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美国国家科学院院刊。2000年10月24日；97(22): 12210–12215.
2000年10月17日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.210391497
预防性维修识别码：PMC17320型
PMID：11035787

MHCⅠ类限制性CD8+T细胞的抗菌活性人类结核病

孙嘉秋（Sungae Cho）,* 维杰·梅赫拉,†‡ Sybill Thoma-Uszynski公司,* 斯特芬·斯坦格,* 纳塔利亚·塞尔比纳,§ 理查德·马扎卡罗,† 乔安·弗林,§ 彼得·巴恩斯, 斯科特·索斯伍德,‖ 埃斯特班·塞利斯,‖ 巴里·布鲁姆,** 罗伯特·莫德林,*‡‡††§§和亚历山德罗·塞特‖
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

结核病感染小鼠模型的研究表明MHCⅠ类限制性CD8+T细胞在保护性免疫。定义抗原和表位结核分枝杆菌（MTB）蛋白质将感染细胞呈现给CD8+T细胞，我们筛选出40个MTBHLA I类A*0201-结合基序的蛋白质。结合肽随后对纯化的HLA分子进行了高亲和力分析用于CD8+细胞毒性T淋巴细胞识别。我们确定了三个结核病康复患者CD8+T细胞识别的表位感染。这三个表位来自三个不同的表位抗原：胸苷酸合成酶（ThyA30–38)，RNA聚合酶β-亚基（RpoB127–135)和一种假定的磷酸盐运输系统渗透酶蛋白A-1（PstA175–83).此外，CD8+T细胞系对三种肽具有特异性（蒂亚30–38，磅/平方英寸75–83、和85亿15–23)由外周血单个核细胞生成正常HLA-A*0201供体细胞。这些CD8+T细胞系通过产生MTB感染的巨噬细胞IFN-γ和受感染靶细胞的裂解。最后，CD8+细胞毒性T淋巴细胞降低了细胞内MTB的活性MHCⅠ类CD8+T细胞识别受限的证据这些MTB抗原的表位有助于有效免疫对抗病原体。

因为结核病每年导致300万人死亡，研制疫苗控制和根除感染是一项尚未满足的重要医疗需求(1). 小鼠保护性免疫机制分析表明MHC I类和II类限制性T细胞有助于提高对结核病的免疫力。MHCⅡ类限制性CD4+T细胞释放淋巴因子，如IFN-γ和肿瘤坏死因子-α导致巨噬细胞活化。更重要的是，β2-微球蛋白(β2m） -缺陷小鼠不能发育成MHCI类限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）并迅速屈服于结核分枝杆菌（MTB）感染(2). 这条路保护性免疫似乎与CD8+T细胞有关(2–4)和抗原处理相关转运体（TAP）依赖性肽抗原的呈现(5). 此外，CD8+T细胞不仅能够裂解MTB感染的细胞，但也可以同时杀死抗菌肽释放引起的细胞内细菌颗粒溶素(6,7).

一些实验室已经开始鉴定MTB肽由人类MHC I类分子向T细胞表达及其作用这些T细胞在控制感染中发挥作用。例如，肽源自19kDa蛋白（膜结合脂蛋白）和ESAT 6蛋白质（早期分泌蛋白）已被鉴定为免疫原性对于I类限制的CD8+CTL(8,9). MHC I类限制CTLMTB蛋白的特异性可由替代类I产生抗原处理途径(10). 肽的其他途径可能涉及演示(11).

在这里，我们定义了几个新的T细胞表位，它们来源于不同的流行的MHC I类蛋白抗原分子，HLA-A*0201。此外，表位特异性CD8+T细胞识别MTB感染的靶点，能分泌IFN-γ，裂解靶点细胞，并杀死细胞内细菌。因此，MHC类I限制性CD8+T细胞对MTB抗原的反应可能有助于有效抵抗病原体。

材料和方法

研究对象。

在本研究中，外周血单个核细胞的反应性研究了11名HLA-A*0201个体的PBMC。其中六个受试者经培养证实患有结核病，并在洛杉矶被发现县-南加州大学医学中心。五个科目是健康的正常献血者，一个是芽孢杆菌卡米特-盖林接种了疫苗，其他人没有接种。通过Ficoll/Hypaque密度分离每个个体的PBMC梯度分离（法玛西亚）。定义HLA类型，流式细胞术使用抗HLA-A2单克隆抗体进行分析（MA2.1），然后是FITC-标记的山羊抗鼠药F（ab′）2碎片。HLA亚型A*0201为经专门为HLA-A2亚型（Dynal，Great Neck，NY）。

细胞系。

.221A2（由美国大学Robert DeMars提供威斯康星-麦迪逊）是一种爱泼斯坦-巴尔病毒转染的B细胞系对HLA抗原进行诱变和筛选，然后转染HLA-A*0201。K562细胞[美国型培养物收藏（ATCC）]，一种人类红白血病细胞系，被添加到所有CTL分析中，作为抑制自然杀伤细胞活性的冷靶细胞系。THP-1型细胞，即骨髓前单核细胞系（ATCC），被用作靶细胞MTB感染实验。

肽合成。

肽的合成如前所述(12)或，对于大型表位文库作为原始材料从Mimotopes（Chiron）。通过以下方法将肽纯化至>95%的均一性反相高效液相色谱法和通过分析测定的纯度反相柱。氨基酸分析证实了序列和/或质谱分析。

HLA-A*0201-结合试验。

用1-10培养纯化的人类I类分子（5-500 nM）纳米125放射性标记探针肽和碘用氯胺T法(13)室温下48小时1μM人β的存在2m（斯克里普斯加利福尼亚州圣地亚哥实验室）和蛋白酶抑制剂的混合物。这个蛋白酶抑制剂的最终浓度为：1 mM PMSF/1.3 nM1.10菲咯啉/73μM胃蛋白酶抑制素A/8 mM EDTA/200μMN-α-对甲苯基赖氨酸氯甲基酮。

通过凝胶从游离肽中分离出I类肽复合物TSK200色谱柱过滤（TosoHaas，Montgomeryville，PA）和如前所述计算的结合肽的分数(14). 在初步实验中，HLA I类制剂在存在固定量的放射性标记肽以测定结合10–20%总放射性。所有后续抑制和直接结合然后使用这些I类浓度进行分析。在抑制试验，肽抑制剂通常在浓度范围为120μg/ml至1.2 ng/ml。数据为然后绘制曲线，测量产生50%抑制的剂量。在两到四个完全独立的实验中测试了肽。因为在这些条件下[标签]<[MHC]和K（K）d日<[MHC]，测量值集成电路50s是真实值的合理近似值K（K）d日值。作为无线电标记控件探针肽，A F6→HBV核心的Y模拟物18-27肽（序列FLPSDYFPSV）(12)已使用。平均值集成电路50第s页，共F页6→的Y模拟用于A*0201分析的HBV核心18-27肽为5.0 nM。

肽序列。

肽序列及其相应的亲和力如所示补充表格（参见网址：www.pnas.org). 肽序列用于生产CTL生产线的如下：蒂亚30–38是RLPLVLPAV（集成电路50=5.1 nM），来源于胸苷酸合成酶（GenBank登录号。X59273型)，RNA聚合酶β亚单位蛋白质（RpoB127–135)是MTYAAPLFV（集成电路）50=13.8 nM），来源于RNA聚合酶β-亚单位（GenBank登录号。L27989型),85B个15–23是LMIGTAAAV（集成电路50=79.0 nM），来源于抗原85B（GenBank登录号。第31952页)和磷酸盐运输系统渗透蛋白A-1（PstA1）；第11页75–83是SLYFGGICV（集成电路）50=10.6 nM），来自假定的磷酸盐运输系统通透蛋白A-1（GenBank登录号。X75297型).在本研究中，PstA1基因的翻译起始位点为暂时定义为312-bp上游区域，因为该上游区域包含的平移起始点HLA-A*0201分子的高亲和力结合物，及其上游区域不能从以下阅读框中排除(15).

体外从结核病中诱导召回CTL反应患者。

通过密度梯度法从患者血液中分离出PBMC离心并在RPMI 1640介质中重新悬浮（生命科技，纽约州格兰德岛）补充2 mM我-谷氨酰胺/1 mM丙酮酸钠/100单位/ml青霉素/100μg/ml链霉素加上10%的混合人血清，在24孔板中以3×106细胞/孔。添加合成肽以10μg/ml的最终浓度接种PBMC培养物将重组IL-2（rIL-2；Chiron）以浓度为10单位/ml。第7天，培养物为用照射过的（3500 rad）自体单核细胞重新刺激在3μg/mlβ2m持续2小时。第10天和第12天，第10天向每个孔中添加单位/ml的rIL-2。细胞溶解活性在第14天测试培养的PBMC。

CTL分析。

细胞溶解活性通过标准的4小时测定51铬释放试验。约2×106靶细胞（.221A2细胞或巨噬细胞）用肽（10μg/ml）预脉冲β2m（3μg/ml）过夜。这些细胞是然后用100μCi-Na标记51CrO4在37°C。清洗后，用不同的200μl RPMI总反应体积中效应细胞的比率在微量滴定板中添加10%的FBS（生命科技）。为了抑制NK细胞活性，添加了20倍过量的K562细胞进入每口井。培养4小时后，100μl上清液从每口井中取出，并将其放射性计算为γ计数器。使用以下公式计算比溶解度（%）100×（实验释放-自发释放）/（最大释放-自发释放）。最大释放量根据通过添加1%Triton X-100裂解靶细胞上清液。从靶细胞上清液中测定自发释放只与培养基一起培养。

利用HLA-A*0201正常供者建立CTL系在里面维特罗免疫接种。

主要在体外进行了CTL诱导实验根据两种不同的方法。第一种方法由济等。(16)50%产生抗原特异性CTL共次尝试。简言之，树突状细胞（DC）是通过培养产生的800单位/ml重组粘附单核细胞粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（遗传研究所，马萨诸塞州坎布里奇）和1000单位/ml rIL-4（先灵葆雅）周。第7天，DC用40μg/ml肽脉冲4小时和3μg/mlβ2m.CD8+T细胞富集免疫磁珠（纽约州大颈市戴纳尔）。DC受到辐照（4200 rads）并与CD8+T细胞以1:20 DC比CD8+T细胞在10 ng/ml rIL-7（Genzyme）的存在下。上第二天，添加人rIL-10（10 ng/ml，DNAX）。每个人每周用肽脉冲自体单核细胞刺激培养，在第1天和第2天分别添加rIL-10和rIL-2每个再刺激周期。经过三四轮再刺激，每种培养物的样本都用表现出特异性细胞毒性的培养物进一步扩大实验。

第二种方法用于在体外CTL诱导后普列班斯基协议等。(17)并取得了更大的成果用于分析的T细胞数量，以及提供抗原特异性大约70%的尝试CTL。简言之，HLA-A*0201的PBMC供体以3×50μg/ml肽脉冲107Iscove改良Dulbecco细胞/ml37°C培养基（Life Technologies）培养90分钟。这些细胞是以3×10的速度清洗和电镀6细胞/孔与rIL-7（10 ng/ml）和锁孔帽贝混合的10%人血清中血蓝蛋白（5μg/ml，Sigma）。每周用肽脉冲贴壁放射自体并补充rIL-2，每3-4天10单位/ml。经过四到五个循环再刺激后，CD4+T细胞被耗尽，剩下的如前所述，每周对富含CD8+的T细胞（80-90%）进行重新刺激以上。

MTB感染巨噬细胞的细胞毒性试验。

巨噬细胞是通过在RPMI中培养粘附的单核细胞产生的10%人AB血清（Omega Scientific，Tarzana，CA），持续2-4天。这些巨噬细胞随后在感染的多重性在5-10之间。18–20小时后感染，细胞外MTB通过差异化清除离心法去除非吞噬细胞细菌和受感染的细菌细胞培养4天后用作CTL分析的靶细胞。根据Kinyoun酸速细菌法（Difco）。对于细胞毒性实验，1–2×106巨噬细胞标记为100μCi51Cr在37°C，然后以4×10三细胞/孔。CD8+T细胞系在各种效应器/目标比率。比溶解度（%）测定为如上所述。

受MTB感染的THP-1的MTB活性计数和IFN-γ释放测定细胞。

用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）预处理THP-1细胞（10 ng/ml）（钙生物化学）24小时以诱导分化和坚持。PMA处理的THP-1细胞单层受到脉冲感染MTB的多重感染率为每细胞5株杆菌6小时，清洗以去除细胞外细菌。MTB肽特异性CD8+T细胞与MTB感染的THP-1细胞或在CD8+T细胞与THP-1比率存在MTB衍生肽的情况下20:1持续24小时。阻断抗HLA I类单克隆抗体（W6/32）和同型匹配的对照抗体（IgG2a）用于证明MHC I类限制对感染者的识别细胞。用ELISA（Endogen，马萨诸塞州剑桥市）在用脉冲或非脉冲肽刺激后将THP-1细胞培养20–24小时。为了检测MTB活性，对细胞进行裂解使用皂苷（0.3%最终浓度）和10倍连续稀释液将细胞裂解液涂布在7H11 Middlebrook琼脂平板上在孵育21天后，计数了大肠杆菌单位（CFU）。

结果

HLA-A*0201潜在免疫显性MTB肽的合成限制CD8+CTL。

在这项研究中，我们报告了大约GenBank数据库中40个可用的MTB蛋白序列。1995年，当这项研究开始时，我们分析了这些MTB蛋白根据HLA-A*0201 I类的潜在T细胞表位使用前面描述的计算机实现分子结合基序算法(18). 从该分析中，共有222个序列（或9个或10个mers）被鉴定含有HLA-A*0201分子。合成的肽与候选序列，以及每个肽与可溶性的结合亲和力HLA-A*0201的测定如前所述(14). 从这些实验中，我们确定27个肽具有高亲和力（3.3<集成电路50≤50 nM）和58肽与中间亲和力结合（50<IC50≤500 nM）（参考补充表1和2，网址：www.pnas.org).先前的研究表明，这些亲和力水平与具有人CTL的抗原性和免疫原性(14,19).因此，选择这85个肽进行进一步研究针对免疫显性抗原和肽的鉴定来源于MTB蛋白。

用召回CTL筛选MTB衍生肽的免疫原性结核病患者PBMC的反应。

测试这些肽在自然过程中的免疫优势对于感染，存在针对每种感染的召回CTL响应使用HLA-A*0201结核患者的PBMC评估肽。内存通过刺激结核患者的整个PBMC来回忆CTL反应用每种肽刺激1周，并用自体饲养细胞用相同的肽脉冲如下周。在第14天，通过4-小时铬测定CTL活性释放试验。以前的研究表明，这种分析策略检测召回响应(20)，而重复刺激使用DC诱导初级CTL反应(16). 召回CTL响应是从用来源于蒂亚30–38，磅/平方英寸75–83,和RpoB127–135（图。​（图1）。1).召回针对ThyA的CTL响应30–38和卢比127–135在两个样本中的一个样本中观察到肽患者接受测试。第11页75–83-特定响应在三名受试患者中有两名被观察到。演示召回CTL反应表明，这些肽被加工并在自然感染期间呈现给T细胞。有趣的是，这些表位来自体细胞蛋白，表明体细胞细胞内MTB复制产生的蛋白质通过MHC I类呈现途径进行处理和呈现。

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结核病患者的CTL反应。来自结核病患者的PBMC（HLA-A*0201）用单个MTB肽刺激1周并重新刺激多肽脉冲自体单核细胞治疗一周。这个在第14天通过以下方法测试这些培养的PBMC的细胞溶解活性51铬释放试验。(一)CTL活性对胸腺嘧啶核苷酸合成酶（氨基）衍生的9肽具有特异性酸30–38）。(b)针对9-mer的CTL活性来自RNA聚合酶β亚基的肽（氨基酸127-135）。(c)来源于PstA1（氨基酸75–83）。

MTB衍生的特异性CD8+T细胞系的产生肽。

为了验证CD8+T细胞对这些表位的反应可以也可在未感染者中诱导，在体外CD8+CTL进行了诱导实验。未感染PBMC每周刺激HLA-A*0201个人5-6周用胸腺嘧啶A脉冲自体PBMC30–38或第11页75–83在该方案之后，CD8+细胞系对任一胸腺有细胞毒性30–38或第11页75–83生成肽（图。​（图2）。2). 这些CTL线是特定的对脉冲靶细胞和非脉冲靶细胞具有更强的细胞毒活性。在此外，对靶细胞几乎没有细胞毒活性用来自流感的无关A*0201-binding表位脉冲病毒基质蛋白（NP58–66). 此外，这种细胞毒性活性似乎受到I类限制，因为这些肽特异性反应被HLA类抑制I-特异性抗体，W6/32（数据未显示）。

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未感染人外周血单个核细胞产生的CTL株的细胞裂解活性主题依据在体外免疫接种。PBMC来自未感染MTB的HLA-A*0201供体为在体外免疫的生成肽特异性CTL株，ThyA30–38(a–c)和PstA175–83.(d–f日). 细胞系(一)N1–091，(c)M7–091，以及(（f）)M7–029是由蔡氏方法生成等。(16). 细胞系(b)M23–091(d日)M22–029，和(e（电子）)M23–029是通过普列班斯基方法生成的等。(17).

CD8+T细胞识别MTB感染的巨噬细胞：释放干扰素-γ。

为了证明这些表位在受感染的细胞，我们用MTB和特定CTL线路的测量识别，如所示IFN-γ的释放。两条T细胞系，M23–091和M22–029，ThyA专用30–38和第11页75–83分别分泌IFN-γ特别是针对MTB感染的细胞（图。​（图3三 一和b). 这个MTB感染靶点诱导的IFN-γ量与用M22–029的相应肽激活，但在M23–091的情况。对于其中一条线路，我们证明了这一点HLA I类抗体W6/32抑制了反应（图。​（图3三c). 这些数据提供了人类MHC等级的证据胸腺特异性I限制性CD8+T细胞30–38和PstA175–83抗原识别MTB感染目标细胞。

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MTB肽特异性CTL刺激后IFN-γ释放MTB感染细胞和MTB肽脉冲细胞。CD8+T细胞株特异性的(一和c)胸腺A30–38肽（M23–091）。(b)第11页75–83肽以20:1的比例与MTB感染的THP-1细胞共培养。在一些培养物，肽，或者ThyA30–38或第11页75–83，被添加到文化中。上清液是收集并检测IFN-γ。(c)MHC公司使用抗HLA I类抗体评估限制性（W6/32）。同型匹配抗体（IgG2a）被用作控件。

MTB感染巨噬细胞CTL株的细胞毒性。

CTL溶解感染目标的能力被认为有助于通过释放细菌来控制感染被新激活的巨噬细胞以低多重性上升并被破坏(21). 确定这些CD8+T细胞是否能裂解感染的靶细胞细胞，异源HLA-A*0201单核细胞感染MTB和用作CD8+T细胞系的靶点（图。​（图4）。4). 如果是蒂亚30–38-特定线路，约10%MTB感染的靶细胞在效应靶比为45:1，观察到12%的特异性溶解在肽脉冲细胞中。相反，在未脉冲细胞。T细胞系（M23–029）专为第11页75–83在感染巨噬细胞（65%）和肽脉冲巨噬细胞（90%）。在此外，CD8+T细胞系与抗原85B的肽15-23结合最丰富的培养滤液蛋白，也能识别与裂解相比，MTB感染的靶细胞裂解率为40%24%的非脉冲靶细胞。应该指出的是大约40-60%的目标被感染，因此特定的杀戮只能达到这个水平。总之，这些数据表明CD8+T细胞能够识别和溶解MTB感染的靶点细胞。

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CD8+T细胞系对MTB感染的巨噬细胞的细胞毒性。来自异源HLA-a*0201供体的巨噬细胞感染了MTB每细胞感染5–10个杆菌(一和b)或THP-1在每细胞5～10株细菌感染的多重性(c).检测MTB感染的THP-1细胞和相应的肽脉冲THP-1用于裂解51铬释放试验，通过与(一)蒂亚30–38肽特异性系（M23–091）(b)第11页75–83肽特异性的行，和(c)85B个15–23肽特异性的线路（N11–023）。

MTB肽特异性CD8+细胞系对细胞存活能力的影响细胞内MTB。

我们之前的数据表明，CD8+、CD1-限制性CTL可以裂解MTB感染巨噬细胞并降低细胞内活性粒溶素粒依赖性释放引起的MTB(7). 我们接下来确定MTB-reactive MHC class I restricted CD8+CTL是否也可能介导抗菌活性。MHC的免疫标记I类限制性CD8+T细胞系（未显示数据）说明了存在含有穿孔素和粒溶素的细胞溶解颗粒。CD8+CTL与感染靶点共培养20小时后，用CFU检测细胞内MTB的活性。CD8+CTLThyA专用30–38（M23–091）直接CFU测定细胞内MTB活性降低52%从含或不含CD8+T细胞的MTB感染的THP-1中获得。肽ThyA的添加30–38到这些培养物增强了对MTB生长的抑制（图。​（图5）。5). 类似地，CD8+CTL针对第11页75–83肽诱导34%的生长抑制MTB和添加肽第11页75–83培养促进生长抑制。综上所述，这些数据表明MTB反应MHCⅠ类限制性CD8+CTL介导抗菌活性对抗结核杆菌。

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肽特异性CD8对细胞内MTB生长的抑制作用+T细胞。将MTB肽特异性CD8+T细胞系与存在或不存在MTB-衍生的MTB-感染的THP-1细胞肽或对照肽的效应靶比为20:1。细胞裂解和CFU测定。感染THP-1的CFU在M23–091的实验中，24小时时的T细胞为167000对M22.029进行了测试，并对66400进行了测试。

讨论

结核病是一个主要的公共卫生问题和经济负担由于与疾病相关的发病率和死亡率疾病(1). 由于出现这种情况，发病率一直在增加耐多药结核分枝杆菌菌株(22). 这导致了努力开发疫苗以预防这种致命疾病。中的研究小鼠模型表明MHCⅠ类介导的CD8+细胞毒性T细胞在结核病的保护性免疫中起着关键作用。这些CD8+T细胞可以通过at促进对MTB感染的免疫反应至少有三种可能的途径：释放IFN-γ，裂解感染目标，并具有直接的抗菌活性。现在这项研究提供了证据表明人类MHCⅠ类限制性CD8+T细胞识别MTB感染的细胞并释放IFN-γ，溶血剂感染靶细胞，杀死细胞内细菌。

有令人信服的证据表明CD8+T细胞是结核病保护性免疫机制：(我)收养的转移和细胞耗竭研究体内有证明CD8+T细胞参与控制MTB感染(三,23,24); (ii（ii）)CD8+T细胞系和克隆可以识别MTB抗原在体外，溶血性MTB感染巨噬细胞以抗原特异性的方式，并限制巨噬细胞中的MTB(25–29); 和(三)β2m缺陷小鼠和TAP缺陷小鼠不能表达MHC I类分子的小鼠会死于MTB感染(2,5,30). 由于这些原因努力确定MHC I类可呈现的MTB表位CD8+T细胞的分子。在本研究中，我们筛选了40个分泌和体细胞MTB蛋白鉴定HLA-A*0201结合具有回忆记忆CD8+T细胞反应能力的肽。我们的研究揭示了四个新的表位，其中三个来自体细胞蛋白，其中一种来自分泌蛋白。识别这些表位的CD8+T细胞也识别MTB感染的靶细胞表明这些表位进入宿主细胞细胞质，允许通过I类途径进行处理和展示。以前的研究表明在细菌所在的吞噬体和宿主细胞的胞浆提供MHC I级演示途径(31,32).

MTB肽表位反应性CD8+T细胞株释放IFN-γ识别MTB感染的靶细胞，提供一种机制这种T细胞亚群可能有助于免疫感染。对小鼠模型的研究表明IFN-γ对病原体的成功应答。干扰素-γ基因敲除基因抗性C57BL/6背景下的（gko）小鼠死于致命的MTB感染，中位生存时间为17天(33,34)而90%的室友控制组幸存下来感染20周以上。CFU增加超过1在gko中，15天时肝脏、脾脏和肺出现对数老鼠。这表明IFN-γ是保护鼠标免受MTB挑战。干扰素-γ与肿瘤坏死因子-α协同诱导诱导型一氧化氮合成酶与小鼠巨噬细胞产生一氧化氮我们证明对MTB有细胞杀伤作用(35).

MHCⅠ类限制性T细胞的第二种机制有助于宿主防御MTB感染的能力是lyse感染靶细胞。在我们的研究中，CD8+T细胞裂解MTB感染单核细胞/巨噬细胞谱系的靶标。这个感染细胞的持续溶解可能导致细菌释放从这个安全的细胞内港口，这样它们就可以被低浓度吸收新活化巨噬细胞的多重性和破坏(21).

最终，免疫反应必须摧毁和处置病原体成功防御宿主抵抗微生物侵略者。CD8+T细胞可以通过释放穿孔素和颗粒溶素。以下人员的在场这些CD8+T细胞中的穿孔素和粒溶素均通过组织化学染色。这些CD8+T细胞同时裂解MTB感染靶点，并通过30–50%. 虽然CFU减少的幅度不是巨大的，这种程度的减少可能具有生物学意义作为人类MTB感染的角色，只需要10–100个杆菌。这些数据提供了新的证据，证明MTB-反应MHC类I限制T细胞识别MTB感染的靶点并杀死细胞内生物体。

总之，我们证明人类MHC类I限制MTB蛋白表位特异性CD8+T细胞参与宿主通过释放IFN-γ、裂解受感染的靶细胞进行防御，以及直接杀死细胞内细菌MTB感染者的肽反应CD8+T细胞提示这些表位是在感染。这些细胞也可以在正常个体中被诱导HLA-A*0201亚型，提示它们可能对结核病感染的免疫预防。有趣的是，其中一些表位来自MTB的体细胞蛋白，提供了证据非分泌型MTB抗原可以进入MHC I类处理和呈现路径。进一步分析将确定将这些表位纳入疫苗可提供保护对这种致命病原体的免疫力。

补充材料

补充表格：

致谢

我们感谢Lisa Butterfield和James Economou的技术支持和科学建议。我们也感谢Kevin Moore（DNAX）提供的IL-10。这个这项工作部分得到了美国国家科学院的资助健康（AI 22553、AR 40312、AI 07118、AI 95362和AI 27285）和德国癌症研究所（D.K.F.Z.）。

缩写

曼恩商用车公司结核分枝杆菌
结核肺结核
蒂亚胸苷酸合成酶
第11页磷酸盐运输系统通透蛋白A-1
中国人民银行外周血单个核细胞
CTL公司细胞毒性T淋巴细胞
CFU（循环流化床）防上校部队
β2米β2-微球蛋白
爱尔兰共和国重组白细胞介素

脚注

印刷前在线发布的文章：程序。国家。阿卡德。科学。美国,10.1073/pnas.210391497。

文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.210391497

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院