氧化损伤与年龄相关性黄斑变性

摘要

氧化过程被认为在心脏病、某些类型的癌症、神经退行性疾病、白内障和年龄相关性黄斑变性（AMD）等越来越多的疾病中起着致病或促成作用。近年来，人们对氧化应激、自由基以及氧气（提供有氧呼吸所必需的氧）是如何产生毒性的进行了大量研究。AMD患者的视力下降是由于黄斑的感光细胞受损引起的，视网膜色素上皮（RPE）和布鲁赫膜的异常是该病的特征[1,2]. 自Noell等人最初的研究以来[三]研究表明，自由活动的大鼠暴露在持续明亮的可见光（绿色）下会导致视杆感光细胞选择性退化，人们越来越担心长期暴露在阳光下可能是AMD发病的一个因素[4]. 事实上，是诺埃尔等人首次提出光损伤机制可能涉及光敏反应。外层视网膜，特别是感光细胞的外层，在膜中含有高浓度的多不饱和脂肪酸（PUFA）。该区域也暴露于相对较高的氧张力，与动脉血中的氧张力相近。鉴于众所周知，PUFA在氧或氧衍生自由基物种存在下易氧化，因此可以理解为什么氧化步骤被认为与AMD的发病机制有关。将描述这些激进物种的性质及其产生来源。

正如Young所说[4]，“（视网膜外层）衰老的第一个迹象是出现残留体（脂褐素）在RPE中。RPE细胞用脂褐素进行性充血伴随异常排泄物，这些排泄物积聚在细胞的基底面和Bruch膜内。这种细胞损伤过程可能最终导致RPE和视觉细胞死亡。”脂褐素是指存在于多种神经元和非神经元组织中的一类复杂的、自荧光的脂质/蛋白质聚集体的总称[5]. 在眼睛中，脂褐素在RPE中一生积累，最终在80岁时占细胞质体积的19%[6]. 与体内其他细胞不同，脂褐素是通过细胞内细胞器的自噬分解而产生的，RPE中脂褐素形成的主要底物是光感受器外段吞噬作用产生的不可降解终产物。有相当多的证据表明，脂褐素的形成与自身氧化性组织损伤有关，这表明脂褐素（至少部分）是自身氧化的产物[7]. 大多数细胞类型的脂质过氧化损伤的主要部位是线粒体和微粒体膜，其中含有相对大量的PUFA[8]. 这些过氧化脂质被认为是脂褐素损伤的主要前体。在体内，脂褐素颗粒持续暴露于可见光（400–700 nm）和高氧张力（70 mm Hg）下，这是形成活性氧物种的理想条件，可能会损坏细胞蛋白质和脂质膜。将介绍脂褐素在AMD发展中的可能作用。

光敏反应可能参与AMD发展的第二个部位是脉络膜毛细血管[9]. 有人提出，血红蛋白前体的光激活可能发生在通过脉络膜毛细血管的红细胞中。这些前体的激活可能会产生活性氧物种，例如超氧化物、过氧化氢和单线态氧，这可能会损坏RPE和Bruch膜。我们将概述支持AMD是由脉络膜毛细血管光敏损伤引起的假说的证据。

细胞中产生的不同类型的氧化剂要求细胞具有抗氧化防御系统[10–12]. 抗氧化剂可以在氧化过程中发挥不同程度的作用，例如，通过阻止引发自由基的形成、结合金属离子或去除受损分子。主要的细胞水溶性抗氧化剂是抗坏血酸（维生素C）和谷胱甘肽，它们的生化/抗氧化重要性主要与其还原能力有关[13]，以及超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等酶[12]. 主要的脂溶性抗氧化剂包括维生素E、类视黄醇和类胡萝卜素，后者包括叶黄素和xeaxanthin，它们选择性地积聚在黄斑中，并导致视网膜这一区域的黄色[14–18]. RPE和视觉细胞的健康取决于它们代谢自由基、脂质过氧化氢和其他潜在有毒化合物的能力。为了确定这些抗氧化剂在保护视网膜和视网膜色素上皮免受氧化损伤中的作用，已经付出了大量努力[19]美国国家眼科研究所（National Eye Institute）正在进行一项大型多中心协作临床试验（AREDS），以评估抗氧化剂补充剂对AMD的潜在益处。其中一个焦点是谷胱甘肽在保护RPE细胞免受氧化损伤方面的潜在有益作用，这些实验的结果将被总结。

图1给出了可能参与可能导致AMD的氧化损伤发展的各种反应（损伤序列）的通用示意图（诚然不完整）。图1还展示了保护剂、尽量减少阳光照射的深色太阳镜、抗氧化剂（谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素）和抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物二变位酶），以及修复和替换受损分子的机制。破坏性反应始于氧化、光氧化或光敏事件，这会增加依赖氧的自由基或活性物种的产生。这些物种改变大分子的结构，产生过氧化物、氧化蛋白和DNA链断裂，是疾病和细胞死亡的前兆。目前，尚不清楚氧化是否是AMD进展的致病因素。然而，以下章节将提供证据，表明视网膜色素上皮和脉络膜中的光毒性反应对感光细胞和视网膜色素上皮的健康和生存，以及最终对视力构成持续威胁。

在单独的窗口中打开

图1

破坏性反应的示意顺序。该序列以氧化、光氧化或光敏化事件开始，以导致疾病的破坏性反应结束。据推测，这些初始事件产生的氧化剂和自由基会导致脂质过氧化、蛋白质中关键键的氧化和DNA链断裂。细胞拥有一个保护剂库，包括抗氧化剂和酶，用于淬灭氧化剂和自由基，从而最大限度地减少损伤以及修复和更换的需要。如果眼部组织（如AMD患者的视网膜）受到光依赖性损伤，戴墨镜将减少阳光照射。

氧及其常见代谢物的生物化学

图2显示了氧化学的一些基本特征和四种常见的氧代谢产物：超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧。显然，氧化剂和自由基的生成有许多机制。每种机制都有其自己的产生自由基以及淬灭和中和代谢产物的途径。需要指出的是：（1）自由基是一种具有未配对电子的化学物种，它可以是中性的、带负电荷的或带正电荷的，（2）所有自由基都不是氧化剂，（3）所有氧化剂都不是自由基。因此，超氧阴离子（一种自由基）可减少铁离子（Fe⁺³)产生亚铁离子（Fe⁺²)在脂质过氧化系统和过氧化氢（H₂O（运行）₂或HO-OH）、氧化剂但不是自由基。还可以看出，这些氧代谢物的半衰期从纳秒到分钟变化很大。此外，活性氧物种具有不同的与分子反应的能力。超氧阴离子和过氧化氢被认为没有羟基自由基那么活泼，羟基自由基是所有自由基中反应性更强的自由基之一。这些活性氧物种容易与膜、表面蛋白和跨膜糖蛋白中的脂质反应，从而损害细胞功能。单线态氧是一种特别具有破坏性的氧代谢产物。单重态氧是由光敏反应产生的，其中一个特定的分子（称为敏化剂）吸收给定波长的光，从而激发分子。敏化剂增加的能量，称为三重态，可以转移到分子氧，产生单重态氧，它可以攻击膜或其他细胞成分。大自然利用几乎所有植物中发现的类胡萝卜素的保护特性来对抗这些破坏性现象[20,21]. 虽然类胡萝卜素可以清除其他自由基，但类胡萝卜素的主要功能是清除主要由光敏作用产生的单线态氧。这被认为是叶黄素和玉米黄质对视网膜黄斑区的保护作用。

在单独的窗口中打开

图2

氧衍生代谢物的生物化学。图中显示了氧转化为各种氧化剂和自由基的基本元素和反应。主要的氧衍生代谢物包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧。还显示了近似半衰期（t_1/2)针对每种代谢物。

虽然氧自由基的化学在理论上令人感兴趣，但事实是，这些分子中的许多是作为正常生理学的副产物产生的。图3提供了这些氧化剂和自由基的内源性来源的简短列表。当组织遭受缺血，然后再复氧时，通过酶产生活性氧可以产生自由基。呼吸爆发是一种众所周知的现象，炎症细胞利用以氧为中心的自由基杀死微生物。与视网膜/RPE/脉络膜复合体更相关的例子是图3这些内源性来源包括线粒体代谢、杆外段吞噬作用、脂褐素光毒性和原卟啉光敏化。事实上，众所周知，在视杆细胞和视锥细胞的内段有高密度的线粒体和高呼吸速率，并且外段尖端含有高含量的PUFAs，被RPE吞噬[22–26]. 视网膜光感受器和视网膜色素上皮似乎生活在一个氧化剂和自由基生成的环境中，尤其是在白天。

在单独的窗口中打开

图3

氧自由基的细胞来源。上面列出了细胞中的一些酶催化反应和活性，已知这些反应和活性会产生氧化剂和氧自由基。与感光细胞/RPE复合体特别相关的是以红色突出显示的四种活动。

抗氧化剂/保护剂

细胞中含有许多抗氧化剂，它们在保护细胞免受光、氧和其他氧化损伤刺激物引发的危险反应中发挥着各种作用。主要的水溶性抗氧化代谢物是谷胱甘肽（GSH）和维生素C。它们主要在细胞质和线粒体中进行抗氧化活性。GSH是一种天然存在的三肽，通过非酶反应或谷胱甘苷过氧化物酶催化的反应起到过氧化物还原剂的作用[27]. 谷胱甘肽过氧化物酶的主要活性由硒酶催化，硒酶对脂肪酸氢过氧化物、磷脂氢过氧化物、胆固醇氢过氧化物和过氧化氢具有活性。谷胱甘肽还可用于解毒脂质过氧化产生的活性醛类。谷胱甘肽的主要性质包括：（1）在氮中稳定；（2） 它经历了金属催化氧化；（3） 其氧化产物GSSG（氧化型谷胱甘肽）在生理温度和pH下是稳定的；（4） GSH和GSSG都不容易通过膜；（5）谷胱甘肽还原酶和葡萄糖的细胞代谢（磷酸己糖分流途径）和其他底物通过众所周知的NADPH依赖性途径将GSSG还原为GSH。表1结果表明，GSH还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）均存在于大鼠视网膜、大鼠杆外段、牛杆外段和培养的人RPE细胞中。因此，这些细胞具有将GSSG还原为GSH的活性系统，并保持其抗氧化能力。

维生素C是第二大水溶性抗氧化剂。像谷胱甘肽一样，维生素C在氮中是稳定的，并且会经历金属催化氧化。然而，在生理温度和pH条件下，氧化产物在水溶液中不稳定[13]. 脱氢抗坏血酸（DHA，t_1/2pH=7.4和37°C时为3-5分钟）是一个潜在的问题，因为这是唯一一种以谷胱甘肽依赖性方式还原为维生素C的氧化产物[13]. 在一系列广泛的实验中，Winkler等人[13]研究表明，DHA的自发降解限制了培养的人类RPE细胞在氧化挑战后再生维生素C的能力，除非培养基中含有维生素C（或DHA）。结果表明，维生素C（或DHA）的跨膜转运对于维持其在这些细胞中的水平和抗氧化能力是必要的。

除了这些作为细胞抗氧化剂的代谢物外，细胞还含有几种水溶性酶，它们也可以作为抗氧化剂。如前所述，谷胱甘肽过氧化物酶催化GSH和H之间的反应₂O（运行）₂生产GSSG和水。此外，H₂O（运行）₂可以被过氧化氢酶转化为水和氧气。谷胱甘肽过氧化物酶具有较低的K_米对于H₂O（运行）₂过氧化氢酶的比活力可以比谷胱甘肽过氧化物酶的比活性高出四倍，尤其是在过氧化物浓度大于1 mM时。虽然可能还不太清楚，但过氧化氢也可以通过与维生素C直接反应而转化为水；这种反应也会导致DHA的形成。超氧化物阴离子通过涉及超氧化物歧化酶的酶歧化还原为过氧化氢。H₂O（运行）₂由超氧化物歧化酶作用产生的产物可以通过上述几个反应转化为水。

主要的脂溶性抗氧化剂是维生素E和类胡萝卜素。维生素E是膜中主要的断链脂溶性抗氧化剂，因此预计在减少PUFA氧化影响方面发挥最重要的作用。维生素E和类胡萝卜素都能清除自由基，尤其是羟基自由基和单线态氧。维生素E和选定类胡萝卜素的显著特征和结构分别显示在图4和图5这两种化合物在氮中稳定，但在氧中不稳定。维生素E通过与维生素C的氧化还原偶联进行回收。黄斑类胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质吸收蓝光，防止RPE受到短波长损伤。在“休息”状态下，抗氧化剂的还原形式通常占其细胞内总含量的95-99%。这是对细胞保持适当氧化还原状态的非凡能力的赞扬，即使面对持续的氧化挑战。当各个防御系统的能力被增强或延长的氧化挑战所克服时，由此产生的氧化状态变化通常被视为早期损伤的标志，这是氧化损伤和AMD模型中的一个关键因素。

在单独的窗口中打开

图4

维生素E的基本性质和结构维生素E及其自由基清除剂作用的关键事实；维生素E的结构。

*一组八种脂溶性化合物

*α-生育酚是生物活性最强的形式

*从肠道吸收到淋巴管

*保护脂质免受过氧化损伤

*一种与·O反应的链式抗氧化剂₂^{− 1}O（运行）₂过氧（ROO·）和烷氧基（RO·）自由基

*主要脂溶性抗氧化剂保护膜和脂蛋白免受损伤

*维生素E·（自由基形式）被维生素C还原为维生素E

在单独的窗口中打开

图5

类胡萝卜素的基本性质和结构。黄斑类胡萝卜素叶黄素和玉米黄质的基本性质；黄斑类胡萝卜素的结构与其他类胡萝卜素进行了比较。

*吸收蓝光，抵御短波可见光

*淬火单线态氧

*光敏剂的猝灭三重态

*抑制脂质的自氧化

*β-胡萝卜素，一种低磷高效抗氧化剂₂; 假设黄斑类胡萝卜素也是如此

*遭受自动氧化

*在正常人和猴视网膜中检测到少量氧化产物

脂褐素的体外光毒性

脂褐素在高代谢、有丝分裂后细胞中的终身累积被认为是导致人类多种年龄相关和病理状况的原因[5,7]然而，对于脂褐素是如何影响细胞功能的，存在着相当大的争议。一些人认为脂褐素是一种惰性物质，直接通过充血细胞质发挥作用（脂褐素在某些组织中可以占据30%的细胞体积[7])而其他人则认为脂褐素是有毒的，是活性氧的来源[5,28–30]或释放溶酶体胺[31]. 还有一些证据表明维生素A代谢物（光感受器外段的主要成分）在脂褐素的发育和光活性中也很重要[31–33]. 首先，大鼠体内脂褐素的积累取决于维生素A的饮食水平[34]. 其次，对脂褐素的主要溶剂可萃取荧光团的分析被认为是视黄醛和乙醇胺的希夫碱反应产物[31,35]. 因此，脂质过氧化物和维生素A都可能是RPE中脂褐素形成的主要底物。

Boulton等人[36]证明RPE脂褐素是一种光诱导自由基发生器。RPE脂褐素颗粒的白光照射导致产生超氧阴离子，其产生速率随着光照强度的增加而增加。这种效应与波长有关；与红光（660-730nm）或全白光相比，蓝光（400-520nm）照射下的颗粒产生的超氧阴离子最多。随后的研究发现，在有氧条件下，除了超氧阴离子外，脂褐素还能够光生成大量的各种活性氧物种，包括单线态氧、过氧化氢和脂质过氧化氢[37–39]. 使用激光闪光光解显示[31]脂褐素和合成荧光团（A2E）都能产生激发的三重态和自由基物种，其寿命足够长，可以与包括基态单重态氧在内的其他具有生物学意义的分子相互作用(^三O（运行）₂) [40]; 这与Gaillard等人的观点一致[39]. 通过激发单线态氧的形成观察到了这种反应(¹O（运行）₂)它被公认为一种强氧化性和破坏性物种，可以与DNA、蛋白质和脂质反应，损害细胞功能，并有助于细胞衰老。此外，脂褐素疏水组分形成单线态氧的作用光谱表明，这一过程与波长密切相关，与420 nm和520 nm相比，其效率随波长增加而降低10倍[38].

脂褐素通过光诱导产生活性氧支持了光照射、视网膜老化变化和视网膜变性之间的假设关系[41]. 虽然很难比较慢性低水平光（小于0.1 mW/cm）的效果²)在短时间的强烈暴露下，很明显两者都可能有助于脂褐素形成活性氧物种。在使用条件下（光照=1 mW/cm²)可以对超氧阴离子进行以下推断[36]：（1）一个脂褐素颗粒可以产生8×10⁻¹⁹mol超氧阴离子/min；（2） 因为1摩尔=6.02×10²³分子，那么单个颗粒能够产生4.8×10⁵超氧化物分子/min；（3）如果电池的平均体积为2000μm^三高达19%的体积被脂褐素颗粒占据[6]直径为1μm，则每个RPE电池的容量为3.5×10⁸超氧阴离子/细胞/分钟。这种高水平的自由基产生可能解释为什么RPE含有高浓度和多种抗氧化剂[5,13].

脂褐素产生活性氧的光谱依赖性（与其他可见光谱区域相比，暴露在蓝光下的颗粒产生的活性氧最大）可能解释了所谓的视网膜“蓝光危害”。波长低于550 nm时，延长的辐照度会产生光化或光化学损伤，但太低而无法产生热效应[42]. 这些光化学损伤在RPE水平上表现突出，并且已经注意到“蓝光损伤”的作用光谱与两种黑色素的宽带吸收光谱非常相似[41]和脂褐素[5,43]. 对新鲜分离的人RPE细胞蓝光光活性的分析表明，随着供体年龄的增加，氧光吸收速率显著增加，这种光吸收主要是由于脂褐素引起的[37]. 这些观察结果表明脂褐素在细胞中具有不利的功能作用，并可能解释高水平脂褐素与AMD之间的关系。RPE特别富含抗氧化剂，这些抗氧化剂可能足以解毒任何活性氧物种[5,13,28]. 相反，抗氧化剂可能不足以消除所有自由基的毒性，并且在整个生命周期中可能会有一种只在老年人身上表现出来的潜在的氧化损伤积累。

还观察到，脂褐素光敏反应导致颗粒内脂质过氧化增强，这是通过脂质过氧化氢和丙二醛在发光色素颗粒中的积累来测量的[37,44]. 这种过氧化反应与“漂白”有关，即通常与脂褐素相关的氯仿可溶荧光团不再存在。更重要的是，脂褐素还能够对脂质进行粒外过氧化并使酶失活。与对照组相比，用可见光孵育的新鲜分离的脂褐素颗粒诱导脂质过氧化增加30%。在光照下，将颗粒与抗氧化剂（过氧化氢酶）和溶酶体（酸性磷酸酶）酶孵育，活性分别降低50%和30%。抗氧化剂可以防止脂质过氧化和酶活性的丧失，证实脂褐素引起的光损伤是由活性氧物种引起的。

利用光物理分析揭示的脂褐素的光毒性潜力研究随后扩展到细胞系统。使用了两种方法；第一个在培养的RPE细胞中通过给细胞喂食杆外段而产生脂褐素样颗粒[45]第二种是通过喂食分离的人脂褐素颗粒来重染培养的RPE细胞[46]. 一旦确定积累的自体荧光颗粒虽然与天然RPE脂褐素具有某些光谱相似性，但在组成荧光团的溶解度和色谱流动性方面表现出重大差异，则第一种方法被认为是不合适的[33]. 因此，对重新着色的RPE细胞进行了所有进一步的研究。

简言之，喂食分离的脂褐素颗粒（300粒/细胞）的培养人RPE细胞和缺乏颗粒的对照细胞要么保持在黑暗中，要么暴露在0.1–2.8 mW/cm辐照度的“蓝色”光（400–550 nm）或“琥珀色”光（550–800 nm）下²在37°C下持续14天。然后评估细胞的形态、细胞活力、溶酶体稳定性和脂质过氧化的变化。暴露于蓝光和脂褐素都会导致单层细胞的时间依赖性丢失，剩余的细胞表现出细胞形态的改变、空泡化增加和膜起泡[47]. 与对照细胞相比，细胞活力呈时间依赖性下降；在24小时和48小时时，细胞活力分别下降了1.5倍（p=0.01）和2.5倍（p=0.001），同时溶酶体稳定性也随之下降(图6). 这与脂质过氧化终产物丙二醛和4-羟基壬醛增加两倍有关。受损细胞的形态学变化表明细胞凋亡。对照培养物保持不变。暴露于脂褐素和“琥珀色”光的细胞在整个实验期间保持存活，这表明光毒性效应是波长特异性的。

在单独的窗口中打开

图6

显示脂褐素光毒性的直方图。喂食脂褐素的RPE细胞要么保持在黑暗中（黑条），要么暴露在光照下（金条）：一.蓝光（400–550 nm）；B类.琥珀色光（550–800 nm）持续48小时。使用MTT分析测定细胞活力[47]. 竖线表示平均值的标准误差。

总之，现在有令人信服的证据表明，脂褐素是一种光诱导的活性氧生成物，可以破坏溶酶体的完整性，诱导脂质过氧化，并导致RPE细胞萎缩。这些观察支持脂褐素在RPE老化和AMD发展中的作用。

AMD和光敏化

光敏化是一种通过使用人工光敏剂治疗某些类型的癌症和血管形成来破坏组织的机制。但是光敏化会导致人类疾病吗？在某些卟啉症中，会发生光敏反应，从而对暴露在阳光下的区域造成损害，例如皮肤[48]. 最近有人提议[9]AMD是由脉络膜毛细血管的光敏损伤引起的；慢性低水平的活性氧暴露于脉络膜毛细血管内皮可诱导IV型胶原合成，进而加厚布鲁赫膜和脉络膜毛细血管间隔。其他人认为视网膜血供受损在血栓形成和AMD的发展中起作用[49].

Gottsch等人[50]已经建立了一种慢性低水平光敏损伤脉络膜毛细血管的动物模型。原卟啉小鼠模型用于布鲁赫膜和脉络膜毛细血管内皮基底膜增厚[51]. 在原卟啉小鼠模型中，原卟啉IX增加约10倍，暴露于蓝光（380–430 nm，14μW/cm²)，脉络膜毛细血管和视网膜下RPE基底层样沉积呈时间和光依赖性增加(图7). 与对照组相比，暴露在蓝光下7个月时，原卟啉小鼠的布鲁赫膜显示出100%的增厚(图8). 这种增厚延伸到脉络膜毛细血管内皮的整个基底膜。在脉络膜毛细血管基底膜的水平上可以看到一条均匀的电子致密物质厚带，沿着布鲁赫膜的内侧可以看到大小不等的电子致密纤维颗粒沉积物(图9). 重要的是，RPE和杆外节的超微结构没有证据表明实验动物或光照和黑暗对照组中存在光诱导变性或其他异常。

在单独的窗口中打开

图7

原卟啉小鼠模型中的绒毛膜毛细血管。原卟啉IX约增加10倍并暴露于蓝光（380–430 nm，14μW/cm）下的原卟啉鼠模型中²)，脉络膜毛细血管和视网膜下色素上皮基底层样沉积呈时间和光依赖性增加（见箭头）。

在单独的窗口中打开

图8

小鼠正常绒毛膜毛细血管。在黑暗对照组中，未发现绒毛膜毛细血管基底膜增加。

在单独的窗口中打开

图9

原卟啉症小鼠模型中的视网膜下色素上皮沉积。原卟啉病小鼠模型暴露于蓝光下，显示视网膜下色素内皮纤维粒状沉积（白色箭头），纤维长达16 nm，周期为13 nm。

用预包埋电子免疫细胞化学染色法显示IV型胶原，比较光处理原卟啉小鼠和光处理对照动物的脉络膜毛细血管基底膜和RPE。数据显示绒毛膜毛细血管基底膜的IV型胶原特异性染色与绒毛膜毛细血管内皮开窗周围的强烈染色(图10). 原卟啉症小鼠的RPE基底膜只有很弱的染色。毛细血管基底膜的IV型胶原增厚且不规则，提示IV型胶原过度沉积。然而，与标准饮食中的光照对照动物相比，光照原卟啉小鼠RPE基底膜中IV型胶原的染色强度没有显著变化。

在单独的窗口中打开

图10

原卟啉症小鼠模型中绒毛膜毛细血管的IV型胶原染色。绒毛膜毛细血管基底膜的IV型胶原蛋白特异性染色在色素毛细血管内皮窗周围尤其显著。

使用培养细胞的长期光照进行其他实验。将胎牛主动脉内皮细胞和RPE细胞与光敏剂原卟啉IX（PP IX）和116×10⁻³流明/厘米²在带有反馈控制的光照培养箱中，将温度保持在37°C。^三将H-脯氨酸和L-脯氨酸（1 mM）添加到培养基中，以获得一致的标记环境。使用生理浓度为1.5μg/ml的PP IX，在该浓度下，细胞生长受到最小程度的抑制，细胞培养形态学外观保持不变。分别处理细胞颗粒以获取总蛋白和非胶原蛋白。利用带宽为480–900 nm的陡峭截止彩色滤光片进行蓝光过滤实验。β-胡萝卜素以珠状物的形式获得，并悬浮在去离子水中。与暴露于PP-IX和黑暗（p=0.0004）、光照对照（p=0.003）和黑暗对照（p=0.003）的细胞相比，光照和PP-IX使胶原合成增加；比较采用双尾学生t检验(图11). 使用蓝光滤光片消除了450纳米以下的辐射。通过增加较长波长的辐射，所传递的总能量保持不变。

在单独的窗口中打开

图11

光敏化后胶原蛋白合成增强。与暴露于PP-IX和黑暗（p=0.0004）、光照对照组（p=0.003）和黑暗对照组（p=0.003；图10). 使用蓝光滤光片消除了450纳米以下的辐射。通过增加较长波长的强度照射，所传递的总能量保持不变。

可以对此模型进行某些预测。该模型预测AMD与阳光照射有关。总日照曝光量的累积可能并不重要，但光敏波长的曝光量可能很重要。如果卟啉作为光敏剂参与进来，那么蓝光区域的Soret带（390–440 nm）必然会参与进来。尽管有关阳光照射和AMD的文献存在冲突，但Taylor等人[52]这表明，在对切萨皮克湾Waterman的研究中，晚期AMD与蓝光暴露存在相关性。因此，光，特别是在特定波段的光，可能在这种疾病的病因中很重要。

该模型预测类胡萝卜素对AMD有保护作用。在NEI赞助的一项关于新生血管性AMD发病风险因素的多中心研究中，发现血清类胡萝卜素的减少对该病患者非常重要[53]. 如前所述，类胡萝卜素以其清除单线态氧的能力而闻名，而光敏反应是单线态氧气的主要来源。该模型还预测，这种疾病在色素沉着较浅的个体中更为普遍，因为RPE中的黑素小体较少。这种色素可能会阻止光敏波长穿透脉络膜毛细血管内皮。黑人和白人在AMD发病率方面存在种族差异[54]，并且AMD在深色眼睛中的观察频率低于浅色眼睛。

该模型还预测，原发性损伤的部位不是视网膜色素上皮，而是脉络膜毛细血管。老化视网膜的组织病理学研究表明，Bruch膜增厚，脉络膜毛细血管网阻塞，这是AMD眼科证据出现之前的病理变化。最重要的是，在最近一项对布鲁赫膜和脉络膜毛细血管的研究中，将老年黄斑与晚期AMD患者进行了比较，发现晚期AMD的患者脉络膜毛细血管网收缩明显更大，而脉络膜毛细管密度降低[55]. 许多研究人员认为，视网膜血流的这种损害与水肿的形成和AMD的发展有关。

最后，该模型预测AMD患者增厚的Bruch膜中会发现IV型胶原。有趣的是，在皮肤光敏化的小鼠模型中，皮肤毛细血管周围有IV型胶原形成[56]. 在最近对老年人黄斑IV型胶原和层粘连蛋白进行免疫标记的研究中，IV型胶原在脉络膜毛细血管基底膜中呈强阳性[57]. 在另一项研究中，脉络膜毛细血管基底膜的粗大增厚归因于IV型胶原的沉积[58]. 该研究得出结论，只有IV型胶原的沉积才有助于布鲁赫膜的增厚。

总之，基于脉络膜毛细血管的光敏损伤，提出了AMD发病机制的模型。该模型能够产生AMD中发现的某些病理特征，如基底膜增厚和RPE中的纤维基底层样沉积。

谷胱甘肽、氧化损伤和RPE

Sternberg等人[59]评估了用叔丁基过氧化氢（t-BHP）培养培养的人RPE细胞的效果。他们的结果表明，谷胱甘肽及其氨基酸前体都能保护机体免受氧化损伤。氨基酸提供的保护似乎是通过谷胱甘肽介导的，因为单个氨基酸不起保护作用，而抑制谷胱甘苷合成则消除了保护作用。其他研究表明，外源性谷胱甘肽也可对抗t-BHP诱导的损伤，其机制显然与氨基酸不同。这是基于GSH合成和降解抑制剂对GSH保护作用的缺乏。此外，完整的谷胱甘肽不会被RPE细胞吸收，保护所需的谷胱甘肽浓度仅为所需氨基酸浓度的十分之一[60].

数据表明，外源性谷胱甘肽可能通过保护细胞外表面免受氧化剂的影响而发挥作用。这种保护的一种可能机制包括细胞膜的稳定和膜蛋白的保护，例如在运输系统中。然而，实验未能证明GSH对Na-K ATP酶的活性有任何影响，无论是否用t-BHP处理RPE细胞。此外，谷胱甘肽并不能通过增加人类RPE细胞清除过氧化氢的速率来防止氧化损伤（Sternberg，未发表的观察结果）。

Samiec等人[61]评估血浆中GSH相关硫醇水平的浓度。血浆谷胱甘肽随着年龄的增长而降低，同时谷胱甘苷含量也随之增加。氧化还原状态（E_小时)GSH与GSSG之比(图12)随着年龄的增长，血浆胱氨酸水平增加，表明GSH/GSSG的整体氧化还原状态趋于更加氧化。在两组年龄匹配的患者中测量GSSG和总谷胱甘肽（GSH+GSSG）的水平：一组是AMD患者，另一组是除AMD外的视网膜疾病患者。老年人（AMD、糖尿病、对照组）的血浆GSH水平显著低于年轻人。只有糖尿病患者的谷胱甘肽总量显著降低。

在单独的窗口中打开

图12

随着年龄增长、AMD和糖尿病，谷胱甘肽氧化还原状态发生变化。计算的氧化还原电位（E_小时)用于年轻和老年对照组以及AMD或糖尿病患者血浆中的谷胱甘肽池。E的值_小时计算为E_小时=E_o个+RT/ZF ln（[GSSG]/（2[GSH]）），其中E_o个取0.24 V[61]，R是通用气体常数，T是绝对温度，Z是化合价，F是法拉第常数。

还试图操纵RPE细胞中的谷胱甘肽含量。口服时，谷胱甘肽在血液中吸收不良。当在组织培养中给药时，GSH不会被转运到人类RPE细胞中。对单功能诱导剂富马酸二甲酯（DMF）的初步研究表明，该药物刺激谷胱甘肽合成，并以剂量依赖性的方式提高细胞内谷胱甘氨酸水平。RPE细胞中的GSH水平随着γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GSH合成中的限速酶）mRNA表达的增加而升高。DMF还保护培养的RPE细胞在缺乏GSH的情况下免受氧化损伤(图13). 然而，当检查GSH刺激的时间过程时，细胞内GSH的初始下降似乎先于浓度的升高。最近，Sternberg等人（未发表的观察结果）使用了另一种诱导剂，即抗血吸虫药物oltipraz。该化合物已被证明能增加其他细胞系统中的细胞内谷胱甘肽水平，并似乎能诱导RPE细胞中谷胱甘苷含量的增加。初步迹象表明，oltipraz不会像DMF一样导致谷胱甘肽含量的早期下降。这些研究表明，这些诱导剂在促进谷胱甘肽抗氧化活性方面具有潜在作用，无需直接补充合成谷胱甘氨酸所需的谷胱甘苷或氨基酸前体。

在单独的窗口中打开

图13

富马酸二甲酯保护培养的RPE细胞免受氧化损伤。用0.1 mM富马酸二甲酯（DMF）预处理24小时可保护培养的人RPE细胞免受与毒性剂量的叔丁基过氧化氢（tBHP）相关的氧化损伤。通过测量乳酸脱氢酶从细胞泄漏到培养基中的程度来确定细胞的活性。

在最后一组初步实验中（Sternberg，未发表的观察结果），对培养的人RPE细胞在氧化条件下进行了形态学和生物化学变化的检测。这些研究表明，t-BHP引起RPE细胞的许多变化，包括胱天蛋白酶激活、核缩合、TUNEL阳性染色和细胞表面磷脂酰丝氨酸的出现。所有这些发现都与氧化诱导细胞死亡的凋亡机制相一致。最近发现线粒体在细胞凋亡信号传导中起重要作用[62]. 随着年龄的增长，有丝分裂后细胞（如RPE）中的线粒体在线粒体DNA中积累大量缺失和重排[63]. 在这方面，用t-BHP处理的RPE细胞显示线粒体膜电位早期下降，表明线粒体通透性发生转变[64]. 此外，细胞色素c的释放与线粒体膜电位的丧失有关，半胱氨酸天冬氨酸酶的激活发生在一个与蛋白质断裂一致的时间过程中，这可能有助于细胞凋亡的形态学图像[65]. 这些发现表明，氧化诱导的凋亡可能是线粒体通透性转变的结果。

总之，目前对AMD的病因或发病机制还没有明确的认识，也没有对绝大多数患者进行有效的治疗。实验旨在评估谷胱甘肽保护RPE细胞免受氧化损伤的机制。一种有趣的方法是使用膳食诱导物刺激谷胱甘肽的合成，以此来提高靶细胞中这种抗氧化剂的水平。最后，对人体血浆的研究表明，随着年龄的增长，谷胱甘肽氧化还原电位会转变为更氧化的状态，从而增加谷胱甘苷与谷胱甘氨酸的比率，并使所有组织都面临与年龄相关的疾病的风险，如AMD。目前关于这一主题的工作集中在评估操纵硫醇氧化还原状态以增强对氧化损伤的保护的最佳方法。

总结

活性氧物种对细胞的细胞质和核元素造成氧化损伤，并引起细胞外基质的变化。氧化损伤的程度受到一系列有效抗氧化剂和受损元素修复的限制。然而，会发生一些氧化损伤，并且这种损伤在一生中的累积被认为是组织老化的主要促成因素。视网膜是一个典型的例子，其中氧化损伤表现为我们所称的“视网膜老化”，包括视网膜细胞的丢失、视网膜色素上皮内脂褐素的积累、血栓形成、布鲁赫膜内降解产物的积累以及脉络膜毛细血管的变化。一旦这些变化变得过度，就被认为是AMD发病的原因之一。本文支持氧化诱导事件与AMD发病之间存在联系的假设，并证明：（1）“年龄色素”脂褐素对RPE细胞具有光毒性，（2）内源性和外源性谷胱甘肽在保护RPE细胞免受氧化损伤方面起主要作用，（3）类胡萝卜素可防止氧化损伤，（4）小鼠脉络膜毛细血管的氧化损伤可导致与AMD相似的病理变化。由于AMD的复杂病理生物学及其对人类灵长类动物的限制，难以明确证明；希望正在进行的抗氧化剂临床试验将在不久的将来澄清这个问题。

鸣谢

工具书类