于LX细胞系。hTERT HSC细胞系是通过逆转录病毒表达人端粒酶的永生化作用开发的。5有趣的是，与LX细胞一样，hTERT-HSC细胞系也表达GFAP，GFAP也由体内大多数但并非所有活化的人类HSC表达。另外两种人类星状细胞系代表病变肝脏的自发生长：LI90细胞系来源于肝间质肿瘤的生长36并且GREF-X细胞系是通过来自肝硬化肝外植体生长的培养的肝肌成纤维细胞的自发永生化获得的。37重要的是，在迄今为止产生的所有人类星状细胞系中，只有LX-2细胞系在没有血清的情况下仍能存活。除了验证LX-1和LX-2细胞中的纤维生成途径外，我们还证明了LX细胞系表达基质降解复合物的成分。具体而言，它们表达明胶酶A基质重塑复合物，包括pro-MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2。此外，LX-2细胞分泌前MMP2，使其成为探索人类细胞模型中基质降解途径的重要潜在工具。最近，由于细胞因子刺激增加了MMP-2活性，LX-2细胞显示出迁移。38越来越多的证据也将基质降解与星状细胞中的凋亡直接联系起来，39LX-2细胞承受血清剥夺的独特能力不仅为酶谱法检测MMP-2提供了一种手段，而且也为探索细胞凋亡的途径提供了一个途径。最近，研究表明LX-2细胞能够经受TRAIL介导的凋亡，原代HSC也是如此。30
LX-2细胞的一个独特优势是其相对较高的转染能力，与迄今为止报道的LX-1细胞和所有其他星状细胞培养系统的转染效率不到1%相比，使用商业试剂（Fugene）的转染率为～30%。
微阵列分析还发现了其他病理条件下描述的潜在治疗靶点，并证实了该细胞类型中几个神经元基因的表达。例如，progranulin（也称为颗粒蛋白或PC衍生生长因子）在细胞系和原代HSC中平等表达，是一种在皮肤伤口愈合中诱导的新型生长因子。40LX-1和LX-2细胞系的survivin表达增加。该分子属于一个被称为凋亡抑制因子的基因家族，也与血管损伤中有丝分裂的控制和平滑肌细胞生物学的调节有关。41,42星状细胞表达卵泡抑素样1（FSTL1，FRP，TSC-36）是一个有趣的现象，因为它与（卵泡抑素酶）相似的蛋白质被证明可以促进肝再生，并且对胰腺星状细胞也有抗纤维化作用。43–45
当前抗纤维化药物的开发重点是使用阵列技术进行靶基因识别，以及在基于细胞的分析中使用高通量分析验证先导化合物。人类细胞而非啮齿动物细胞对这种方法是绝对必要的，而忠实维持体内表型的细胞系的可用性是一个重要组成部分。LX-1和LX-2系代表了此类试剂，尤其是LX-2系列，其高转染性和耐受无血清条件的能力，为阐明星状细胞生物学和发现抗纤维化疗法提供了重要的新工具。
