美国国家科学院院刊。2000年10月24日；97(22): 12204–12209.
确定T细胞共刺激受体CTLA-4何时必须用于抑制糖尿病性T细胞
,*† ,‡ ,‡ ,*§¶和*§
弗雷德·吕德
*盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire）et Cellulaire，国家科学研究中心/研究所国立圣母医院/大学路易斯·巴斯德，地址：1 rue Laurent Fries，67404 Illkirch，C.U.de Strasbourg，法国；和‡霍华德·休斯癌症医学研究所分子与细胞生物学系研究实验室，加州大学伯克利分校生命科学附加415号94720
辛西娅·钱伯斯
*盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire）et Cellulaire，国家科学研究中心/研究所国立圣母医院/大学路易斯·巴斯德，地址：1 rue Laurent Fries，67404 Illkirch，C.U.de Strasbourg，法国；和‡霍华德·休斯癌症医学研究所分子与细胞生物学系研究实验室，加州大学伯克利分校生命科学附加415号94720
詹姆斯·艾利森
*盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire）et Cellulaire，国家科学研究中心/研究所国立圣母医院/大学路易斯·巴斯德，地址：1 rue Laurent Fries，67404 Illkirch，C.U.de Strasbourg，法国；和‡霍华德·休斯癌症医学研究所分子与细胞生物学系研究实验室，加利福尼亚大学，415 Life Sciences Addition，加利福尼亚州伯克利94720
克里斯托夫·贝诺伊斯特
*盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire）et Cellulaire，国家科学研究中心/研究所国立圣特和医学研究院/大学路易斯·巴斯德，地址：1 rue Laurent Fries，67404 Illkirch，C.U.de Strasbourg，法国；和‡霍华德·休斯癌症医学研究所分子与细胞生物学系研究实验室，加州大学伯克利分校生命科学附加415号94720
黛安·马西斯
*盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire）et Cellulaire，国家科学研究中心/研究所国立圣母医院/大学路易斯·巴斯德，地址：1 rue Laurent Fries，67404 Illkirch，C.U.de Strasbourg，法国；和‡霍华德·休斯癌症医学研究所分子与细胞生物学系研究实验室，加州大学伯克利分校生命科学附加415号94720
*盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire）et Cellulaire，国家科学研究中心/研究所国立圣母医院/大学路易斯·巴斯德，地址：1 rue Laurent Fries，67404 Illkirch，C.U.de Strasbourg，法国；和‡霍华德·休斯癌症医学研究所分子与细胞生物学系研究实验室，加州大学伯克利分校生命科学附加415号94720
†现住址：法国病毒研究所免疫生物学，Versbacherstrasse 7，97078 Würzburg，Germany。
§现住址：哈佛大学乔斯林糖尿病中心马萨诸塞州波士顿Joslin Place One医学院，邮编02215。
James P.Allison撰稿
摘要
T细胞共刺激受体CTLA-4的参与可以有效地下调免疫反应。例如，在T细胞受体中自身免疫性糖尿病转基因小鼠模型，CTLA-4相互作用保持胰岛反应性T细胞检查结果证实单克隆抗体阻断CTLA-4会迅速引发动物的糖尿病通常直到几个月后才会屈服。有趣的是，这个只有在疾病早期、胰岛炎已经稳定地根深蒂固。在这里，我们利用了同步且易于操作的传输系统，以确定当必须使用CTLA-4检查糖尿病发病率时胰岛反应性T细胞。我们的结果表明CTLA-4相互作用在胰腺淋巴结中T细胞的初始启动期间不是决定性的。相反，当T细胞在靶器官中二次重新对抗其抗原胰岛。此外，我们利用CTLA-4缺陷小鼠支持我们关于CTLA-4作战受挫的解释而不是增强对糖尿病进展的影响。
关键词：自身免疫、糖尿病、共刺激分子、T细胞激活，T细胞调节
CTLA-4（CD152）是一种免疫反应的重要调节器(1,2). 它是生长中的共刺激受体家族特异性表达于T细胞表面。它及其最接近的同源物CD28与B7–1和B7–2（分别为CD80和CD86）共刺激配体主要显示在抗原呈递细胞上(三). 一些报告有表明CTLA-4与CD28一样，是一种阳性共刺激因子，发送与发送的信号有某种协同作用的信号通过T细胞受体（TCR）促进T细胞刺激(4–6).然而，绝大多数数据都支持相反的作用，即抑制T细胞激活。CTLA-4阻断增强T细胞响应在体外(7–16)和体内(16–23),增强抗肿瘤免疫力(24–26)，并加重自身免疫疾病(27–29). 此外，携带CTLA-4-空突变的小鼠显示外周大量聚集活化的T细胞淋巴器官和白细胞渗入各种组织(30–32).
目前尚不清楚在免疫应答期间CTLA-4的确切时间必须参与发挥其下调功能。鉴于在原始T细胞表面检测它的困难，及其上调T细胞活化，最初提出CTLA-4将在反应后期采取行动。当然有迹象表明这可能发生(12,28,33–37). 然而，也有一些例子提前行动，以确定回应的基调(9,10,17,29,34–36,38,39).
我们通过利用同步性和最近描述的传输系统的可操作性(40)派生的来自BDC2.5 TCR转基因小鼠自身免疫性糖尿病模型(41). BDC2.5 TCR tg小鼠携带重排的TCR-α和TCR-β基因来自CD4+，Th1-类，I-Ag公司7-限制性，胰岛β细胞特异性，糖尿病原性T细胞克隆(42). 在NOD基因上繁殖时背景，这些动物的T细胞储备偏向于转基因特异性和普遍存在的胰岛炎在2到3周大时突然发病，但糖尿病仅在仅仅几个月后的一小部分人(41,43). 早期疾病在BDC2.5 TCR中，事件发生的时间窗口非常窄tg小鼠(29,41)，并且在初始BDC2.5中它们甚至更同步T细胞转移系统(40). 脾细胞移植后幼年BDC2.5/NOD小鼠淋巴细胞缺乏Cα0/0/NOD动物，有可能区分自身反应性T细胞到达淋巴结（第1/2–1天），它们在胰腺中的特异性激活淋巴结（PLN）（第2-3天）及其对胰腺的侵袭胰岛（第5-8天）。事实证明，该传输系统对于剖析早期疾病过程中的相关因素(40).
我们已经确定CTLA-4是标准BDC2.5 TCR tg模型中的糖尿病进展(29).向BDC2.5/NOD动物注射抗CTLA-4单克隆抗体可促进侵袭性胰岛炎和快速引发糖尿病，但仅当在幼年动物中施用该药物时胰岛浸润明显积聚。这些发现表明CTLA-4在疾病进展的早期阶段参与影响胰岛反应性T细胞的糖尿病性。的目标目前的研究是利用原始BDC2.5 T细胞转移系统可以精确定位CTLA-4的交战时间确定PLN中初始T细胞启动期间或胰岛抗原二次再计数。
材料和方法
老鼠。
携带BDC2.5α和βTCR转基因的小鼠(41)和老鼠TCR Cα基因座存在突变（Cα）o/o（零/零）/NOD；参考文献。44和45)已描述。这些线被反交叉到NOD/Lt背景至少为20代和12代，分别是。CTLA-4型o个/+老鼠(32)进行了将C57BL/6背景回交三次至NOD背景，并将第三代小鼠与获得CTLA-4缺失突变的动物纯合子。所有动物在研究所的常规设施中进行维护Génétique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire公司农业部（农业部67227）和欧洲经济共同体指导方针。
细胞移植。
收集10至12天龄BDC2.5/NOD小鼠的脾细胞，红细胞在0.83%氯化铵中溶解；1–2× 107将细胞静脉注射到成人体内（6–10周龄）Cαo（o）/NOD小鼠总数体积为200μl。在一些实验中，细胞被标记为5,6-羧基荧光素二乙酸丁二酰酯（CFSE；分子探头），如所述(40,46). 简单地说，细胞是调整为107/PBS中的ml，然后用0.5 ml/ml CFSE储备溶液（5DMSO中的mM），并在注射前清洗。如有指示受试者接受了多次治疗，每次200μg注射抗CTLA-4单克隆抗体（克隆UC10–4F10，PharMinen）同种匹配的无关仓鼠控制抗体，或在一些实验，以PBS为对照。对小鼠进行糖尿病随访每天，从转移后7天开始，最多3周，检测尿糖水平与血糖阳性的确认测量(41). 薄片苏木精/伊红染色从Bouin’s溶液中进行石蜡包埋胰腺如所述(47). 对每只动物的多个切片进行评分胰岛炎，每个人至少有40个胰岛。组织分析CTLA-4中的渗透o/o（零/零）/NOD小鼠苏木精-伊红染色石蜡切片。
抗体和流式细胞术。
如前所述进行T细胞分析(29,40). 以下单克隆抗体使用：藻红蛋白结合抗CD4（Caltag，South San加利福尼亚州弗朗西斯科）；别藻蓝蛋白偶联抗CD8（Caltag）；FITC-共轭抗CD69（PharMinen）；生物素偶联抗CD25（法尔敏根）；藻红蛋白结合抗干扰素-γ（PharMinen）；藻红蛋白结合抗IL-4（PharMinen）；FITC-共轭抗CD4（Caltag）；IM7，针对CD44；和Mel-14，具体用于CD62L（参考文献见参考文献。29). 生物素化单抗FITC-偶联链霉亲和素和其他单克隆抗体通过FITC-结合山羊抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）。
用于细胞内染色，来自淋巴结的单细胞悬浮液用50 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐刺激加入500 ng/ml离子霉素，在37°C条件下放置4小时在2%甲醛中固定后细胞内细胞因子染色0.3%皂苷用于细胞渗透，然后染色表面标记物CD4和CD8。
结果
抗CTLA-4在BDC2.5启动期间未发挥作用PLN中的T细胞。
作为第一步，我们确定抗CTLA-4单抗治疗，最初在幼年BDC2.5 TCR中观察到tg小鼠(29)，在最初的BDC2.5 T细胞移植中被重述系统(40). 10至12日龄BDC2.5/NOD小鼠的脾细胞被转移到成人T细胞缺陷Cαo/o（零/零）/曾经或曾经的NOD接受者未经抗CTLA-4治疗，这些细胞的命运和调查了它们引起的影响。如此年轻的BDC2.5/NOD动物被选为T细胞供体，因为没有T细胞的迹象在这个年龄段，PLN中的细胞激活，而胰岛炎则不是直到几天后才能检测到(40). 因此，供体BDC2.5 T细胞还没有接触到他们的抗原，而抗原是特异性的在小岛上。使用抗CTLA-4单克隆抗体治疗时移植后9-12天，受体持续发展为糖尿病；相比之下，对照组患者很少出现疾病（表). 开发了两种类型的接收者胰岛炎，但这两个病例的病变截然不同转移后7天进行检查。抗CTLA-4治疗诱导更具侵袭性的病变，全身炎症和破坏，而不是在大多数对照动物的切片。因此，抗CTLA-4的作用在原始BDC2.5 T细胞转移系统中的治疗似乎与很好地证明了先前对青少年的糖尿病影响BDC 2.5/NOD小鼠。
表1
抗CTLA-4单克隆抗体治疗糖尿病的疗效原始BDC2.5 T细胞转移系统
| 治疗 | d7时的胰岛炎 | 糖尿病 |
|---|
| 控制单克隆抗体 | 温和、无攻击性 | 三/18 |
| α-CTLA-4单克隆抗体 | 具有攻击性 | 7 /8 |
然后我们确定抗CTLA-4单克隆抗体治疗的效果是否为在初始启动阶段，当BDC2.5 T细胞首先接触他们的抗原。在转移系统中，初始抗原这种遭遇很容易被检测为扩散反应受限对PLN，可通过使用CFSE标记的供体细胞进行测量，其循环可通过逐步稀释每个细胞的标签来追踪划分(40,46). 因此，我们测试了抗CTLA-4治疗改变了这种增殖反应的动力学或振幅。作为如图所示。A类中的、和与我们之前的观察保持一致(40)，抗原驱动细胞转移后46小时未检测到分裂，但在转移后开始50小时后进行。并非所有转基因T细胞正如优势72h后仍存在未分裂细胞群。增殖是抗原特异性的，因为它不存在于淋巴中PLN以外的节点（图。B类). 管理转移时抗CTLA-4没有改变细胞增殖转移的BDC2.5 T细胞的行为。根据来自的数据多次实验，既不是分裂动力学，也不是分裂细胞的比例反复改变（例如图。C类).
抗CTLA-4治疗对在PLN中转移BDC2.5 T细胞。CFSE标记的来自将幼年BDC2.5/NOD小鼠转移至成年Cαo/o（零/零）/接受治疗的NOD动物转移前2小时抗CTLA-4单克隆抗体或PBS。PLN和腹股沟在指定的时间从受者身上切除淋巴结转移后，用抗CD4和Vβ4单克隆抗体对细胞进行染色（转基因编码的TCRβ链）。所示为CFSE直方图门控CD4染色+Vβ4+细胞。这个CFSE染色强度降低表明细胞增殖已经发生，并且显示了分裂细胞的比例。
抗CTLA-4 mAb处理对细胞活化的影响也为通过分析激活标记物3天的表达进行研究转让后。在未经治疗的患者的PLN中，上调早期激活标记物CD69和CD25与CD62L的下调观察到（图。A类). 在控制来自同一受体的腹股沟淋巴结，这些调节的激活标记明显不那么明显，与事实上，在腹股沟淋巴结（图。). 再次，我们无法检测到任何注射抗CTLA-4的小鼠与对照小鼠之间存在显著差异。最后，根据细胞内染色实验的结果，PLN T细胞产生的IFN-γ水平在这两种类型的接收者（图。B类).
BDC2.5 T细胞转入抗CTLA-4-处理后的活化和控制收件人。(A类)幼年脾细胞合并BDC2.5/NOD小鼠，并对等分样品进行CD4染色，CD8、早期（CD25和CD69）和晚期（CD62L）激活标记物。将细胞移植到成人体内Cαo/o（零/零）/接受治疗的NOD小鼠抗CTLA-4，如图图例所示。第3天，单细胞对PLN和腹股沟淋巴结的悬浮液进行CD4染色，CD8和各种激活标记物；直方图选通CD4细胞+显示单元格。(B类)与中的相同A类除了细胞内IFN-γ染色代替活化标记物的染色进行。
根据这些不同的标准，抗CTLA-4单克隆抗体治疗不能可检测地影响PLN中BDC T细胞的初始启动。
BDC2.5 T细胞再次与抗原反应时，抗CTLA-4发挥作用靶器官，胰腺。
尽管抗CTLA-4单抗治疗似乎没有影响BDC2.5 T细胞在启动阶段，归巢仍然有可能胰岛的启动细胞数量发生改变。我们对此进行了分析通过研究接受治疗的受者胰腺切片得出的参数抗CTLA-4或对照单克隆抗体（表). 在这两种类型的受体，胰岛炎在5天后仍然罕见根据我们的以前的数据(40). 然而，病变的表型不同在这两种情况下。在经抗CTLA-4处理但未经对照单克隆抗体处理的小鼠中，小鼠，胰岛炎立即侵袭，也蔓延到周围外分泌组织即使只有一个或两个胰岛受检部位受到影响。这个侵略性的方面非常这让人想起用抗CTLA-4治疗的年轻BDC2.5小鼠的胰岛，如所述(29). 到第7天，胰岛炎进展迅速；在这里时间点，对照组小鼠表现出大“无害”标准BDC2.5/NOD小鼠的典型浸润，而抗CTLA-4治疗动物的渗透持续其侵略性（表).
表2
给药动物胰岛发育的比较α-CTLA-4与对照单克隆抗体
| 治疗 | 评估日间胰岛炎 | 小鼠数量 | %个别小鼠的胰岛炎 |
|---|
| α-CTLA-4 | 5 | 6 | 9, 0, 12*, 3,9*, 62* |
| 控制 | 5 | 7 | 0, 5, 9, 0, 0,7, 2 |
| α-CTLA-4 | 7 | 2 | 94*, 79* |
| 控制 | 7 | 2 | 50, 5 |
迄今为止的结果表明，抗CTLA-4治疗确实在启动的BDC2.5 T细胞达到目标之前不会产生作用器官。该假设预测抗CTLA-4仍将是如果延迟给药，则有效。因此，我们注射小鼠在不同条件下接受含抗CTLA-4的原始BDC2.5 T细胞转移后的时间和监测糖尿病的发展（图。). 显然，单克隆抗体不需要在促进糖尿病反应的第一天出现。从第5天开始的治疗有效且迅速地引发疾病作为早期管理。然而，当单克隆抗体治疗被延迟时直到第9天，患糖尿病的小鼠比例减少（6只中的3只）疾病开始的时间较晚（17至20天）。
抗CTLA-4单克隆抗体治疗后糖尿病的发展不同的时间。Cαo/o（零/零）/BDC2.5的NOD接收人用抗CTLA-4单克隆抗体（2×200μg）或对照单克隆抗体或PBS在转移后的不同日期开始，如表所示在左边。箭头表示注射抗CTLA-4的次数；固体黑色阴影显示糖尿病的发病率；和上的数字右边代表最终的糖尿病频率。难以解释的是，在一些实验中，所有小鼠都患有糖尿病，无论它们是否接受了是否抗CTLA-4；这些实验的数据被排除在结果如上所示。
这个结果需要考虑到非常可重复的原始BDC2.5 T细胞反应的动力学传输系统(40)：第1/2-1天，出现在PLN中；天2–3，激活PLN；第5-8天，出现胰岛炎的第一个症状。因此，抗CTLA-4单抗发挥其作用的关键时间窗口糖尿病效应似乎发生在启动阶段之后，而不是直到活化的BDC2.5 T细胞迁移到胰腺和在胰岛中重新对抗它们的抗原。
CTLA-4-缺乏BDC2.5小鼠的结果支持了这一解释该反CTLA-4通过阻止CTLA-4交战而运行。
对在里面活泼地单克隆抗体阻断实验，其中某些可能是特别适用于抗CTLA-4的研究。首先，它不是始终清楚，单克隆抗体只是阻断功能，而不是，相反，通过靶分子或更糟的途径发出信号，正在诱导表达标记的细胞的裂解。其次，总是有首先，单克隆抗体与其他分子交叉反应的可能性当目标是持续扩张的多基因成员时系列，如CTLA-4(48). 因此，我们认为确认我们对CTLA-4基因已被克隆的动物的主要研究结果被灭活，而不是其产品被假定堵塞。CTLA-4型o个/+C57/BL6背景下的小鼠与BDC2.5/NOD小鼠杂交三代交叉获得CTLA-4o/o（零/零）BDC2.5/NOD小鼠；在这个过程中，选择了动物H-2的纯合性第7组在MHC。CTLA-4缺乏小鼠通常在3周龄左右死亡，因为大量淋巴细胞增殖和多器官浸润(30–32). 这也是NOD基因背景在无BDC2.5转基因：心脏、肝脏和胰腺3周龄BDC2.5-阴性CTLA-4不适用老鼠显示了广泛的渗透（图。)这些动物都在3-4岁时死亡周龄。相反，携带BDC2.5转基因的室友幸免于难。6周龄小鼠的器官经过调查，除了在胰腺受到严重侵犯（图。). 然而，我们确实注意到，早期（CD69和CD25）和晚期（CD44）激活标记BDC2.5阳性淋巴细胞上调CTLA-4型o/o（零/零）老鼠，也有一点脾脏肿大[淋巴细胞数量约为1.5倍在表达CTLA-4的室友中发现（数据未显示）]。
存在或不存在CTLA-4缺陷小鼠的器官浸润BDC2.5 TCR转基因。3周龄婴儿的器官被切除CTLA-4型o/o（零/零）/NOD小鼠和6周龄BDC2.5阳性CTLA-4型o/o（零/零）/NOD小鼠，石蜡切片苏木精/伊红染色。只有心脏和胰腺切片如图所示。这些图片代表了每只老鼠中的三只类型。
反映出重度胰岛炎，所有BDC2.5阳性CTLA-4型o/o（零/零）老鼠在很小的时候就患上了糖尿病，年龄在5至7周之间（图。A类). 相反，他们BDC2.5阳性CTLA-4+/o个室友迟到了相对罕见的糖尿病NOD背景(43).
CTLA-4缺陷的BDC2.5 T细胞促进糖尿病。(A类)CTLA-4型o（o）/+老鼠被杂交三次与BDC2.5/NOD小鼠杂交获得BDC2.5阳性CTLA-4型o/o（零/零）/NOD动物（选择用于H-2g7纯合性）。对这些后代进行糖尿病随访。(B）BDC2.5阳性脾细胞CTLA-4型o/o（零/零）/NOD小鼠和CTLA-4+控制同窝卵被转移到Cαo/o（零/零）/NOD（诺德）收件人。单个受者的胰腺在第2天被切除或转移后5个，石蜡切片染色组织学检查苏木精/伊红。
因此，BDC2.5 TCR转基因能够“治愈”CTLA-4型o/o（零/零）全身组织表型渗透，以及其他几个TCR转基因(12,35,36,49,50),但CTLA-4的缺失导致了攻击性自身免疫和快速所有小鼠的糖尿病发展本质上与幼年BDC2.5/NOD抗CTLA-4治疗后可见动物(29)，尽管速度可能稍慢。
然后，我们使用CTLA-4-缺陷BDC2.5小鼠的脾细胞转移实验。转入后3周内Cα0/0/NOD动物，大多数BDC2.5阳性CTLA-4受体0/0细胞有患有糖尿病，而同龄人BDC2.5阳性的受体CTLA-4型0/+细胞几乎没有（数据没有如图所示）。两个捐赠群体之间的一个区别是前者处于激活状态（见上文），而后者基本上都是天真的。因此，我们检查了立即进入小岛。胰腺被切除并处理2和5移植到受体体内后数天，从BDC2.5正极CTLA-4o/o（零/零）小鼠或对照室友。在2天时，没有一个接受者表现出任何胰岛炎（图。B左侧); 第5天，胰岛炎开始出现在两种类型的接受者中，但更多BDC2.5阳性转移者具有攻击性CTLA-4型o/o（零/零）T细胞（图。B类赖特).
因此，功能性CTLA-4基因的缺失引发了相同的表型作为抗CTLA-4单克隆抗体治疗，在发病时均在幼年BDC2.5小鼠中自身免疫和原始BDC2.5 T细胞转移实验，支持抗CTLA-4治疗的概念体内具有阻断功能，CTLA-4是有效靶点。
讨论
通过使用自身免疫性糖尿病的标准BDC2.5 TCR tg模型，我们之前确定CTLA-4在确定自身免疫攻击的结果(29). 我们现在有了利用强大的BDC2.5衍生传输系统证明CTLA-4在最初幼稚的自我激活T细胞时不发挥作用在淋巴结启动时接触抗原，但当活化的T细胞迁移到靶组织并遇到抗原第二次。提供了三条证据来支持这一结论：(我)抗CTLA-4单克隆抗体治疗没有对BDC2.5 T细胞激活早期事件的明显影响PLN；(ii（ii）)直到T细胞转移后5天，BDC2.5细胞首次出现的时间侵入胰岛；和(三)CTLA-4缺陷型BDC2.5 T细胞在进入时也表现出改变了的、明显更具攻击性的行为转移后5天进入胰岛。
这一结论与关于CTLA-4型。首先，CTLA-4在细胞中没有大量出现表面，直到原代T细胞激活后2-3天，暗示在那之前它可能没有主要功能(7). 其次CTLA-4-缺失突变对抗原特异性初级反应的次要反应CD8（CD8）+T细胞(12). 鉴于对初级和次级抗原特异性CD4+T细胞反应已被记录在案，后者通常更多深刻的(35,36). 第三，Shrikant等。(37)证明CTLA-4参与可以阻止对转染的肿瘤抗原对初始响应。第四，Issazadeh等。(39)描述了获得性胸腺髓鞘碱性蛋白抗原耐受系统这取决于三天内CTLA-4的参与情况抗原启动后。最后，我们的结论与CTLA-4缺陷小鼠的基本表型，主要特征是组织浸润而非孤立淋巴增生液化石油气老鼠(30–32).
为什么延迟CTLA-4功能？一种可能性是延迟仅仅反映了协同刺激受体的表达模式T细胞和/或共刺激配体抗原呈递细胞。关于前者，可能是CTLA-4不会以足够高的水平出现在细胞表面，直到T细胞已经到达目标组织。关于后者，可能是B7-1和B7-2的数量或形式不同于靶组织和引流淋巴结。然而，到目前为止，我们还没有注意到树突上B7分子表达的任何差异幼年NOD小鼠胰岛和PLN中的细胞（未显示数据）。第二种可能性是更多的抗原胰腺中的CTLA-4/B7相互作用只会在较高的抗原浓度下起作用。这与抗原呈递细胞的能力是一致的从前一个位置分离出来，但不是从后一个位置，以刺激BDC2.5 T中的单元格在体外化验，化验(51). 第三，有可能CTLA-4下游的相关负信号通路只有在T细胞激活后，才能正确连接接合该场景也可能解释有关CTLA-4的抑制与激活作用(52). 如果结果是这样诚然，本文件和其他体内情况需要协调一些早期的生化效应在体外实验，包括TCR下游的影响激活信号通路与几种转录因子TCR/CD28信号早期激活(9,10,13,53,54). A类第四种可能性，来自最近对小鼠模型的研究实验性变态反应性脑脊髓炎和糖尿病(55)，是吗CTLA-4实际上并不在BDC2.5效应细胞中表达，但而不是调节细胞，可能直到入侵才遇到小岛。
我们早期的结果(29)证明抗CTLA-4治疗没有胰岛素注射后的效果已经根深蒂固BDC2.5/NOD小鼠。综上所述，这些和目前的研究结果表明CTLA-4控制激活的当淋巴细胞第一次侵入胰岛时，但仅限于时间窗口受限。一旦建立在缺乏CTLA-4的情况下，胰岛炎是稳定的，可能取决于共刺激受体家族的其他成员，如ICOS(48),用于维护。
携带CTLA-4敲除突变的BDC2.5 TCR-tg小鼠患有疾病与抗CTLA-4处理的动物非常相似的特征。然而这两种类型的实验都有潜在的警告（前者的连锁位点的复杂性，讨论的复杂性对于后者，结果的趋同应该会缓和关于阻碍与增强效果的疑虑挥之不去UC10–4F10单克隆抗体。然而，CTLA-4缺陷的BDC2.5 TCR tg小鼠确实如此与单克隆抗体治疗的小鼠相比，患糖尿病的时间稍晚（5-7周vs.21周日龄）。一种解释可能是，在CTLA-4缺陷小鼠中，从一开始就没有负面信号，提示其他负面信号协同刺激分子部分补偿自适应过程中的CTLA-4。这不足以防止早发糖尿病的表型，但可能导致延迟。打开另一方面，如果CTLA-4被单克隆抗体治疗突然阻断不会有机会进行这种调整。
总之，从我们不同的分析中得出的结论表明CTLA-4在控制自侵中的特殊作用。它不会抑制淋巴器官的初始反应，但可以控制组织中抗原的二次识别结果，一致在组织特异性的外周耐受中起重要作用抗原。这将进一步揭示介导负信号的抗原呈递细胞和配体卷入的。
致谢
我们感谢C.Waltzinger对流式细胞术的帮助，T.Ding做胰腺切片，F.Fischer和V.Louerat维护小鼠，W.Magnant在糖尿病测试中寻求帮助，以及J.Hergueux、P.Gerber和C.Ebel提供技术援助。这个这项工作得到了欧盟向C.B.和D.M.提供的赠款的支持，以及国家圣母学院的研究基金国立医学研究中心科学与中心医院大学区域。F.L.获得了德国联邦科学院（lu634/1–1）和欧盟。
缩写
| CFSE公司 | 5,6-碳荧光蛋白二乙酸酯琥珀酰酯 |
| 印尼国家电力公司 | 胰腺淋巴结 |
| TCR公司 | T细胞受体 |
| 热重（tg） | 转基因 |
脚注
印刷前在线发布的文章：程序。国家。阿卡德。科学。美国,10.1073/pnas.200348397。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.200348397
工具书类
1Oosterwegel M A、Greenwald R J、Mandelbrot D A、Lorsbach R B、Sharpe A H。当前Opin免疫。1999;11:294–300.[公共医学][谷歌学者] 2钱伯斯·C·A、艾利森·J·P。当前操作细胞生物学。1999;11:203–210.[公共医学][谷歌学者] 三。McAdam A J、Schweitzer A N、Sharpe A H。免疫学评论。1998;165:231–247.[公共医学][谷歌学者] 4Linsley P S、Greene J L、Tan P、Bradshaw J、Ledbetter J A、Anasetti C、Damle N K。《实验医学杂志》。1992;176:1595–1604. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Wu Y，Guo Y，Huang A，Zheng P，Liu Y。《实验医学杂志》。1997;185:1327–1335. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Walunas T L、Lenschow D J、Bakker C Y、Linsley P S、Freeman G J、Green J M、Thompson C B、Bluestone J A。免疫。1994;1:405–413.[公共医学][谷歌学者] 9Krummel M F，Allison J P。《实验医学杂志》。1996;183:2533–2540. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Walunas T L、Bakker C Y、Bluestone J A。《实验医学杂志》。1996;183:2541–2550. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Alegre M-L、Shiels H、Thompson C B、Gajewski T F。免疫学杂志。1998;161:3347–3356.[公共医学][谷歌学者] 12Chambers C A、Sullivan T J、Truong T、Allison J P。欧洲免疫学杂志。1998;28:3137–3143.[公共医学][谷歌学者] 13Brunner M C、Chambers C A、Chan F K-M、Hanke J、Winoto A、Allison J P。免疫学杂志。1999;162:5813–5820.[公共医学][谷歌学者] 15Fallarino F、Fields P E、Gajewski T F。《实验医学杂志》。1998;188:205–210. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16McCoy K D、Hermans I F、Fraser J H、Le Gros G、Ronchese F。《实验医学杂志》。1999;189:1157–1162. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Kearney E R、Walunas T L、Karr R W、Morton P A、Loh D Y、Bluestone J A、Jenkins M K。免疫学杂志。1995;155:1032–1036.[公共医学][谷歌学者] 18Krummel M F、Sullivan T J、Allison J P。国际免疫学。1996;8:519–523.[公共医学][谷歌学者] 19Blazar B R、Taylor P A、Panoskaltsis-Mortari A、Sharpe A H、Vallera D A。免疫学杂志。1999;162:6368–6377.[公共医学][谷歌学者] 20.Lin H L、Rathmell J C、Gray G S、Thompson C G、Leiden J M、Alegre M L。《实验医学杂志》。1998;188:199–204. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21法官TA、Wu Z、Zheng X-G、Sharpe A H、Sayegh M H、Turka L A。免疫学杂志。1999;162:1947–1951.[公共医学][谷歌学者] 22McCoy K、Camberis M、Le Gros G。《实验医学杂志》。1997;186:183–187. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Walunas T L，Bluestone J A。免疫学杂志。1998;160:3855–3860.[公共医学][谷歌学者] 24Leach D R、Krummel M F、Allison J P。科学。1996;271:1734–1736.[公共医学][谷歌学者] 25Kwon E D、Hurwitz A A、Foster B A、Madias C、Feldhaus A L、Greenberg N M、Burg M B、Allison J P。美国国家科学院程序。1997;94:8099–8103. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Hurwitz A A、Yu T F Y、Leach D R、Allison J P。美国国家科学院程序。1998;95:10067–10071. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Perrin P J、Maldonado J H、Davis T A、June C H、Rack M K。免疫学杂志。1996;157:1333–1336.[公共医学][谷歌学者] 28Karandikar N J、Vanderlugt C L、Walunas T L、Miller S D、Bluestone J A。《实验医学杂志》。1996;184:783–788. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Lühder F、Höglund P、Allison J P、Benoist C、Mathis D。《实验医学杂志》。1998;187:427–432. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Waterhouse P、Penninger J M、Timms E、Wakeham A、Shahinian A、Lee K P、Thompson C B、Griesser H、Mak T W。科学。1995;270:985–989.[公共医学][谷歌学者] 31Tivol E A、Borriello F、Schweitzer A N、Lynch W P、Bluestone J A、Sharpe A H。免疫。1995;三:541–547.[公共医学][谷歌学者] 32钱伯斯·C·A、卡多·D、特朗·T、艾莉森·J·P。美国国家科学院程序。1997;94:9296–9301. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33.Metz D P、Farber D L、Taylor T、Bottomly K。免疫学杂志。1998;161:5855–5861.[公共医学][谷歌学者] 34Scheipers P，Reiser H。美国国家科学院程序。1998;95:10083–10088. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Oosterwegel M A、Mandelbrot D A、Boyd S D、Lorsbach R B、Jarrett D Y、Abbas A K、Sharpe A H。免疫学杂志。1999;163:2634–2639.[公共医学][谷歌学者] 36Chambers C A、Kuhns M S、Allison J P。美国国家科学院程序。1999;96:8603–8608. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Shrikant P、Khoruts A、Mescher M F。免疫。1999;11:483–493.[公共医学][谷歌学者] 38Perez V L、Parijs L V、Biuckians A、Zheng X X、Strom T B、Abbas A K。免疫。1997;6:411–417.[公共医学][谷歌学者] 39Issazadeh S、Zhang M、Sayegh M H、Khoury S J。免疫学杂志。1999;162:761–765.[公共医学][谷歌学者] 40Höglund P、Mintern J、Heath W、Benoist C、Mathis D。《实验医学杂志》。1999;189:331–339. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Katz J D、Wang B、Haskins K、Benoist C、Mathis D。单元格。1993;74:1089–1100.[公共医学][谷歌学者] 42Haskins K、McDuffie M。科学。1990;249:1433–1436.[公共医学][谷歌学者] 43Gonzalez A、Katz J D、Mattei M G、Kikutani H、Benoist C、Mathis D。免疫。1997;7:873–883.[公共医学][谷歌学者] 44Philpott K L、Viney J L、Kay G、Rastan S、Gardiner E M、Chae S、Hayday A C、Owen M J。科学。1992;256:1448–1452.[公共医学][谷歌学者] 45Katz J D、Benoist C、Mathis D。科学。1995;268:1185–1188.[公共医学][谷歌学者] 46里昂A B区C R区。免疫学方法杂志。1994;171:131–137.[公共医学][谷歌学者] 47Böhme J、Schuhbaur B、Kanagawa O、Benoist C、Mathis D。科学。1990;249:293–295.[公共医学][谷歌学者] 48Hutloff A、Dittrich A M、Beier K C、Eljaschweitsch B、Kraft R、Anagostopoulos I、Kroczek R A。自然（伦敦）1999;397:263–266.[公共医学][谷歌学者] 49Waterhouse P、Backmann M F、Penninger J M、Ohashi P S、Mak T W。欧洲免疫学杂志。1997;27:1887–1892.[公共医学][谷歌学者] 50Bachmann M F、Waterhouse P、Speiser D E、McKall-Faienza K、Mak T W、Ohashi P S。免疫学杂志。1998;160:95–100.[公共医学][谷歌学者] 51绿色E A、埃农E E、Flavell R A。免疫。1998;9:733–743.[公共医学][谷歌学者] 53.Lee K-M、Chuang E、Griffin M、Khattri R、Hong D K、Zhang W、Straus D、Samelson L E、Thompson C B、Bluestone J A。科学。1998;282:2263–2266.[公共医学][谷歌学者] 54Olsson C、Riebeck K、Dohlsten M、Michaelsson E。生物化学杂志。1999;274:14400–14405.[公共医学][谷歌学者] 55所罗门·B、伦肖·D·J、李·L、阿舒里安·N、辛格·B、夏普·A、蓝石·J·A。免疫。2000;12:431–440.[公共医学][谷歌学者] 
