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《美国病理学杂志》。2007年1月；170(1): 110–125.
数字对象标识：10.2353/ajpath.2007.060158
预防性维修识别码：项目经理1762706
PMID：17200187

αvβ6整合素调节Alport小鼠肾纤维化和炎症

Kyungmin哈姆,* 马特维·卢卡舍夫,* 伊洛,* 威廉·J·杨,* 布莱恩·多林斯基,* 保罗·魏恩勒布,* 肯尼思·西蒙,* 王丽春,* 戴安·里昂,* 罗伊·罗布,* 唐纳德·麦克拉恩,* 诺曼德·阿莱雷,* 杰拉尔德·S·霍兰,* 艾格尼丝·福戈,† 拉胡·卡卢里,‡§¶ 查尔斯·F·希尔德三世,|| 迪安·谢泼德,** 汉弗莱·A·加德纳,*和谢莉娅·维奥莱特*
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补充资料

摘要

转化生长因子（TGF）-β诱导的整合素αvβ6优先在上皮重塑部位表达，并被证明能结合和激活潜在的前体TGF-β。在此，我们发现αvβ6在膜性肾小球肾炎、糖尿病、IgA肾病、Goodpaste综合征和Alport综合征的人肾上皮中过表达。为了评估αvβ6在肾脏疾病中的潜在调节作用，我们研究了功能阻断αvβ5单克隆抗体（mAbs）和β6亚单位的基因消融对Col4A3肾纤维化的影响−/−小鼠，Alport综合征的小鼠模型。αvβ6在Alport小鼠肾脏中的表达主要在皮质小管上皮细胞中观察到，并与纤维化进展相关。用αvβ6阻断单克隆抗体治疗可抑制活化成纤维细胞的积聚和间质胶原基质的沉积。在β6缺乏的Alport小鼠中观察到类似的肾纤维化抑制作用。肾组织的转录谱分析表明，αvβ6阻断单克隆抗体显著抑制了纤维化和炎症介质表达的疾病相关变化。重组可溶性TGF-βRII处理产生了类似的转录调节模式，表明αvβ6和TGF-β具有共同的调节功能。这些发现表明，αvβ6可参与肾纤维化的调节，并提示整合素是一个潜在的治疗靶点。

进行性纤维化是导致终末期肾病发展的常见过程，并通过上皮重塑、成纤维细胞活化、炎症和细胞与细胞外基质（ECM）相互作用的重组而促进。导致这些事件的分子机制是复杂的，包括转化生长因子（TGF）-β轴的调控不当、ECM异常重塑、整合素超家族细胞粘附受体的表达和功能改变。1–5最近的研究揭示了肾脏上皮细胞和间充质细胞中几种整合素及其相关分子的重要调节功能。3,6–8

在肾脏疾病中，TGF-β诱导的整合素αvβ6的表达强烈增加。5,9,10αvβ6的表达通常局限于上皮细胞，在正常成人组织中低水平表达，在发育、损伤和肿瘤形成过程中升高。9,11–13尽管αvβ6在健康成人肾脏中的表达水平相对较低，但在发育中的小鼠肾脏中，尤其是近端小管、Henle环和集合管中，其表达显著。11,12,14最近，有报道称，αvβ6的高表达可用于各种形式的人类肾脏病理。10

与αvβ6表达增加一致体内在组织重塑过程中，调节上皮重塑的细胞因子，包括EGF和TGF-β，可以诱导培养的上皮细胞中αvβ6整合素的表达。5,9此外，转基因小鼠皮肤中β6的过度表达已被证明会引发自发慢性伤口的形成，15提示αvβ6可能在调节上皮组织重塑中起重要作用。

已知的αvβ6配体包括纤维连接蛋白、tenascin和潜伏相关肽1和3（LAP1和LAP3），以及TGF-β1和-β3潜在前体形式的N末端片段。16–19由于与这些配体结合，αvβ6可以介导细胞粘附、扩散、迁移和潜在TGF-β的激活。TGF-β合成为一种潜在蛋白，与与成熟活性C末端TGF-？细胞因子非共价相关的N末端LAP一起裂解和分泌。潜在TGF-β复合物不能与其同源受体结合，因此在通过蛋白酶裂解、暴露于低pH或电离辐射以及潜在复合物构象变化等多种替代机制之一转化为活性形式之前，其生物活性保持不变，使其与同源受体结合。20–22αvβ6可诱导活化构象变化，涉及整合素与LAP1和LAP3中包含的RGD基序的直接结合。这种结合将TGF-β前体转化为受体结合能态。17,19这些发现表明，上皮细胞表面αvβ6表达上调可导致局部TGF-β激活，随后旁分泌激活TGF-α依赖性事件。这将包括对TGF-β活性产生间接下游影响的可能性，这种影响可以通过改变αvβ6表达部位的炎症和纤维化来介导。

由于TGF-β被认为是肾纤维化的中枢调节因子，我们假设αvβ6对其局部激活可能是肾脏疾病发生和发展的重要过程，阻断αvβ5功能可以抑制肾纤维化的发展。在本文所述的研究中，我们发现αvβ6在肾纤维化小鼠模型和患有纤维化病理的人类肾脏样本中高度上调。使用Col4A3−/−小鼠是一种类似于在人类Alport综合征中观察到的进展性肾病模型，我们发现单克隆抗体（mAbs）阻断αvβ6的配体结合和TGF-β激活功能，23除β6基因消融外，还能有效抑制肾小球和肾小管间质纤维化，延缓肾组织结构的破坏。我们表明，尽管αvβ6整合素在肾小管上皮细胞中的表达受到限制，但它可以在组织的远端部位提供保护作用。这些发现增加了以下可能性：除阻断αvβ6对肾小管上皮细胞的直接作用外，抗纤维化作用也可能部分通过间接肾外作用介导。延迟治疗研究表明，αvβ6的治疗阻断不仅能抑制肾纤维化的进展，而且有可能使现有的纤维化病变得到解决。我们对与肾脏疾病进展相关并受αvβ6抑制作用影响的分子特征的分析表明，αvβ6blocking抗体的治疗效果与全身TGF-βblocking的治疗效果相似，并且在机制上与降低TGF-α活性有关。这些数据表明，αvβ6参与肾纤维化的调节，并可能为其治疗调节提供新的分子靶点。

材料和方法

抗体和试剂

如前所述生成αvβ6单克隆抗体。23使用第一链cDNA合成试剂盒（Amersham/Farmacia，Piscataway，NJ）从各自的亲本杂交瘤总RNA中生成人/小鼠嵌合2A1和3G9 cDNA，重链和轻链分别使用恒定区域引物CDL-739和CDL-738。通过聚合酶链反应，使用用于cDNA合成的相同3′引物以及针对大多数小鼠抗体基因信号序列（序列可按要求提供）和Pfu DNA聚合酶（Stratagene，La Jolla，CA）的简并引物池，扩增重链和轻链可变区。克隆的重链和轻链可变区被连接到带有人类IgG1恒定区的哺乳动物表达载体中。如前所述生成重组可溶性小鼠TGF-β受体II-Ig型融合蛋白（rsTGF-？RII-Ig）7并从R&D Systems（532-R2；明尼阿波利斯，明尼苏达州）购买。按照指示购买抗体：异硫氰酸荧光素结合泛抗细胞角蛋白单克隆抗体（C-11；F3418），来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）；来自Chemicon（加利福尼亚州特梅库拉）的抗层粘连蛋白B1链单克隆抗体（LT3；MAB1928）；Chemicon的藻红蛋白（PE）结合抗αv单克隆抗体（RMV7；CBL1346P）；Chemicon的兔抗αv抗体（AB1930）；来自BD Biosciences（加利福尼亚州圣何塞）的PE-rat IgG1（553925）；和来自Sigma-Aldrich（C-6198）的反光滑肌肉肌动蛋白（SMA）-Cy3。我们将兔多克隆抗TGF-β抗体（sc-146；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）鉴定为一种抗体，与表达潜在TGF-。24

流式细胞术

如前所述，生成稳定转染β6（NIH3T3b6）的小鼠NIH3T_3细胞。23细胞经胰蛋白酶消化后，在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤，然后在流式细胞仪（FC）缓冲液（1×PBS，2%FBS，0.1%NaN）中重新悬浮三，1 mmol/L氯化钙2和1 mmol/L MgCl2). 电池（0.2×105)在含纯化一级抗体的FC缓冲液中，在冰上孵育1小时，总体积为100μl。培养后，用冰镇FC缓冲液清洗细胞两次，并将其重新悬浮在含有5μg/ml PE结合驴抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）的100μl FC缓冲液中，然后在冰上培养30分钟。为了监测αv的表达，细胞与PE结合的大鼠抗鼠αv单克隆抗体（RMV-7）和PE结合的鼠IgG1对照物孵育。细胞用冰镇FC缓冲液洗涤两次，并用流式细胞仪监测标记的二级抗体的结合。

免疫组织化学

组织切片在二甲苯和乙醇中脱蜡，在蒸馏水中再水化，然后浸入含有0.45%H的甲醇中2O.组织用胃蛋白酶培养（00-3009；佐米德，加利福尼亚州旧金山），并用亲和素和生物素封闭（SP-2001；Vector Laboratories，加利福尼亚州伯灵盖姆）。在含有0.1%牛血清白蛋白的PBS中稀释初级抗体，并在4°C下培养组织过夜。为了在小鼠组织上对β6进行免疫染色，用人/小鼠嵌合形式的抗αvβ6单克隆抗体2A1、，23和抗人生物素化二级抗体（PK-6103；Vector Laboratories）。为了在人体组织上对β6进行免疫染色，将切片与小鼠2A1孵育，23和抗小鼠生物素化的第二抗体（PK-6102；Vector Laboratories）。将亲和素-生物素复合物-辣根过氧化物酶（Vector kit PK-6102）应用于切片并在室温下培养30分钟，按照指示（SK-4100；Vector Laboratories）制备3,3′-二氨基联苯胺底物并在室温条件下应用于切片5分钟。组织切片用Mayer苏木精染色1分钟，并在水中和PBS中漂洗。

将嵌入O.C.T.化合物（日本东京樱花）中的冷冻组织切片固定在丙酮中，并用0.5%酪蛋白/0.05%硫柳汞封闭PBS。为了在人体组织上进行β6免疫染色，将切片与小鼠2A1孵育23和抗小鼠Alexa Fluor 594二级抗体（A-11032；分子探针，尤金，俄勒冈州）。为了在小鼠组织上进行β6免疫染色，将切片与人/小鼠嵌合形式的2A1和抗人Alexa Fluor 594偶联二级抗体（a-11014；分子探针）孵育。对于层粘连蛋白和αv免疫染色，使用抗大鼠Alexa Fluor 488偶联的第二抗体（A-11006；分子探针）。如前所述，所有其他抗体直接结合。除图2A，在×40处拍摄。所有人体组织样本均获得当地机构审查和患者批准。

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Col4A3中的αvβ6免疫染色+/−和Col4A3−/−小鼠肾脏。答：7周龄Col4A3冷冻肾切片+/−小鼠和Col4A3−/−用αvβ6单抗（红色）和泛细胞角蛋白单抗（绿色）免疫染色的小鼠。B类：4周龄和8周龄Col4A3的石蜡包埋肾脏切片+/−和Col4A3−/−用αvβ6单克隆抗体对小鼠进行免疫染色。抄送：4周龄、7周龄和8周龄Col4A3肾脏中αvβ6免疫染色的定量+/−和Col4A3−/−老鼠(n个= 3).

SMA免疫染色、肾小管损伤和间质纤维化的定量

使用MetaMorph v5.0（Universal Imaging Corporation，Sunnyvale，CA）对SMA免疫染色面积进行量化，并以面积相对于总图像大小的百分比表示。对于SMA免疫染色，分析每只动物至少五个皮质和一到两个髓质切片的×20图像。使用方差分析对治疗组进行统计分析。如前所述，对肾小管损伤和间质容积进行评估25,26经过修改。简言之，从Trichrome-Masson染色的切片上采集×20图像。在Stereo Investigator 6.5（弗吉尼亚州威利斯顿市MBF Bioscience）中设置了一个包含117个点（13×9）的网格，网格间距为35μm。计算覆盖在健康小管（健康小管体积指数）和退化小管和间质空间（间质体积指数）上的网格点数量，并将其表示为所有采样点的百分比。对于肾小管扩张指数，计算每张图像中扩张的肾小管数量。对于每个肾脏，随机选择10个非重叠区域，由盲法观察者进行分析。

Col4A3的处理−/−单克隆抗体和rsTGF-βRII-Ig小鼠

第4A3列+/−129Sv/J背景下的小鼠被培育以产生Col4A3−/−老鼠。如图所示，从3周龄到7周龄或8.5周龄，小鼠每周三次腹腔注射蛋白质。以4mg/kg的剂量腹膜内注射mAb，以2mg/kg的剂量注射rsTGF-βRII-Ig。对小鼠实施安乐死，并收集肾脏进行RNA和免疫染色。所有动物研究均按照动物护理和使用委员会的规定进行。

总RNA纯化和cDNA合成

将肾脏直接均质成TRIzol（155-96-018；Invitrogen，Carlsbad，CA），并根据制造商的方案提取RNA，再提取1 ml酸性苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，pH 6.6）。将纯化的总RNA重悬于焦碳酸二乙酯处理的H中2O（Ambion Inc.，德克萨斯州奥斯汀）和260和280记录（Spectra max Plus；Molecular Devices，加利福尼亚州桑尼维尔）。使用5个单位的DNase I扩增等级（Invitrogen）在20°C下去除残余DNA 15分钟。根据制造商的协议（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems Inc.），使用高容量cDNA档案盒生成cDNA。

Taqman引物、探针和寡核苷酸标准模板的设计

寡核苷酸引物和Taqman MGB探针是根据Affymetrix共识序列使用Primer Express 2.0.0版（Applied Biosystems Inc.）设计的。Taqman MGB探针采用5′共价连接荧光报告染料（FAM）和与3′端共价连接的小沟槽粘合剂/非荧光猝灭剂设计。通过在扩增子的5′端和3′端添加10 bp的基因特异性序列来设计寡核苷酸标准模板。反向高效液相色谱纯化引物和寡核苷酸标准模板购自Biosearch Technologies Inc.（Novato，CA）。在Biogen Idec（5′-CATGGCCTCCGTGTTCCTA-3′，5′-GCGGCACGTCAGATCC-3′和6FAM-5′-CCCAATGTCC-CGTC-3′）合成了高效液相色谱纯化的小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶引物和探针。

塔克曼热循环

样品和标准品的四重聚合酶链反应在7900HT热循环器（Applied Biosystems Inc.）中在以下条件下循环：50°C 2分钟（尿嘧啶N个-脱糖苷酶消化），95°C，10分钟（激活塔克耐热聚合酶），40个95°C循环15秒，60°C循环60秒。在每个反应井的运行时间内，每7秒收集一次荧光发射。通过使用序列检测软件（Applied Biosystems Inc.）与寡核苷酸标准曲线进行比较，确定每个样本的相对转录物数量。

微阵列程序

从每个实验组小鼠（每组五只动物）的肾脏样品中分离出总RNA。在生物分析仪2000（安捷伦）上通过毛细管电泳验证得到的RNA制剂的质量。Col4A3实验组−/−所分析的小鼠不接受任何治疗，或使用以下蛋白之一进行治疗：阴性对照mAb 1E6、非阻断抗αvβ6 mAb 8B3、阻断抗αv-β6 mAb 3G9、阻断抗βvβ6 m Ab 8G6和rsTGFβRII-Ig。其他对照组包括具有相同遗传背景的野生型小鼠（用3G9处理）和幼稚野生型小鼠。从每个RNA样本中制备杂交探针，并在单独的U74Av2基因芯片寡核苷酸阵列上进行分析（Affymetrix，Santa Clara，CA）。使用制造商的协议进行杂交探针合成、杂交和微阵列扫描。将阵列扫描转换为Affymetrix.CEL文件，并使用稳健的微阵列平均法对结果数据集（代表整个实验的一组CEL文件）进行标准化。使用GeneSpring（Agilent）和Spotfire（Spotfire）数据挖掘工具进行统计和聚类分析。我们使用方差的Two-strp分析和折叠式滤波来识别信号强度与未经处理的Col4A3相比通过实验处理而改变的探针集−/−组位于P（P）<0.05，至少加倍。同样，选择疾病相关转录物在未经治疗的Col4A3之间进行差异表达−/−和天真的野生型组使用P（P）<0.01，信号折叠截止2。通过层次聚类分析和可视化结果基因组和实验条件分组的概况。使用Ingenuity pathway analysis数据库（Ingenuiity Systems）进行虚拟路径分析。

结果

αvβ6在肾纤维化病理标本中的表达

与炎症/纤维化病理相关的几种不同类型的人类肾脏疾病显示，肾脏组织中TGF-β的表达相应增加。27–29通过免疫组织化学分析，我们检测了与慢性炎症和纤维化相关的人类肾脏活检样本中αvβ6的表达，这是导致TGF-β活化增加的潜在机制（图1、A和B）膜性肾小球肾炎、糖尿病、IgA肾病、Goodpaste综合征、Alport综合征和狼疮的组织样本均显示出显著的αv（v）扩张和受损小管上皮衬里β6染色。相比之下，形态正常的肾脏（肾癌和正常组织）样本的肾小管中偶尔出现少量免疫染色。所有分析的肾脏样本均无肾小球染色。这一发现与之前的报道一致，即αv（v）β6在健康成人上皮中低水平表达，但在组织损伤和修复过程中上调。10,11,13,15,17

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人肾脏疾病的αvβ6免疫染色。答：用αvβ6单抗（红色）和全细胞角蛋白单抗（绿色）免疫染色的冷冻人肾切片。所有图像均在相同的放大倍数下拍摄。B类：αvβ6单克隆抗体免疫染色石蜡包埋人肾切片。

α的表达v（v）Col4A3肾脏中的β6−/−小鼠与肾纤维化进展的关系

第4A3列−/−小鼠是人类阿尔波特病的小鼠模型，发展为进行性肾小球肾炎，导致ECM在肾脏的肾小球和间质区积聚，同时伴有一些标准纤维化标记物的表达增加。30,31此前有报道称，Col4A3的治疗−/−带有rsTGF-βRII-Ig的小鼠可抑制肾纤维化。7Col4A3肾脏−/−大约在5-6周龄时，小鼠开始出现纤维化的组织学特征。随着年龄的增长，疾病进展迅速，小鼠在大约11周时死于肾衰竭。杂合Col4A3+/−小鼠不会发生肾小球肾炎，其肾脏在组织学上与野生型同窝小鼠的肾脏无明显区别。检查α的动力学v（v）β6在Col4A3肾脏中的表达+/−和Col4A3−/−随着年龄的增长，我们对（Alport）小鼠的αv（v）β6在4、7和8周龄小鼠肾脏中的表达（图2，A–C）在4周龄时，α偶尔表达v（v）Col4A3肾小管中的β6+/−和Col4A3−/−老鼠。7周时，α的表达v（v）β6在Col4A3的肾小管上皮细胞中显著增加−/−小鼠，但不在Col4A3中+/−肾脏。α的表达增加v（v）β6在Col4A3中持续存在−/−8周龄以上的小鼠。我们还观察到α的强度增加v（v）Col4A3扩张和受损小管上皮细胞的β6染色−/−（Alport）小鼠。α的定量分析v（v）肾脏β6免疫染色(n个=3）表明Col4A3的免疫染色面积增加−/−与Col4A3相比+/−但未达到统计学意义。在7至8周龄期间，表达增加与Col4A3肾纤维化的快速进展相一致−/−老鼠。相反，在Col4A3的肾脏中检测到最小的αvβ6表达及其免疫染色强度随年龄的增长而略有增加+/−老鼠在整个时间过程中。因为αvβ6在Col4A3肾脏中的表达−/−与纤维化进展相关的小鼠，我们检测阻断αvβ6功能是否可以抑制纤维化病变的发生和发展。

单克隆抗体与α结合的特异性v（v）Col4A3肾脏中的β6−/−老鼠

我们以前曾报道过产生有效且选择性的抗αvβ6单克隆抗体，23包括结合α的单克隆抗体v（v）β6不影响其结合配体（非阻断型单克隆抗体）和阻断配体结合和α的单克隆抗体的能力v（v）β6介导的TGF-β活化（阻断单克隆抗体）。验证αv（v）β6阻断型单克隆抗体用于体内研究选择性结合αvβ6整合素，我们进行荧光激活细胞分选分析（图3A）比较αvβ6单克隆抗体与未转染的亲本NIH3T3细胞和转染小鼠β6 cDNA（NIH3T3b6）的NIH3T_3细胞的结合。尽管对照抗αv单克隆抗体RMV7对未转染和表达αvβ6的NIH3T3细胞进行了染色，但抗αvβ6mAb仅选择性结合NIH3T3b6细胞。为了证实肾脏中结合αvβ6的特异性，我们制备了阻断αvβ6mAbs之一的人/鼠嵌合形式3G9，并比较了兔抗αv多克隆抗体产生的免疫染色模式（图3、B和C）通过荧光激活细胞分选和酶联免疫吸附试验测定，嵌合型和原始鼠型3G9具有可比的靶结合亲和力（数据未显示）。Col4A3肾脏中3G9特异性免疫染色小管上皮细胞的嵌合形式−/−小鼠，Col4A3肾切片无免疫染色−/−与β6交叉−/−小鼠（Col4A3−/−;β6−/−). 用抗αv抗体对肾脏进行免疫染色，发现Col4A3与−/−小鼠或Col4A3−/−;β6−/−老鼠。

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αvβ6单抗结合的特异性。答：αvβ6单克隆抗体（3G9、8G6和8B3）、抗αv单克隆抗体（RMV-7）、阴性对照单克隆抗体（1E6和MOPC21）以及与NIH3T3细胞和NIH3T3b6细胞结合的同种型对照（大鼠IgG1）的流式细胞术分析。B类：免疫染色Col4A3−/−和Col4A3−/−;β6−/−抗αvβ6单克隆抗体（人/鼠嵌合3G9）肾切片。抄送：免疫染色Col4A3−/−和Col4A3−/−;β6−/−抗αv多克隆抗体肾切片。

Col4A3的处理−/−抗αvβ6单克隆抗体（Alport）小鼠抑制肾纤维化

为了确定αvβ6在肾纤维化调节中的潜在功能参与，我们测试了阻断αvβ6mAbs影响晚期纤维化病变的发生和发展的能力。评估αvβ6阻断剂Col4A3的预防效果−/−用两种不同的阻断αvβ6单克隆抗体（3G9或8G6）治疗3-7周龄或3-8.5周龄小鼠；一种非阻断性αvβ6单克隆抗体，8B3；或同型匹配阴性对照单克隆抗体1E6。为了表型参考和监测系统TGF-β抑制的效果，这些研究还包括Col4A3−/−用rsTGFβRII-Ig治疗的小鼠。收集肾脏进行组织学评估和RNA分离。Col4A3中纤维化和SMA表达的组织学特征显著增加−/−与年龄匹配的Col4A3+/-小鼠的肾脏相比，第7周和第8.5周的肾脏。阴性对照单克隆抗体处理的Col4A3的肾脏−/−小鼠肾小球系膜扩张和纤维化，鲍曼氏囊内形成新月体(图4A，1E6）。这些肾脏还表现出明显的肌成纤维细胞活化和间质纤维化，这与肾小管上皮损伤和扩张有关。Col4A3的治疗−/−阻断αvβ6单克隆抗体3G9或8G6的小鼠可显著减轻肾小球和间质损伤及纤维化，从而显著保护肾脏结构(图4A、3G9和8G6）。阻断αvβ6单克隆抗体的这些作用伴随着肾小球中SMA表达减少>65%，间质区SMA表达降低>90%（图4、B和C）阻断单克隆抗体对肾小球中SMA表达的影响表明，尽管αvβ6整合素的表达仅限于肾小管上皮细胞，但阻断其功能可在组织的更远端部位产生影响，这可能至少部分由于阻断αvβ6单克隆抗体的间接全身效应而介导。在Col4A3的肾脏中未发现对纤维化进展的影响−/−注射非阻断性αvβ6单克隆抗体8B3的小鼠。与先前报道的通过阻断TGF-β抑制肾纤维化相一致，7,32–35Col4A3的处理−/−根据肾组织的组织学外观和SMA含量的变化判断，rsTGFβRII-Ig小鼠产生的肾纤维化抑制作用与阻断αvβ6单克隆抗体产生的抑制作用相似。αvβ6阻断单克隆抗体对SMA表达的影响与肾组织总胶原蛋白1α1和胶原蛋白1 a 2 mRNA水平的降低平行（图5，A和B）.Col4A3的处理−/−具有3G9、8G6或rsTGF-βRII-Ig的小鼠引起胶原1α1和胶原1α2 mRNA丰度的显著降低，而非阻断的αvβ6mAb和同位素对照mAb对这些转录物的水平没有显著影响。

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Col4A3中的免疫染色SMA+/−或Col4A3−/−经过各种治疗后的小鼠肾脏。答：Col4A3显示肾脏中的免疫染色SMA（红色）和层粘连蛋白（绿色）−/−3至8.5周龄和未经治疗的年龄匹配的Col4A3小鼠+/−老鼠。显示了每个治疗组的代表性切片的免疫染色（皮质和髓质）(n个=每组8个）。B类和抄送：未经治疗的Col4A3肾脏中SMA染色的定量+/−小鼠和Col4A3−/−3至7周龄或3至8.5周龄的小鼠接受各种药物治疗。显示了皮质和髓质相对于总图像大小的阳性免疫染色百分比。N个散点图中指定的每个治疗组的值*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001将治疗组与阴性对照单克隆抗体1E6治疗小鼠进行比较。

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胶原蛋白1α1的Taqman分析(A类)和胶原蛋白1α2(B类)mRNA水平。从7周龄未经治疗或治疗的Col4A3的肾脏中分离出RNA−/−小鼠和7周龄未经治疗的Col4A3+/+老鼠。

为了测试αvβ6阻断剂对晚期肾纤维化的影响，我们研究了αvβ5阻断单克隆抗体对6周龄Col4A3肾纤维化的作用−/−小鼠，此时肾脏病理表现为可测量的损伤和SMA阳性活化成纤维细胞的积聚。用αvβ6阻断型单克隆抗体3G9或同型对照单克隆抗体1E6治疗小鼠2.5周，然后在8.5周龄时处死。SMA免疫染色定量显示Col4A3肾脏中SMA阳性成纤维细胞的数量减少−/−用3G9治疗的小鼠与同种对照单克隆抗体治疗的小鼠的比较（图6A）同样重要的是，与治疗开始时（6周）观察到的SMA水平相比，延迟3G9治疗的SMA免疫染色强度和面积降低，提示治疗性阻断αvβ6可以抑制肾纤维化的进展，并有可能解决现有的纤维化病变。与SMA染色减少一致，与1E6治疗相比，3G9治疗导致病理学显著逆转。测量结果为健康小管面积增加（健康小管体积指数）、间质面积减少（间质体积指数）和扩张小管数量减少（小管扩张指数）（图6B）总的来说，这些发现表明肾脏结构得到了更好的保护，并且通过αvβ6阻断单克隆抗体治疗可以显著减少纤维化。

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Col4A3中肾脏SMA免疫染色和健康小管面积的定量−/−延迟3G9单克隆抗体治疗的肾脏。答：未经治疗的8.5周龄Col4A3肾脏SMA免疫染色+/−未经治疗的6周龄Col4A3小鼠−/−小鼠，未经治疗的8.5周龄Col4A3−/−小鼠和8.5周龄Col4A3−/−对6~8.5周龄的1E6和3G9处理小鼠进行定量。N个散点图中指定的每个治疗组的值*P（P）<0.0005，将3G9治疗组与阴性对照mAb 1E6治疗的Col4A3进行比较−/−老鼠**P（P）与6周龄未经治疗的Col4A3相比，3G9治疗组<0.02−/−老鼠。B类：定量健康小管的面积（健康小管体积指数）、退化小管和间质空间的面积（间质体积指数）以及扩张小管的数量（小管扩张指数）*P（P）<0.001，以及**P（P）与阴性对照单克隆抗体1E6处理的Col4A3处理的3G9相比<0.002−/−老鼠。

抗αvβ6单克隆抗体对肾脏基因表达的调控

为了进一步了解与αvβ6功能相关的疾病机制，我们对野生型和Col4A3肾组织中的基因表达进行了Affymetrix基因芯片分析−/−老鼠。Col4A3中一组表达改变的基因−/−肾脏被鉴定为395个基因芯片探针组，与7周龄的Col4A3相比，其标准化信号强度至少有两倍的平均差异−/−和年龄匹配的野生型肾脏P（P）< 0.01 (图7; 补充表1，见http://ajp.amjpathol.org). 使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）工具对差异表达基因进行了功能注释，表明Col4A3中过度表达的基因具有显著相关性−/−肾脏炎症和白细胞功能调节，而表达减少的基因主要与代谢调节有关（图8）.

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7周龄Col4A3小鼠肾脏的基因表达和调控模式−/−老鼠。所示为395个基因芯片探针组，用于野生型和未经处理的Col4A3之间的两倍或更多变异−/−（联合国）小组P（P）< 0.01. 热图的列显示了各个实验组相对基因表达水平的模式。每列代表由五只小鼠组成的单个实验组的395个标准化平均探针集信号强度值。实验条件下基因表达的变化反映在颜色条所示的颜色变化中。进行二维层次聚类以探索实验组之间的关系（如树状图所示）。

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Col4A3中与肾脏疾病相关的αvβ6依赖基因的功能注释−/−肾脏。IPA分别在与Col4A3中高表达或低表达基因相对应的探针组列表上进行−/−肾与野生型相比。用于IPA的列表是最初为显著性（>2倍，P（P）<0.01）Col4A3之间的变化−/−和野生型群体。所示为生物功能的等级排序列表(A类和C类)和经典途径(B类和D类)与基因过度表达相关(A类和B类)和下调制(C类和D类)在7周大的Col4A3中−/−肾脏。

用αvβ6阻断单克隆抗体3G9和8G6治疗小鼠，可减弱Col4A3基因亚群的差异表达−/−肾脏。我们使用方差分析（Welch方差分析）来确定受实验处理影响的转录本P（P）<0.05，并进一步过滤得到的探针组，以选择那些对治疗的信号强度至少有两倍差异的探针组。该程序产生56、42和28个探针组，分别受到3G9、8G6和rsTGF-βRII-Ig的显著影响（补充表2、3和4，见http://ajp.amjpathol.org). 这些探针组显示出相当大的重叠，并且每个组都代表了Col4A3中差异表达的395个相应转录物的一个完全包含的子集−/−肾脏（图9A）我们观察到两种不同的αvβ6阻断单克隆抗体对基因表达的类似调节(图7和9A; 补充表2和3，见http://ajp.amjpathol.org)之前显示属于两个不同的生物化学类别。23非阻断型抗αvβ6单克隆抗体8B3和同型对照单克隆抗体1E6均未对基因表达产生显著影响。因此，αvβ6单克隆抗体对肾脏基因表达的影响可能是由于阻断αvβ5功能，而不是激活整合素信号或非特异性事件。我们发现阻断αvβ6 mAb 3G9对正常野生型肾组织中基因表达没有显著影响。该观察结果表明，在我们的实验中观察到的αvβ6阻断单克隆抗体的作用主要反映了αvβ5的疾病特异性调节功能。

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Col4A3差异表达基因的子集和网络分析−/−通过阻断αvβ6单抗治疗调节肾脏。答：探头组列表的维恩图。维恩圆的面积、它们的并集和交集与相应列表中的探测集数量成正比。B类和抄送：从探针组列表中推断出的得分最高的调节网络显著（治疗后和未治疗的Alport肾脏之间的差异>2倍，P（P）<0.05）受αvβ6阻断mAbs 3G9的影响(B类)和8G6(C类). 网络的边缘显示了被描述为节点的基因之间的交互方向，并根据其细胞定位进行排列。带阴影的符号代表受αvβ6功能阻断影响的基因。它们推断的网络邻居如下所示打开的符号.

为了探索αvβ6阻断单克隆抗体调控的基因与主要调控途径的潜在关系，我们使用IPA软件对相应的基因列表进行了虚拟调控网络分析（图8和9）IPA比较了作为基因和蛋白质之间已知物理和调节相互作用的精选数据库输入的基因列表。该分析产生了一个排名表和最有可能由给定的调节基因列表反映的调节路径的个别配置。尽管单克隆抗体3G9和8G6调节的基因列表并不完全相同（数据未显示；补充表2和3，见http://ajp.amjpathol.org)，IPA揭示了TGF-β依赖性网络是受3G9影响的评分最高的调节网络（图9B）和8G6（图9C）与这一发现一致，实验组平均基因表达谱的分级聚类已经证明了αvβ6阻断mAbs和rsTGF-βRII-Ig的基因调节模式之间的相似性（图7）.

阻断αvβ6降低Col4A3中TGFβ的表达−/−肾脏

为了确定3G9和8G6单克隆抗体治疗后检测到的肾纤维化减轻是否与TGF-β表达降低相关，用抗TGF-？1单克隆抗体对肾切片进行免疫染色（图10A）用于免疫染色的单克隆抗体是一种优先与表达组成活性TGF-β的组织切片结合的抗体，而不是潜在的TGF-α（数据未显示）。24用3G9或8G6治疗小鼠后，肾脏间质和肾小球区域的TGF-β1免疫染色显著降低。TGF-β表达的这些变化伴随着TGF-（图10B）TGF-β1免疫染色模式表明，尽管αvβ6的表达仅限于肾小管的上皮衬里，但抑制αvβ5的功能可能会导致远端部位（如肾小球区域）TGF-α的表达降低，这些部位并不紧邻αvβ7的表达区。这可能表明，尽管αvβ6可以作为局部TGF-β激活的初始触发因素，但它也可以对TGF-α产生长期调节作用。这种长程效应的一个可能机制可能是TGF-β激活自身表达的能力，以自分泌或旁分泌的方式，导致TGF-？表达组织区域的扩大。它还包括通过阻断αvβ6对TGF-β激活的初始局部抑制可能干扰炎症和纤维化过程，从而间接进一步下调TGF-α活性。

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TGF-β1表达的免疫组织化学和Taqman分析。答：Col4A3肾脏切片+/−和Col4A3−/−用指示药物治疗的小鼠进行TGF-β1表达的免疫染色。显示了每个治疗组的代表性部位的着色。B类：不同治疗组TGF-β1 mRNA水平的Taqman分析。

β6基因消融缓解Col4A3肾纤维化−/−老鼠

为了验证使用αvβ6阻断单克隆抗体的实验结果，我们制作了Col4A3和β6双敲除小鼠−/−;β6−/−). 年龄匹配的Col4A3肾脏组织学检查−/−;β6+/−和Col4A3−/−;β6−/−小鼠证实了αvβ6阻断单克隆抗体的研究结果。从7周龄到10周龄的Col4A3，肾脏中的SMA免疫染色显著降低−/−;β6−/−小鼠与年龄匹配的Col4A3的比较−/−;β6+/−小鼠（数据未显示）。伴随着肾脏肾小球和间质区纤维化的急剧减少。从10周龄Col4A3的Trichrome-Masson染色肾脏中观察到胶原蛋白表达减少和肾脏结构保存良好，证明了这一点−/−;β6−/−与Col4A3中年龄匹配的肾脏进行比较−/−;β6+/−老鼠（图11，A和B）肾结构完整性改善的进一步迹象表现为健康小管面积的增加（健康小管体积指数）、间质面积的减少（间质体积指数）和扩张小管数量的减少（小管扩张指数）在10周龄Col4A3的Trichrome-Mason染色肾脏切片中测得−/−;β6−/−小鼠与年龄匹配的Col4A3的比较−/−;β6+/−老鼠（图11C）阻断αvβ6单克隆抗体治疗与基因消融β6功能所观察到的抗纤维化作用的一致性表明，单克隆抗体疗法是阻断αvα6功能的有效途径体内.

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肾脏胶原表达的三色染色和健康肾小管面积的定量。全肾切片(A类)和肾脏切片(B类)10周龄Col4A3以×20显示+/−;β6+/−，第4A3列−/−;β6+/−和Col4A3−/−;β6−/−老鼠。肾脏皮质和髓质区域的代表性切片。抄送：定量健康小管的面积（健康小管体积指数）、退化小管和间质空间的面积（间质体积指数）以及扩张小管的数量（小管扩张指数）*P（P）与Col4A3相比<0.001−/−;β6−/−带Col4A3−/−;β6+/−老鼠。

讨论

肾脏疾病的进展伴随着严重的组织重塑、炎症和纤维化病变的形成，最终导致肾脏组织结构的破坏和肾功能的丧失。这些事件的主要驱动因素涉及的关键分子机制包括TGF-β轴的错误调节，以及纤维化病变细胞中ECM蛋白及其受体的表达改变。36–38TGF-β的高表达是纤维化人类组织的标志，27–29TGF-β在促进组织纤维化中的功能重要性已被证明在体外在动物疾病模型中。TGF-β的过度表达足以诱导成纤维细胞活化和血管生成体内并激活器官型和细胞培养物中过量生产ECM。36,39,40相反，TGF-β信号转导的基因或药理学破坏可有效防止肺、皮肤和肾纤维化模型中的纤维化。32,34,35,41–43

几项针对TGF-β功能的系统性抑制（阻断单克隆抗体、rsTGF-？RII-Ig和TGF-。然而，所有这些方法的目的都是阻断TGF-β的活化形式，而阻断TGF--β活化的药物的治疗潜力仍然较少探索。αvβ6是一种TGF-β诱导的整合素，在上皮重塑部位表达，显示其作为潜在TGF-α的受体和激活剂发挥作用。11,17,44β6亚单位在几种肾脏疾病中上调，10在单侧输尿管梗阻小鼠模型中，其基因消融对损伤诱导的肾纤维化具有显著的保护作用。45在博莱霉素肺纤维化模型中观察到β6缺陷小鼠对纤维化的类似保护作用，表明αvβ6可以介导不同组织的纤维化。17,46有趣的是，在β6缺乏的肾脏中，单侧输尿管梗阻诱导的SMAD2磷酸化显著减弱，SMAD2是TGF-β信号传导的中枢介质，这表明αvβ6可能起作用体内作为TGF-β调节电路的一部分。45

先前对β6敲除小鼠的研究提供了证据，证明αvβ6可以在纤维化的发生中发挥作用，表明这种整合素是一种潜在的新治疗靶点。我们试图确定阻断单克隆抗体对αvβ6功能的药物抑制是否可以减轻Col4A3的肾纤维化−/−小鼠，常染色体隐性遗传Alport综合征的动物模型。30,31Alport综合征是一种由Col4A3、Col4A4或Col4A5基因突变引起的遗传性疾病。47这些基因的缺陷导致IV型胶原网络的异常组装以及肾小球和肾小管基底膜的异常形成。Alport患者发展为进行性肾小球肾炎，导致终末期肾病。我们观察到αvβ6在人类Alport综合征和小鼠Col4A3中上调−/−肾组织。在第4A3列中−/−小鼠肾脏中，αvβ6的表达增加在肾小管上皮中尤为显著，在此之前，伴随着SMA阳性细胞的广泛扩张和胶原沉积。基于这种表达模式，我们假设αvβ6在上皮损伤反应周期的早期就上调，并可能是持续性上皮损伤中纤维化发生和维持的重要介质。我们的研究结果表明，抗体介导的αvβ6阻断可抑制肾纤维化的发生和早期进展，并抑制其维持。与之前单侧输尿管梗阻β6缺乏小鼠模型的研究结果一致，45在我们的实验中观察到的αvβ6阻断单克隆抗体的抗纤维化作用与TGF-β活性和表达的降低有关。有趣的是，αvβ6单克隆抗体治疗后，TGF-β和SMA表达的明显下降不仅发生在αvβ6-阳性细胞的邻近区域，而且在相对远端的组织区域也可以检测到。尽管这一发现可能表明，αvβ6可以直接或间接地激活TGF-β轴，例如通过旁分泌自身激活TGF--β表达，但并不排除αvβ5阻断可能通过肾外效应提供保护，包括改变系统免疫功能。我们评估了αvβ6单克隆抗体治疗4周后小鼠血清中一些趋化因子和细胞因子的水平以及外周血的数量，发现没有显著变化（数据未显示）。此外，Col4A3肾脏中单核细胞的变化很小−/−用αvβ6单抗治疗或β6基因敲除的免疫组织化学方法检测肾脏（数据未显示）。通过αvβ6单克隆抗体治疗或移植研究评估免疫系统功能状态的进一步研究可以更全面地解决这一问题。

TGF-β途径的失调和过度活跃被认为是Col4A3肾脏疾病进展的重要机制−/−老鼠。6TGF-β回路的一个有趣的特征是TGF-α能够诱导自身表达，这可能有助于解释这种细胞因子在纤维化疾病中的明显主导作用。这增加了αvβ6阻断的抗纤维化作用可能至少部分通过间接机制介导的可能性。这可能包括通过改变局部炎症和纤维化以及干扰随后TGF-β活性增加对TGF-？表达的下游影响。由于αvβ6可以由TGF-β诱导并促进潜在的TGF-−/−肾脏病理学。我们比较了αvβ6单克隆抗体和rsTGF-βRII-Ig对Col4A3肾脏疾病相关转录物表达的影响−/−老鼠。这一比较揭示了αvβ6依赖基因与TGF-β的明显功能关联，以及αvβ6mAbs和rsTGF-αRII-Ig的基因调控模式的相似性。此外，Col4A3的治疗−/−αvβ6阻断单克隆抗体的小鼠抑制了TGF-β的肾脏表达。这些发现表明，抑制性αvβ6单克隆抗体的疾病改善作用可能是由于抑制TGF-β功能，可能是通过抑制αvβ6-介导的疾病组织中潜在TGF-。上述数据的一个有趣方面是通过阻断αvβ6或TGF-β抑制促炎症基因的表达。TGF-β具有良好的抗炎和免疫抑制功能；然而，在我们的实验中，rsTGF-βRII-Ig和抗αvβ6单克隆抗体的基因调控模式表明TGF-α在阿尔波特病模型中具有促炎作用。虽然这种明显的促炎作用的实际机制需要进一步研究，但它可能是基于TGF-β诱导上皮细胞生长停滞和死亡的已知能力。33,48–50由于上皮损伤为组织损伤早期固有免疫反应的激活提供了重要机制，因此我们的数据表明TGF-β的明显促炎作用可能是间接的，并由TGF-？促进的肾上皮损伤介导。根据该模型，αvβ6可能是TGF-β依赖性上皮重塑机制的重要组成部分，其在疾病中的功能失调可能进一步促进疾病相关的组织损伤和炎症。

应该注意的是，尽管Col4A3的治疗−/−使用αvβ6mAbs或rsTGF-βRII-Ig的小鼠抑制了间质和肾小球纤维化，我们观察到两种治疗都没有显著抑制蛋白尿和BUN水平（数据未显示）。之前在使用转化生长因子-β途径抑制剂rsTGF-βRII-Ig治疗的Alport小鼠中观察到类似的抗纤维化作用与肾功能进行性丧失的分离。在这些研究中，阻断TGF-β途径可抑制间质纤维化和肾小球纤维化，但不能改善肾小球功能，包括蛋白尿。不能影响肾功能的原因是由于Col4A3缺乏的肾小球基底膜（GBM）的成分不当导致足细胞过程的消失无法抑制。7与这些发现一致，我们通过透射电子显微镜在Col4A3的肾脏中观察到足细胞消失和GBM改变−/−;β6−/−小鼠（数据未显示）。这些发现表明，TGF-β途径的抑制不会改变Alport小鼠GBM的结构完整性。这些结果与Alport模型一致，该模型具有ColIV网络的异常组装和GBM的结构异常，这些异常导致肾小球和间质纤维化的发生和发展。Alport模型的其他研究也将抗纤维化作用与改善肾功能区分开来。51, 52鉴于越来越多的证据表明αvβ6是TGF-β轴的一个组成部分，上述研究结果表明，在肾纤维化中，TGF-α功能可能是调节肾脏炎症和成纤维细胞活化的中心，但对足细胞-GBM相互作用和GBM重塑的调节并不重要。

我们的研究结果表明，αvβ6在人类肾脏疾病中高度上调，用功能阻断抗体靶向αvβ5可能为肾纤维化的治疗调节提供一种有效的新途径。由于αvβ6的表达主要局限于病变组织中的上皮细胞，因此这种方法可以选择性地局部抑制TGF-β功能。由于TGF-β在多种细胞和组织类型中表达，并在调节许多不同的体内稳态过程中发挥重要作用，因此在αvβ6整合素上调的疾病中，阻断αvβ5的功能为全身抑制TGF-。

补充材料

补充材料：

致谢

我们感谢Mary Helen Barcellos-Hoff博士（加利福尼亚州伯克利市劳伦斯伯克利国家实验室）提供293个细胞异种移植物切片，以评估单克隆抗体在免疫组织化学中与活性和潜在TGF-β的结合。特别感谢Sarah Ryan（Biogen Idec）为开展Col4A3研究提供建议−/−老鼠。

脚注

向马萨诸塞州剑桥市剑桥中心12号Biogen Idec的Shelia M.Violette发送转载请求。.moc.cedinegoib@etteliov.ailehs（电子邮件）：liam-E

由国家卫生研究院/国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所部分资助，拨款55001丹麦克朗（发给R.K.）。

K.H.和M.E.L.对手稿的贡献相等。

本文的补充材料可以在上找到http://ajp.amjpathol.org.

工具书类

  • Okada H，Kalluri R.导致肾纤维化进展和消退的细胞和分子途径。当前分子医学。2005;5:467–474.[公共医学][谷歌学者]
  • Sheppard D.肺上皮整合素的功能：从发育到疾病。生理学评论。2003;83:673–686.[公共医学][谷歌学者]
  • Norman JT、Fine LG。进展性肾病：成纤维细胞、细胞外基质和整合素。实验肾病。1999;7:167–177.[公共医学][谷歌学者]
  • Border WA，Noble NA。转化生长因子-β和血管紧张素II在肾纤维化中的相互作用。高血压。1998;31:181–188.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang W，Koka V，Lan HY。转化生长因子-β和Smad信号在肾脏疾病中的作用。肾脏学。2005;10:48–56.[公共医学][谷歌学者]
  • Sampson NS、Ryan ST、Enke DA、Cosgrove D、Koteliansky V、Gotwals P。全球基因表达分析揭示了α1整合素在肾脏发病中的作用。生物化学杂志。2001;276:34182–34188.[公共医学][谷歌学者]
  • Cosgrove D、Rodgers K、Meehan D、Miller C、Bovard K、Gilroy A、Gardner H、Kotelianski V、Gotwals P、Amattucci A、Kalluri R.整合素α1β1和转化生长因子-β1在Alport肾小球病机中起着不同的作用，是代谢治疗的双重靶点。《美国病理学杂志》。2000;157:1649–1659. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hamerski DA，Santoro SA。整合素与肾脏：生物学和病理生物学。Curr Opin肾病性高血压。1999;8:9–14.[公共医学][谷歌学者]
  • Zambruno G、Marchisio PC、Marconi A、Vaschieri C、Melchiori A、Giannetti A、De Luca M。转化生长因子-β1调节β1和β5整合素受体并诱导正常人角质形成细胞中αvβ6异二聚体的从头表达：对伤口愈合的影响。细胞生物学杂志。1995;129:853–865. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Trevillian P、Paul H、Millar E、Hibbed A、Agrez MV、Alpha（v）beta（6）整合素在病肾和移植肾中的表达。肾脏Int。2004;66:1423–1433.[公共医学][谷歌学者]
  • Breuss JM、Gallo J、DeLisser HM、Klimanskaya IV、Folkesson HG、Pittet JF、Nishimura S、Aldape K、Landers DV、Carpenter W、Gillett N、Sheppard D、Matthay MA、Albelda SM、Kramer RH、Pytella R。β6亚单位在发育、肿瘤形成和组织修复中的表达表明在上皮重塑中起作用。细胞科学杂志。1995;108:2241–2251.[公共医学][谷歌学者]
  • Breuss JM，Gillett N，Lu L，Sheppard D，Pytella R.整合素β6 mRNA在灵长类动物上皮组织中的分布受限。组织化学与细胞化学杂志。1993;41:1521–1527.[公共医学][谷歌学者]
  • Häkkinen L、Hildebrand HC、Berndt A、Kosmehl H、Larjava H。人类口腔粘膜创伤愈合过程中tenascin-C、α9整合素亚基和αvβ6整合素的免疫定位。组织化学与细胞化学杂志。2000;48:985–998.[公共医学][谷歌学者]
  • Arend LJ，Smart AM，Briggs JP。小鼠β6整合素序列、表达模式和在肾脏发育中的作用。《美国肾脏病杂志》。2000;11:2297–2305.[公共医学][谷歌学者]
  • Häkkinen L、Koivisto L、Gardner H、Saarialho-Kere U、Carroll JM、Lakso M、Rauvala H、Laato M、Heino J、Larjava H。皮肤中β6-整合素表达增加导致慢性伤口自发发展。《美国病理学杂志》。2004;164:229–242. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Huang XZ，Wu J，Spong S，Sheppard D。整合素αvβ6对已知配体纤维连接蛋白和卵黄凝集素上的角质形成细胞迁移至关重要。细胞科学杂志。1998;111:2189–2195.[公共医学][谷歌学者]
  • Munger JS、Huang X、Kawakatsu H、Griffiths MJD、Dalton SL、Wu J、Pittet JF、Kaminski N、Garat C、Matthay MA、Rifkin DB、Sheppard D。整合素αvβ6结合并激活潜在TGFβ1：调节肺部炎症和纤维化的机制。单元格。1999;96:319–328.[公共医学][谷歌学者]
  • Yokosaki Y，Monis H，Chen A，Sheppard D。整合素α9beta1、αvbeta3和αvbeta 6对tenascin的细胞增殖反应的差异作用：β亚单位胞外和胞质域的作用。生物化学杂志。1996;271:24144–24150.[公共医学][谷歌学者]
  • Annes JP、Rifkin DB、Munger JS。整合素αvβ6结合并激活潜在的TGFβ3。FEBS信函。2002;511:65–68.[公共医学][谷歌学者]
  • Munger JS、Harpel JG、Gleizes PE、Mazzieri R、Nunes I、Rifkin DB。潜在转化生长因子-β：结构特征和激活机制。肾脏Int。1997;51:1376–1382.[公共医学][谷歌学者]
  • Khalil N.TGF-β：从潜伏到活跃。微生物感染。1999;1:1255–1263.[公共医学][谷歌学者]
  • Barcellos-Hoff MH.TGF-β控制中的潜伏期和激活。乳腺生物肿瘤杂志。1996;1:353–363.[公共医学][谷歌学者]
  • Weinreb PH、Simon KJ、Rayhorn P、Yang WJ、Leone DR、Dolinski BM、Pearse BR、Yokota Y、Kawakatsu H、Atakilit A、Sheppard D、Violette SM。功能块整合素αβ6单克隆抗体。生物化学杂志。2004;279:17875–17887.[公共医学][谷歌学者]
  • Barcellos-Hoff MH、Ehrhart EJ、Kalia M、Jirtle R、Flanders KC、Tsang ML-S。利用工程组织原位免疫组织化学检测活性转化生长因子-β。《美国病理学杂志》。1995;147:1228–1237. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Vielhauer V、Anders HJ、Mack M、Cihak J、Strutz F、Stangasinger M、Luckow B、Grone H-J、Schlondorff D。小鼠梗阻性肾病：进展性纤维化与肾小管间质趋化因子表达和CC趋化因子受体2-和5-阳性白细胞的积聚相关。《美国肾脏病杂志》。2001;12:1173–1187.[公共医学][谷歌学者]
  • Anders HJ、Vielhauer V、Frink M、Linde Y、Cohen CD、Blattner SM、Kretzler M、Strutz F、Mack M、Grone H-J、Onuffer J、Horuk R、Nelson PJ、Schlondorff D。趋化因子受体CCR-1拮抗剂可减少单侧输尿管结扎后的肾纤维化。临床投资杂志。2002;109:251–259. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamamoto T、Nakamura T、Noble NA、Ruoslahti E、Border WA。转化生长因子β在人类和实验性糖尿病肾病中的表达升高。美国国家科学院程序。1993;90:1814–1818. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamamoto T、Noble NA、Cohen AH、Nast CC、Hishida A、Gold LI、Border WA。转化生长因子-β亚型在人类肾小球疾病中的表达。肾脏Int。1996;49:461–469.[公共医学][谷歌学者]
  • Shihab FS、Yamamoto T、Nast CC、Cohen AH、Noble NA、Gold LI、Border WA。人类肾移植急性和慢性排斥反应中转化生长因子β和基质蛋白的表达。《美国肾脏病杂志》。1995;6:286–294.[公共医学][谷歌学者]
  • Cosgrove D、Meehan D、Grunkemeyer JA、Kornak JM、Sayers R、Hunter WJ、Samuelson GC。胶原COL4A3基因敲除：常染色体Alport综合征小鼠模型。基因发育。1996;10:2981–2992.[公共医学][谷歌学者]
  • Miner JH，Sanes JR。缺乏胶原蛋白α3（IV）的小鼠肾脏的分子和功能缺陷：与Alport综合征的关系。细胞生物学杂志。1996;135:1403–1413. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sharma K、Jin Y、Guo J、Ziyadeh FN。抗TGF-β抗体中和TGF-α可减轻STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏肥大并增强细胞外基质基因表达。糖尿病。1996;45:522–530.[公共医学][谷歌学者]
  • Miyajima A、Chen J、Lawrence C、Ledbetter S、Soslow RA、Stern J、Jha S、Pigato J、Lemer ML、Poppas DP、Vaughan ED、Felsen D。转化生长因子-β抗体可改善单侧输尿管梗阻患者的肾小管凋亡。肾脏Int。2000;58:2310–2313.[公共医学][谷歌学者]
  • Ziyadeh FN、Hoffman BB、Han DC、Iglesias-de la Cruz MC、Hong SW、Isono M、Chen S、McGowan TA、Sharma K。通过单克隆抗转化生长因子-β抗体治疗肾功能不全、过度基质基因表达和肾小球系膜基质扩张的长期预防分贝/分贝糖尿病小鼠。美国国家科学院程序。2000;97:8015–8020. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kasuga H、Ito Y、Sakamoto S、Kawachi H、Shimizu F、Yuzawa Y、Matsuo S。抗TGF-βII型受体抗体对实验性肾小球肾炎的影响。肾脏Int。2001;60:1745–1755.[公共医学][谷歌学者]
  • Roberts AB，Sporn MB。TGF-β对内皮细胞生长、结构和基质合成的调节。美国Rev Respir Dis。1989;140:1126–1128.[公共医学][谷歌学者]
  • Eickelberg O，Kohler E，Reichenberger F，Bertschin S，Woodtli T，Erne P，Perruchoud AP，Roth M.初级人类肺成纤维细胞对TGF-beta1和TGF-beta3的反应中细胞外基质沉积。美国生理学杂志。1999;276：L814–L824。[公共医学][谷歌学者]
  • Varga J、Rosenbloom J、Jimenez SA。转化生长因子β（TGF-β）导致正常人皮肤成纤维细胞中I型和III型胶原和纤维连接蛋白mRNA的稳态数量持续增加。生物化学杂志。1987;247:597–604. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • König A，Bruckner-Tuderman L.转化生长因子-beta促进改良器官型皮肤模型中VII型胶原的沉积。实验室投资。1994;70:203–209.[公共医学][谷歌学者]
  • Sime PJ，Xing Z，Graham FL，Csaky KG，Gauldie J.腺病毒介导的活性转化生长因子-β1基因转移诱导大鼠肺长期严重纤维化。临床投资杂志。1997;100:768–776. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 新泽西州拉平。肾脏疾病中的ALK5抑制。当前操作药理学。2003;三:204–208.[公共医学][谷歌学者]
  • Bonniaud P、Kolb M、Galt T、Robertson J、Robbins C、Stampfli M、Lavery C、Margetts PJ、Roberts AB、Gauldie J.Smad3空白小鼠出现空域扩大，并对TGF-β介导的肺纤维化具有抵抗力。免疫学杂志。2004;173:2099–2108.[公共医学][谷歌学者]
  • Inazaki K、Kanamaru Y、Kojima Y、Sueyoshi N、Okumura K、Kaneko K、Yamashiro Y、Ogawa H、Nakao A.Smad3缺乏可减轻单侧输尿管梗阻后的肾纤维化、炎症和细胞凋亡。肾脏Int。2004;66:597–604.[公共医学][谷歌学者]
  • Sheppard D.整合素介导的转化生长因子激活-{测试}1肺纤维化。胸部。2001;120：49S–53S。[公共医学][谷歌学者]
  • Ma LJ，Yang H，Gaspert A，Carlesso G，Barty MM，Davidson JM，Sheppard D，Fogo AB。β6−/−小鼠肾小管间质纤维化诱导的转化生长因子依赖和独立途径。《美国病理学杂志》。2003;163:1261–1273. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kaminski N、Allard JD、Pittet JF、Fengrong Z、Griffiths MJD、Morris D、Huang X、Sheppard D、Heller RA。对肺纤维化基因表达的全面分析揭示了调节肺部炎症和纤维化的不同程序。美国国家科学院程序。2000;97:1778–1783. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Torra R、Tazon-Vega B、Ars E、Ballarin J.IV型胶原蛋白({阿尔法}3-{阿尔法}4)肾病：从孤立性血尿到肾衰竭。肾拨号移植。2004;19:2429–2432.[公共医学][谷歌学者]
  • Böttinger EP，Bitzer M.TGF-β在肾脏疾病中的信号传导。《美国肾脏病杂志》。2002;13:2600–2610.[公共医学][谷歌学者]
  • Goumenos DS、Tsamandas AC、El Nahas AM、Thomas G、Tsakas S、Sotsiou F、Bonikos DS、Vlachojannis JG。人类肾小球疾病中的细胞凋亡和肌成纤维细胞表达：与转化生长因子-beta-1的可能联系。Nephron公司。2002;92:287–296.[公共医学][谷歌学者]
  • Dai C，Yang J，Liu Y.转化生长因子-beta1通过一种不依赖Smad信号的机制增强肾小管上皮细胞死亡。生物化学杂志。2003;278:12537–12545.[公共医学][谷歌学者]
  • Chen D、Jefferson B、Harvey SJ、Zheng K、Gartley CJ、Jacobs RM、Thorner PS。环孢霉素A减缓Alport综合征进展性肾病（X连锁遗传性肾炎）：来自犬模型的结果。《美国肾脏病杂志》。2003;14:690–698.[公共医学][谷歌学者]
  • Ninichuk V、Gross O、Segerer S、Hoffman R、Radomska E、Buchstaller A、Huss R、Akis N、Schlondorff D、Anders HJ。在胶原蛋白4A3缺乏小鼠中，多功能间充质干细胞可减少间质纤维化，但不会延缓慢性肾脏疾病的进展。肾脏Int。2006;70:121–129.[公共医学][谷歌学者]
文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会