哺乳动物细胞中高效FLP和ΦC31位点特异性重组

摘要

介绍

位点特异性重组酶（SSR）的使用在体外和体内，已被证明是分析基因功能的有用工具。在与其靶识别序列结合后，SSRs可以诱导DNA序列的缺失、插入或反转，从而导致条件基因失活或表达[1]第一个在哺乳动物培养细胞和动物中广泛使用的SSR是P1噬菌体衍生Cre，它是λ整合酶家族的一员，可识别同型34 bp loxP识别位点[2],[3]到目前为止，Cre重组酶仍然是唯一有效地介导DNA重组的SSR在体外和体内λ整合酶家族的第二个SSR，FLP来自酿酒酵母，也用于哺乳动物[4]并识别出不同的34 bp FRT位点[5]FLP在哺乳动物细胞中的首次使用表明，由于蛋白质的热不稳定性，重组酶活性低下[6]随后对耐热突变体进行筛选，鉴定出FLPe，重组效率提高了4倍[7]尽管有了这些改进，FLPe在细胞中的重组效率仍然很低，最多为6%，几乎所有ES克隆中都发现了镶嵌重组[8].第三个SSR，ΦC31来自青链霉菌，也显示哺乳动物细胞的活性[9],[10]与Cre和FLP不同，ΦC31在称为attB和attP位点的异型结合序列中介导DNA重组[10]当这些靶位点复合时，会产生混合的attL或attR位点，这些位点会折射以进一步复合，从而将新形成的序列锁定到位[10]，这是许多分子应用中所需要的一个独特特性。尽管一份报告表明，ΦC31在介导培养细胞中的重组方面可能几乎与Cre一样有效[11]，其他人则表示成功有限[9]因此，这种重组酶作为一种工具的广泛用途尚待确定。在这份手稿中，我们现在报告说从头开始小鼠密码优化FLP（FLPo）和ΦC31（ΦC31o）SSR的合成导致DNA重组效率与Cre相似。

结果和讨论

在哺乳动物细胞中观察到SSR效率不同的一个原因可能是它们的非哺乳动物起源。由于氨基酸密码子使用的差异，或者由于这些基因在本地宿主中通常不进行剪接，因此存在隐秘的剪接受体/供体位点，因此很难在哺乳动物系统中实现非内源性基因的高稳定表达水平。为了提高其在哺乳动物细胞中的翻译效率，重新设计了FLPe和ΦC31重组酶从头开始根据天然氨基酸序列，但使用小鼠密码子(图S1&S2系列). 最终ΦC31和FLP DNA编码序列优化是使用GeneOptimizer软件算法设计的（Geneart GmbH，Regensburg，Germany；网址：http://www.geneart.com/). 在优化过程中，避免了许多序列基序，包括内部TATA-box、核糖体进入位点、AT和GC丰富序列的延伸、重复序列、RNA二级结构、隐性剪接和多聚腺苷化位点（有关合成基因设计的综述，请参阅[12]). 此外，密码优化的ΦC31基因（ΦC31优化或ΦC31o）是用减少数量的CpG二核苷酸合成的，以避免与DNA甲基化相关的基因沉默[13]最后，修改密码优化FLPe基因（FLP优化或FLPo）的总碱基组成，以延长mRNA半衰期，因为低G/C含量的基因通常导致mRNA不稳定和低表达水平。优化的SSR中包含两个终止密码子，以确保有效的翻译终止。

在适当的基于ROSA26的ES报告基因系中，将重新设计的FLPo和ΦC31o的重组活性直接与本地FLPe序列和ΦC31序列以及Cre序列进行比较(图1A). 为了直接比较SSR，所有表达结构均由磷酸甘油酸激酶1（PGK）启动子驱动，包括Kozak共识翻译起始序列、SV40核定位信号，并由牛生长激素多聚腺苷化序列终止。由于密码优化重组酶的整个编码序列发生了许多变化，因此DNA重组活性中观察到的任何潜在差异都是由于在重组过程中改变的许多参数的综合作用造成的。在含有β-半乳糖苷酶基因的R26attR报告ES细胞中评估ΦC31和ΦC31o的重组活性，该基因被attB和attP侧翼的终止盒破坏(图S3).

在单独的窗口中打开

图1

稳定转染ES细胞SSR活性的重组分析。

（A） SSR报告基因分析系统示意图。在ROSA26位点构建了ΦC31β-半乳糖苷酶报告基因ES细胞系[14]，除了终止盒两侧有最小的35bp的attB和39bp的attP靶DNA识别位点[10]这些ES细胞用于生成ΦC31报告小鼠株。（B） Cre的ES报告细胞系[14]、FLP[16]和ΦC31（如所述）与线性化SSR和PGKHygromycin稳定共转染。通过X-gal（Cre和ΦC31）和AP染色（FLP）评估SSR介导的潮霉素抗性ES细胞集落的重组活性。根据细胞与X-Gal反应的百分比判断，菌落中观察到不同程度的重组；显示了具有代表性的ES细胞集落。N.D.-未检测到。

这些稳定转染分析的结果(图1B)表明FLPe和ΦC31基因的密码优化显著提高了ES细胞的重组活性，达到了与Cre重组酶类似的水平。X-gal染色分析显示，与报告细胞系相比，当含有整合的PGKCre表达载体时，大多数ES细胞集落显示出完全的Cre介导的重组活性。然而，含有整合ΦC31表达结构的ES细胞集落显示出无或非常镶嵌的X-Gal染色。与此形成鲜明对比的是，大多数包含整合密码优化ΦC31o结构的ES细胞克隆显示出稳健的X-gal染色。接下来，我们对FLP报告ES细胞进行碱性磷酸酶染色，并观察到没有由天然FLPe基因介导的重组（尽管使用pCAGGS-FLPe，我们观察到约5%的克隆具有镶嵌重组，如前所述[8]). 相反，当含有整合的密码子优化的FLPo表达载体时，大多数ES集落显示出有效的FLP介导的重组活性。这些结果表明，Cre、FLPo和ΦC31o在ES细胞中都实现了相似的重组效率。

基于ΦC31o在介导ES细胞重组事件中的潜在活性，我们测试了重组效率体内通过将ΦC31编码序列和密码子优化的ΦC31o靶向广泛表达的ROSA26位点[14](图2A). 当与表达Cre和FLP的小鼠菌株结合使用时，这些菌株可能允许进行更复杂的遗传分析。尽管ΦC31的持续表达已被证明会导致人类原代成纤维细胞的染色体畸变[15]、R26ΦC31和R26ΦC31o杂合或纯合小鼠均存活，且SSR的广泛表达均未表现出任何明显的有害影响。通过将R26ΦC31和R26ΦC31o小鼠与R26attR报告小鼠株杂交来评估重组活性。仅携带R26attR报告基因等位基因的E10.5胚胎没有显示背景X-gal染色（数据未显示）。R26ΦC31；R26attR复合杂合子表现出X-Gal染色的可变低水平镶嵌模式(图2B). 相反，R26ΦC31o；R26attR胚胎表现出广泛的X-半乳糖染色(图2C)，尽管是剖切(图2D)发现重组效率不如R26Cre中观察到的效率；R26R胚胎[14].

在单独的窗口中打开

图2

R26ΦC31和R26ΦC31o活性分析体内试验。

（A） 靶向ROSA26位点的ΦC31和ΦC31o敲除载体图。E10.5（B）R26ΦC31全贴X-Gal染色；R26attR和（C）R26ΦC31o；R26attR复合杂合胚胎。（D） X-Gal染色E10.5 R26ΦC31o的矢状截面；R26attR复合杂合子。

在ES细胞和小鼠中使用多种高效SSR，现在为更广泛的分子操作开辟了可能性。这不仅包括在ES细胞扩增过程中可能发生额外的遗传改变（例如去除可选标记），以及进行多个普通或组织特异性基因敲除，还包括研究过度重叠表达域中的基因功能。此外，多个SSR的使用可能用于控制单个或多个细胞类型或组织中的基因表达。优化的ΦC31o和FLPo表达结构将通过Addgene质粒库提供给学术研究人员(网址：http://www.addgene.org/).

材料和方法

支持信息

致谢

脚注

工具书类