强度增加的淋巴衰竭和过继免疫治疗——我们能走多远？

总结

介绍

在小鼠和人类身上进行的实验已经证实，免疫系统可以破坏，在某些情况下甚至可以破坏已经形成的非常大的肿瘤。白细胞介素（IL-）2治疗对大约10-20%的黑色素瘤患者有效^1,2,三,4或肾细胞癌。²不幸的是，迄今为止，肿瘤特异性主动免疫治疗（即疫苗接种）的临床试验令人失望，无论组织学如何，客观应答率均为5%或更低。⁵有效的治疗性疫苗接种受到许多因素的限制，包括胸腺阴性选择导致针对自身抗原的抗原特异性T细胞前体缺乏或频率低和亲和力低，^6,7以及各种外周抑制机制。^7,8,9,10即使在免疫开始时没有临床或放射学疾病证据的高危癌症患者中产生大量特异性T细胞，肿瘤的生长也显然无法预防。¹¹与此同时，基于过继细胞转移（ACT）的免疫治疗的使用显然可以克服阻碍当前基于疫苗的方法的许多障碍。使用ACT，大量在体外扩增和激活的肿瘤特异性T细胞可以迅速进入患者的免疫系统。^12,13不幸的是，多种因素，包括肿瘤免疫逃避、体内平衡和诱导耐受，以及转移的T细胞质量不佳，阻碍了在其他方面有希望推动肿瘤排斥的尝试。^14,15,16

最近，据报道，根据RECIST标准，转移性黑色素瘤患者使用在体外环磷酰胺和氟达拉滨的非清髓性淋巴消耗制备方案后，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和IL-2扩增。^17,18这一重大成就归功于一个关键的认识，即宿主的免疫系统需要得到适当的调节，以创造一个没有调节机制的适当“淋巴空间”。因此，淋巴细胞耗竭使宿主能够容纳转移的T淋巴细胞，并使这些细胞比其他竞争细胞群具有优势。^19,20

免疫功能减退和ACT尚未在随机研究中进行测试，但最近使用这些方法进行的临床试验的结果是显著的，因为它们的反应率前所未有，而且所研究的患者之前未能通过其他免疫治疗模式，包括大剂量IL-2和ACT；¹⁷然而，当前方法的成功主要局限于黑色素瘤患者，我们还远远没有为大多数患者提供治疗。需要作出更多努力，以开发可靠有效、易于实施和获取的治疗方案，同时保持可接受的安全性和毒性特征。在这里，我们讨论了过继免疫治疗的临床应用的最新进展，包括淋巴消耗调节的理论和临床前基础。我们根据动物数据推测，对患者进行更多的免疫消融可能会进一步增强抗肿瘤作用。我们还将应用异基因和自体干细胞移植相关领域的经验，讨论与制定这一新策略相关的安全问题。

过继性细胞移植治疗——近期临床经验

ACT被认为是一种提供大量肿瘤特异性T细胞的方法，这些T细胞被扩增和激活在体外在一些早期试验中，CD8⁺黑色素瘤抗原MART-1和gp100的特异性T细胞克隆可以从患者中持续产生，但在ACT后T细胞克隆迅速下降，患者未能产生有意义的临床反应。^15,16另一种方法是使用从手术切除的肿瘤中获得的TIL，这些TIL被激活并扩增在体外利用异基因饲养细胞、OKT-3单克隆抗体和IL-2。²¹这些培养的细胞对人类白细胞抗原（HLA）A2黑色素瘤细胞系和自体肿瘤具有高度反应性，但在ACT和高剂量IL-2（每8小时720000 IU/kg；总有效率34%）治疗后仅表现出中等成功率。单独使用环磷酰胺预处理方案（25 mg/kg）并没有显著增加总有效率。

根据动物数据，已经假设淋巴耗竭可以提高过继转移T细胞的有效性，并且对受体免疫环境的操纵可以改善治疗结果。²²这一假设已经在一系列接受过严重预处理的难治性非霍奇金淋巴瘤患者的血液恶性肿瘤中进行了临床试验，这些患者接受了自体淋巴细胞的输注体外大剂量化疗和自体CD34后与抗CD3和抗CD28培养⁺干细胞移植。观察到淋巴细胞室迅速恢复，在某些情况下出现明显的延迟性淋巴细胞增多。²⁰一种类似的方法已被用于传统治疗难治的转移性黑色素瘤患者。¹⁷患者接受了由环磷酰胺（60 mg/kg，持续2天）和氟达拉滨（25 mg/m）组成的高度消耗淋巴的预处理方案²5天）。患者随后接受高剂量IL-2治疗。一些患者还接受了第二次T细胞输注。根据RECIST标准的客观回答²³在13名接受治疗的患者中，有6名（47%）出现了混合反应，另外4名患者仅在疾病的某些部位出现了下降。大多数应答者表现出抗黑素细胞自身免疫，包括白癜风和葡萄膜炎。分子分析和在体外功能数据首次显示，一些患者发生了显著的转移后克隆性淋巴细胞增多症（其中一例在第7天高达21000个细胞/μl），长期持续性强，T细胞储备明显偏向于过继注入的肿瘤反应人群。¹⁶这些发现与之前发表的过继转移T细胞持续存在的令人沮丧的观察结果形成了鲜明对比，这些观察结果仅在数小时或数天后通过聚合酶链反应无法检测到。^16,24

2年后公布了同一方案的后续研究。²⁵该试验共包括35名患者，总体客观反应为51%-3个完全反应和15个部分反应。正如预期的那样，观察到的毒性是由于高剂量IL-2输注和骨髓抑制所致。所有患者通过支持性护理从这些初始毒性中恢复。一名患者死于EBV淋巴增殖性疾病。外周血淋巴细胞计数的最低值出现在转移当天，中位数为17个细胞/μl。在一些患者中，在移植后的第一周内，甚至在单核细胞恢复的最早证据出现之前，就出现了短暂的淋巴细胞增多。CD4⁺治疗后至少1年，T细胞计数显著减少，而CD8的数量⁺细胞略有增加，并逐渐恢复正常。²⁵

免疫耗竭的原理

淋巴减少状态增强过继转移T细胞功效的概念已经知道20多年了，尽管长期以来其机制尚不清楚。20世纪80年代早期，研究表明，只有当接受胸腺切除术和放射治疗的T细胞缺乏时，肿瘤致敏淋巴细胞的ACT才有效。²⁶在另一个型号CD8中⁺从MCA 205肉瘤小鼠肿瘤引流淋巴结中分离的T细胞在全身照射（TBI）后积极增殖并排斥肺转移。²⁷

我们利用表达pmel-1型T细胞受体（TCR），对小鼠gp100黑色素瘤相关抗原具有特异性。²⁸令人惊讶的是，尽管肿瘤特异性CD8的频率很高，但这些小鼠对B16黑色素瘤的生长没有保护作用⁺T细胞（>90%）。通过过继转移pmel-1型T细胞，但成功的治疗还需要给予IL-2和用改变的（人gp100）肽配体疫苗进行有效的疫苗接种。²⁸加蒂诺尼等.最近显示了淋巴细胞耗竭对ACT在该模型中的应用的显著影响。²¹尽管在未受照射的受试者中观察到治疗反应，但亚致死剂量（5Gy）受试者的治疗效果显著改善。

多种机制解释了上述观察结果(图1). 淋巴隔室的大小受到稳态因素的严格控制，包括接触抗原呈递细胞（APC）和主要组织相容性复合体（MHC）以及自身和抗原肽，以及不同宿主T淋巴细胞（包括调节细胞CD4）的直接影响⁺CD25型⁺FOXP3公司⁺T型_规则以及IL-2、IL-7、IL-15和IL-21等细胞因子的竞争。^{29,30,31,32,33,34,35,36}T细胞，特别是那些具有原始表型的T细胞，在转移到淋巴减少宿主后，会经历一个称为稳态扩张（淋巴减少诱导的稳态增殖）的过程。这种扩张被认为是由稳态细胞因子和暴露于自身肽和其他抗原所致。在此过程中，原始T细胞将其表型转变为激活/效应细胞（例如CD44^高的，CD62L^低的和CD122^高的)并获得效应器能力，如所示在体外γ干扰素的产生和细胞溶解功能。^37,38,39,40由稳态因子驱动的T细胞活化可能导致淋巴细胞减少宿主的自身免疫（例如结肠炎的发生⁴¹或非肥胖糖尿病小鼠的糖尿病⁴²)或自相矛盾地促进移植物排斥反应。⁴³类似地，CD8⁺当T细胞转移到免疫缺陷小鼠体内时，可以获得抗肿瘤特性。⁴⁴

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图1

淋巴衰竭的理论基础

(A类)在免疫补体宿主中，内源性细胞可以通过至少三种机制抑制过继转移的T细胞。（1） T细胞、B细胞和NK细胞竞争稳态和激活细胞因子，如IL-2、IL-7和IL-15。（2） T型_规则NK细胞和其他免疫细胞群（如巨噬细胞）可能通过直接细胞间接触或释放抑制性细胞因子显示抑制活性。（3） 未成熟树突状细胞可能无法激活或甚至可能使过继转移的T细胞失活，从而限制抗肿瘤反应。（4） 肿瘤本身可能是T细胞激活的负调节因子，它可以主动产生调节分子，并且只表达有限数量的主要组织相容性复合体-肽复合体，从而使肿瘤难以识别。⁸(B类)在过继细胞移植之前，通过化疗或全身照射对宿主进行部分（非清髓）免疫耗竭，减少竞争性“细胞因子汇”以及调节因素。(C类)免疫耗竭进一步增加到清髓水平会导致抑制元素和内源性“细胞因子汇”的深度减少。促炎环境激活未成熟DC，尽管其数量进一步减少。此外，预处理方案还可能改变肿瘤本身，促进主要组织相容性复合物-肽复合物的表达，增加可供呈现的肽库和各种共刺激分子的数量。⁵⁴因此，宿主环境的改变可以增强转移的T细胞的活化，更好地识别肿瘤，并最终更有效地破坏肿瘤。缩写：DC，树突状细胞；白细胞介素；NK细胞、自然杀伤细胞；T型_规则，调节性T细胞。

在我们的小鼠癌症治疗模型中，仅仅通过消耗淋巴的制备方案增加肿瘤反应性T细胞数量似乎并没有起到关键作用。²⁰事实上，在设备-1模型显示，受照和未受照宿主的淋巴结、脾脏、血液和肿瘤中肿瘤特异性T细胞的绝对数量没有差异。从受照宿主中恢复的这些T淋巴细胞的功能能力存在显著差异，抗原再刺激后，这些细胞产生更多的细胞因子干扰素-γ、IL-2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子-α。²²综上所述，这些观察结果表明，淋巴细胞减少的环境与T细胞激活阈值的总体降低以及自身免疫倾向有关。

TBI淋巴结扎也降低CD4⁺CD25型⁺FOXP3公司⁺T型_规则这可能有助于效应T细胞激活阈值的降低。⁴⁵T型_规则已证明在小鼠系统和人类对肿瘤的免疫耐受中发挥作用。^46,47,48CD4的过继转移⁺辅助性T细胞选择性耗尽CD25⁺事实证明，在pmel-1型小鼠模型，同时输注CD4⁺CD25型⁺T细胞（包含FOXP3⁺T型_规则人群）对治疗效果产生了深远的负面影响。⁴⁹

除了调节性CD4⁺淋巴细胞、其他细胞元素也会影响ACT的疗效。令人惊讶的是，在加蒂诺尼的作品中等.²²遗传性淋巴细胞减少性RAG的一种已经有效的反应^−/−小鼠（没有任何T细胞，包括T细胞_规则)亚致死剂量照射仍能增强。通过使用单克隆抗体选择性地去除丰富的自然杀伤细胞，在相同宿主中也能获得类似的效果。这一发现表明，消除潜在竞争细胞或“稳态汇”可能会影响对抗肿瘤效应器功能至关重要的细胞因子的可用性。

TBI不仅可能导致淋巴消耗增加，还可能影响T细胞的运输、粘附和协同刺激。例如，在移植物抗宿主病（GVHD）小鼠模型中，辐射导致VCAM1、ICAM1和B7-2上调，提供早期共刺激信号，导致启动肠内异基因T细胞。⁵⁰TBI可显著改变APC的功能。在同种异体移植小鼠模型中，TBI导致宿主树突状细胞（DC）快速活化，上调MHCⅡ类和共刺激分子，分泌IL-12，已知其将T细胞功能导向细胞毒性1型表型和功能。⁵¹尽管TBI后宿主DC数量显著减少，但其最初的瞬时激活足以引起异基因T细胞启动和GVHD严重程度的增加。类似地，已知放射和化疗药物可以调节小鼠和人类肿瘤细胞的免疫原性。⁵²局部照射（10–20 Gy）已被证明在23个人类肿瘤细胞系中的21个中引起MHC I类、FAS、CEA1、粘蛋白1和其他蛋白的上调。⁵³在最近的另一份报告中，电离辐射不仅提高了MHCⅠ类化合物的初始表达，而且还导致了可用于呈现的肽库的增加，进一步增强了新MHCⅠ级复合物的合成。肽库来源于最初受损的细胞结构以及随后的修复过程，这导致了新的独特序列的产生，并提高了对肿瘤的识别。⁵⁴然而，这种局部效应的重要性尚不清楚，因为在我们自己的模型中，TBI期间屏蔽肿瘤并不影响治疗结果。²²

淋巴衰竭的另一个有趣的方面是将这种技术与疫苗接种策略相结合的可能性。淋巴细胞减少状态下的抗原刺激可以有效地将T细胞库转移到抗原特异性细胞。⁵⁵在小鼠模型中，接种T细胞数量急剧增加的淋巴衰竭动物后，抗黑素瘤T细胞的频率是淋巴充足宿主的四倍，并且这些细胞也具有更高的细胞毒潜能在体外和体内.⁵⁶在另一个模型中，用乳腺肿瘤裂解物脉冲的DC在给具有稳态扩张T细胞群的淋巴减少小鼠时更有效地产生反应。⁵⁷最近的一项随机临床试验证实了这一现象的临床相关性，在该试验中，大剂量化疗和自体干细胞移植在早期输注抗菌素后可快速有效地重建特异性抗菌免疫体内底漆和在体外扩增的T细胞。⁵⁸

上述例子显示了ACT前的部分淋巴消融是如何改善治疗的。新的实验数据表明，增加强度的预处理或甚至完全（致命）骨髓消融，然后进行自体（或同基因）造血干细胞拯救，可能会进一步提高治疗效果。⁵⁹在我们的pmel-1型模型中，给予致命剂量的辐射克服了先前的必要条件需要接种疫苗，这是一项具有重要临床意义的观察，因为目前我们转移的TIL的特异性未知，临床级疫苗尚不可用。⁶⁰这种效应的确切机制仍在研究中。更完整地移除T_规则以及“细胞因子汇”和其他调节元件的耗竭也起到了一定作用。骨髓清除预处理和输注T细胞缺失干细胞后的免疫重建相对缓慢，尤其是CD4⁺隔间。^61,62,63

似乎完全消融可能会导致效应器与抑制元件的比例更为有利，从而消除效应器细胞功能的重要障碍。⁶⁰完全消融成功的另一个潜在解释是，高剂量TBI可能只会导致弥漫性组织损伤和全身炎症反应，从而驱动T细胞反应。组织损伤会产生“危险信号”，⁶⁴导致激活DC和其他APC。在胃肠道，TBI导致粘膜损伤，导致细菌移位和脂多糖释放，脂多糖可能通过Toll样受体发挥作用，进一步增强APC的功能，促进T细胞活化和扩张。^65,66,67

为未来试验制定安全的淋巴消耗方案

用环磷酰胺和氟达拉滨进行非清髓性淋巴消耗预处理说明了在过继性转移TIL之前减少宿主淋巴细胞库的重要性。¹⁷上述动物数据可能提供了一个令人信服的理由，以研究一种真正的基于TBI的“淋巴清髓”方案，作为进一步加强ACT治疗的基础。虽然淋巴滤过对ACT环境中转移细胞的最佳功能至关重要，但当应用于人类受试者时，我们需要考虑这种方法的风险。选择合适的调节方法似乎至关重要，因为剂量强化会增加方案相关的毒性。^68,69,70直接与治疗血液恶性肿瘤的方案进行类比可能并不理想，因为ACT治疗实体肿瘤之前的免疫消融目标不同。事实上，血液病完全骨髓消融的目的不仅是为植入创造适当的条件，而且是直接消除恶性人群，而对于实体肿瘤的ACT，其目的是诱导淋巴衰竭，也许是炎症状态。自体和异体细胞移植治疗恶性血液病的经验^68,71或自身免疫性疾病⁷²清楚地表明，高强度调节可能与多种毒性相关，包括长时间中性粒细胞减少和相关的感染风险、粘膜炎、移植物衰竭、植入综合征以及放疗的早期和晚期影响（如弥漫性肺泡出血、间质性肺炎（IP）、闭塞性细支气管炎、，继发性骨髓增生异常综合征、继发性恶性肿瘤、白内障、肾功能不全等）。TBI相关的肺部并发症是一个值得关注的问题，也是导致死亡的主要原因。^73,74ACT和自体清髓移植术后的肺毒性可能低于同种异体移植术后，但关于自体设置中IP风险的可变数据已有报道。^75,76

TBI联合环磷酰胺和氟达拉滨以及IL-2给药的效果尚不清楚。此外，干细胞移植中的安全和最佳照射剂量仍存在争议。毒性经常重叠，化疗和放疗的联合作用难以估计；然而，调节强度的增加会增加治疗相关的发病率。在用于多发性骨髓瘤患者自体移植的化疗方案中添加分次放射治疗（8.5–13.5 Gy）导致的治疗相关死亡率（TRM）与单独化疗相当（2%对5%）；然而，与未照射组65%的非血液毒性相比，照射组发生90%的III–IV级非血液毒性。⁷⁷类似地，在某些自身免疫性疾病（如硬皮病）中给予TBI与过度毒性有关，从而排除了在这种情况下进一步使用这种方法。⁷⁸在自体和异体干细胞移植中，肺部的平均辐射剂量可能对肺毒性相关死亡率具有独立的预测价值。⁷⁶肺屏蔽在降低肺毒性发生率方面似乎相对有效，但其价值仍存在疑问。⁷⁹屏蔽可能会阻止纵隔免疫器官的消融，并可能对血液恶性肿瘤的治疗效果产生不利影响，但对于实体肿瘤，如黑色素瘤，TBI的主要目标不是直接杀死肿瘤，这可能不太重要。

最近报告了对20项报告的研究中26种预处理方案对肺毒性的剂量反应效应进行的回顾性分析，这些研究包括1090名患者。⁸⁰作者确定了环磷酰胺、辐射剂量和分馏的剂量反应效应(图2). 他们估计，仅120 mg/kg环磷酰胺就有3-4%的发病风险。环磷酰胺单次照射8.8 Gy与50%的IP风险相关，而单次照射5.1 Gy的风险估计小于5%。每天6次的总辐照剂量为12 Gy，与11%的IP发病率相关。50%的肺部屏蔽理论上可以将IP风险降低到2.8%。不幸的是，这种逻辑回归模型不适用于通常用于进一步降低肺毒性的两天分级。

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图2

使用Sampath描述的数学模型的剂量-反应函数等根据骨髓移植临床试验收集的数据⁸⁰

剂量-反应函数显示了1、2和4个组分与120 mg/kg Cy在2天内的联合用药。还显示了无任何Cy的单剂量剂量-反应函数。箭头突出显示了5.5 Gy和12 Gy的剂量。如图所示，分馏大大降低了任何给定剂量下的IP发病率；在这个数学模型中，5.5Gy单剂量或12Gy分次剂量似乎与可接受的IP发病率有关。肺部屏蔽有望进一步降低IP风险。改编自Elsevier Ltd©Sampath S等. (2005)国际放射肿瘤生物物理杂志 63: 876–884. 缩写：cy、环磷酰胺；fx，分数；IP，间质性肺炎。

国家心肺与血液研究所（NHLBI）血液学分所已成功将环磷酰胺和氟达拉滨与TBI联合应用的方案用作血液恶性肿瘤患者清髓性T细胞缺失异基因干细胞移植的预处理方案，⁷⁹可作为实体瘤过继免疫治疗的潜在平台。最初，该方案包括13.6 Gy的TBI和120 mg/kg的环磷酰胺；在最近的一次迭代中，方案被修改为包括120 mg/kg环磷酰胺和125 mg/m²氟达拉宾与12.0 Gy的TBI在8个组分中进行肺保护（肺剂量9.0 Gy后降至6.0 Gy）。自1997年以来，在NHLBI接受此方案治疗的146名患者中，TRM相对较低，为16%(n个= 18). 大多数与方案相关的死亡是由于肺移植相关的死亡率（PTRM；10.5%，n个= 14). 死亡原因为IP(n个=6），急性呼吸窘迫综合征(n个=4），肺炎(n个=4），巨细胞病毒(n个=2），呼吸道合胞病毒(n个=1）和细菌感染(n个= 1). 值得注意的是，在方案中引入50%的肺保护后，26名患者中没有PTRM的报告。⁷⁹21例晚期多发性硬化患者的自体造血干细胞移植中使用了类似的TBI剂量，其准备方案包括120 mg/kg环磷酰胺和12 Gy的TBI分为150 cGy，每日两次，50%肺保护。未观察到手术相关死亡率；然而，潜在疾病的改善微乎其微。⁸¹

或者，降低强度的调节方案可以利用以高速率（30 cGy/min）提供的单一5.5 Gy剂量的辐射。⁸²该方案的设计目的是最大限度地减少高危患者的手术相关毒性，同时仍然允许有效的植入，因为研究表明，普通单剂量辐射可能比以缓慢速率或分段给药的同等剂量更具免疫抑制作用。^83,84在匹配的同种异体移植环境中，2年时总TRM为7–19%，具体取决于风险组。⁸²在另一个由110名匹配的非血缘移植受者组成的高风险队列中，5名患者出现IV级终末器官毒性；^85,861年时总TRM为30%，29名患者死于感染，6名患者死于GVHD。

上述数据表明，单次5.5 Gy剂量的TBI或分次10–12 Gy剂量的方案，50%的肺保护和自体CD34选择的干细胞支持，就急性或亚急性毒性而言，可能相对安全。然而，其他照射方法（例如，总淋巴照射或其与TBI的联合照射）也可能具有同样的免疫抑制性和安全性。同样不清楚在这种照射后立即联合使用IL-2是否安全。值得关注的是，TBI和IL-2影响内皮通透性，^78,87可能会增强毒性。我们机构的当前经验表明，淋巴滤过大大提高了对IL-2后续治疗的耐受性。⁸⁸其他意外的毒性可能发生在受到辐射和中性粒细胞减少损害的各种器官上，并可能由细胞因子和免疫反应进一步加剧。这些不良事件可能会特别影响之前因其潜在疾病而接受其他治疗的患者。

对纳入此类积极方案的患者进行适当的初始筛查至关重要，⁸⁹但对发病率和死亡率的预测可能很困难。⁷⁴排除标准应基于适用于异基因干细胞移植候选人的标准。肺对一氧化碳的基线扩散能力（预测DLCO<85%）已被证明是PTRM的唯一最具预测性的因素；^79,90因此，患者应接受肺功能测试并评估吸烟史。此外，涉及重要器官的广泛转移性疾病似乎会增加严重并发症的风险（例如肠穿孔、心脏填塞或颅内出血）。在实施清髓化放疗和转移T细胞和干细胞后，患者需要大量的支持性护理和仔细监测，并积极预防和治疗感染性和非感染性并发症，使用在造血干细胞移植环境中制定的方案。

新一代过继免疫疗法的平台

在动物模型和患者中显示，在ACT之前使用非清髓治疗方案可以显著提高转移的肿瘤反应性T细胞的肿瘤治疗效果。²²如果采用消融性免疫抑制预处理的过继免疫治疗方案能够成功且安全地从动物模型转化为人类患者，那么它可以作为一个试验场，通过促进效应细胞替代来源的使用来探索新一代免疫治疗，因此，这将有助于解决与当前TIL治疗相关的一些关键限制。需要从每个患者的肿瘤中生成自体效应细胞并进行扩增在体外.²¹这种方法大大限制了可以治疗的患者数量。此外在体外TIL的生成和扩展可能不成功。即使患者接受了足够的细胞输注，在接受治疗的患者中，仍有相当一部分患者可能无法产生反应。虽然当前免疫疗法观察到的许多客观反应为患者提供了显著的缓解，但部分反应通常是不持久或不可治愈的。失败的原因之一可能是T细胞的自身储备缺乏TCR，TCR对自我抗原具有高亲和力，这是中心耐受的结果。⁶同样明显的是，用于ACT的细胞需要显示某些特征才能有效体内，以及在体外膨胀可能导致细胞衰老。在我们的pmel-1型建立与功能状态相关的转移T细胞的抗肿瘤效果模型；自相矛盾的是，那些更加活跃和分化的细胞在体外显示较少体内治疗效率高于更多活性细胞。⁹¹最近一份转移性黑色素瘤患者的报告显示，转移细胞的持久性与转移前端粒的长度有关；⁹²与年轻细胞相比，“老”细胞不太可能持久存在，也不太可能有效治疗。根据这些发现，很难从每个人身上生产出最佳细胞。

人们可以想象，“无血清”第三方肿瘤特异性T细胞的可用性可以大大简化治疗，使基于ACT的治疗方案更加有效和容易获得。⁹³然而，异基因细胞在免疫活性宿主中被快速有效地排斥，限制了转移的淋巴细胞的存活。在一些研究中，多次输血患者的白细胞平均存活时间为2天。^94,95在移植前给予积极的淋巴消耗方案可以延长这些异基因淋巴细胞的持久性。例如，单倍体自然杀伤细胞仅在接受最积极的预处理方案（即高剂量环磷酰胺和氟达拉滨）治疗的患者外周血中可扩增到可检测水平。⁹⁶

第三方效应淋巴细胞可以通过各种方法产生；最简单的方法是从一名患者（最好是一名非常好、完全应答的患者）处获得TIL，并将其用于治疗另一名患者。淋巴细胞在HLA相容性方面只能部分匹配，以通过识别APC和肿瘤上的限制性元件来确保其功能。这种想法可以进一步发展到使用由无关或相关供体产生的异体限制肿瘤特异性细胞。^97,98小鼠模型数据显示，这种细胞相对容易获得。⁹⁹潜在地，可以开发一个针对常见癌症抗原的T细胞克隆库，并快速测试这些细胞对抗患者肿瘤并用于治疗(图3).

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图3

使用预处理淋巴消耗方案的过继细胞转移的可能应用，包括放化疗和使用不同类型的供体T细胞并给予外源性细胞因子

(A类)达德利使用的方法等在他们最近的试验中。¹⁷从患者的肿瘤样本中分离出自体TIL，进行测试、扩增和再灌注。(B类)转移到患者体内的同种异体细胞可以来自从另一患者（对自体过继细胞转移反应良好）获得的TIL，也可以生成在体外从异基因健康供体的外周血淋巴细胞中提取，并根据受体的主要组织相容性复合体识别肿瘤抗原表位的能力进行筛选。(C类)使用慢病毒或逆转录病毒载体的基因治疗方法产生的效应T细胞。TCR序列可以来自异基因或异种来源。^109,112在异种来源的情况下，供体动物必须表达人类限制因子（即患者体内存在人类白细胞抗原等位基因），以便能够识别人类组织上的人类抗原。异种供体具有不受人类自身肽阴性选择影响的T细胞库；因此，可能更容易生成对人类肿瘤抗原具有高亲和力TCR的细胞。对于异基因供体，可以生成一个表达TCR对患者肿瘤反应的克隆在体外来自健康供体（即同种异体限制性肿瘤特异性T细胞）或来自另一名患者的TIL（见B）。分离肿瘤反应细胞后，将TCR克隆并插入病毒载体中，用于转导自体或异体PBL、外周血或脐血HSC，¹¹³甚至是永生化T细胞系；然后根据需要对细胞进行筛选、成熟和扩增，并进行再灌注。在所有这些情况下，也有可能在通过遗传手段转移之前进一步操纵细胞。这个过程可以包括插入编码细胞因子（例如白细胞介素2或15）、粘附分子、抗凋亡或自杀基因等的序列。¹⁰⁸缩写：HSC，造血干细胞；PBL，外周血淋巴细胞；TCR，T细胞受体；TIL，肿瘤浸润淋巴细胞。

这种方法的可行性已在8例难治性移植相关EBV淋巴增殖性疾病的实体器官受体中得到证实^100,101谁收到了第三方在体外从一个可用的库中筛选出部分匹配的肿瘤特异性淋巴细胞。有四种客观反应，包括三种完全缓解，未观察到GVHD。同样，在EBV相关疾病（鼻咽癌和霍奇金病）和骨髓移植环境中，通过输注供体病毒特异性T细胞来预防CMV感染，也进行了一些临床试验。^102,103,104

异基因抗肿瘤细胞引起GVHD的潜在风险可能低于非特异性供体淋巴细胞输注的情况，因为体外扩展的肿瘤特异性T细胞制剂可能具有主要针对某种有限的“自身”肿瘤表位的T细胞克隆型。^105,106此外，作为一项额外的安全措施，如果发生GVHD，自体干细胞和淋巴细胞可用于拯救宿主并清除转移的异基因细胞。

也可以完全构建“离体”淋巴细胞在体外通过基因治疗方法。^107,108,109效应细胞可以用编码肿瘤反应性TCR的慢病毒或逆转录病毒构建物转导。该技术将允许使用生成的工程TCR在体外通过噬菌体展示或体内在异基因甚至异种环境中。¹¹⁰例如，具有不受胸腺中阴性选择影响的人类HLA分子转基因小鼠可能含有对人类抗原表位具有强反应性的高亲和力T细胞，并且在治疗应用中可能非常有效。通过这种方法不仅可以获得黑色素瘤特异性TCR，而且可以靶向多种肿瘤抗原。例如，Sherman及其同事通过免疫HLA-A*0201分子转基因小鼠，获得了人类p53特异性TCR。^111,112由于转导的成熟T细胞已经表达内源性α和β链，传递的α链和β链将与这些TCR错配，从而降低其在细胞表面的表达。一个解决方案是在体外生成的T细胞成熟从头开始来自TCR转导的外周血或脐血干细胞，^113,114因此，内源性TCR的表达将被等位基因排除所减少或阻止。幼稚细胞的原始表型有助于它们迁移到淋巴结和肿瘤部位；与目前使用的衰老记忆细胞相比，这些细胞具有较长的端粒和更大的增殖能力，因此，它们的持久性和治疗效果很可能会得到增强。^22,92

结论

关于免疫治疗未来的许多问题仍然没有答案，但我们对免疫调节的理解正在不断增长。多重冗余的体内平衡机制保持了反应性和耐受性之间的紧密平衡，从而保护宿主免受病原体和潜在有害自身免疫的失控免疫反应。通过诱导淋巴细胞减少改变各种免疫系统种群的平衡可能会导致过继转移的T细胞具有选择性优势。动物数据证明了淋巴消耗调节的益处是戏剧性和令人信服的。²²最近使用非清髓准备方案的临床结果证实了ACT前淋巴滤过的重要性。¹⁷新的实验数据表明，更有益的免疫耗竭可能会进一步增强ACT治疗的疗效。⁶⁰

显然，增加预处理方案的强度与移植界最近确立的一种趋势背道而驰，该趋势的重点是通过使用非清髓方法减少治疗相关的不良反应。⁷²人们永远不会知道先验的进行骨髓消融术是否只会增加毒性，导致显著的发病率和死亡率，而不会带来临床益处。也许可以探索和开发本综述中未讨论的其他毒性较小、选择性更强的淋巴消融方法。一旦我们对所有涉及的机制有了更好的了解，我们就应该能够选择性地影响免疫反应臂，以达到预期的临床效果。^115,116

也有人可能会认为，最佳效应细胞的使用对任何免疫治疗的结果都至关重要，而它们的缺乏是限制治疗效果的主要因素。理想的T细胞应该对其靶抗原表现出高亲和力，并且相对“年轻”，以便能够增殖并运输到其靶。很有可能，只有所有这些方面的改进才能使我们取得重大进展。一种更深入的淋巴滤过策略可能被证明是ACT治疗的新标准方法，并可以使用来自新来源的细胞效应器，但必须在新疗法的有效性和耐受性、安全性和毒性之间取得适当的平衡。摩根等最近有报道称，采用肿瘤特异性TCR基因修饰的自体T细胞进行过继性移植，在15名患者中产生了显著的持久性。两名受试者出现了客观的临床反应，在输注后12个月，他们都观察到了高水平的转导淋巴细胞，因此强烈表明了这种方法的潜在治疗价值。¹¹⁰

关键点

• 转移性黑色素瘤患者在过继细胞移植前接受淋巴消耗预处理方案后，有50%的客观反应率，过继转移的细胞长期稳定存在
• 多种稳态机制调节正常宿主中T细胞淋巴细胞的数量和功能状态，正常开放条件可能会损害过继转移的抗肿瘤效应淋巴细胞的持久性和功能
• 淋巴细胞减少为某些T细胞群体创造了选择性优势，消除了调节性T细胞和竞争性细胞群体（“细胞因子汇”），并增强了重要细胞因子（如白细胞介素2、7和15）的可用性。T细胞在这些条件下进行稳态膨胀并增加其激活状态
• 动物数据表明，使用干细胞支持增加免疫消融强度可进一步提高过继细胞移植的有效性；在设计适当的淋巴清除/免疫抑制预处理方案时，必须考虑多种安全问题
• 未来，增强强度的免疫补体可能成为使用基因工程具有抗肿瘤活性的同种异体淋巴细胞的平台

致谢

脚注

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