程序化细胞死亡是一种严格调控的细胞过程对后生动物的发育和体内平衡(1,2). 程序性细胞死亡的不当调节导致多种疾病，包括癌症和退化失调(三). 细胞程序性死亡的遗传分析秀丽隐杆线虫已确定四个其活性对适当激活和程序性细胞死亡的执行(4). 其中三个促进细胞生长死亡(第3级，第4级、和egl-1)和第四个，塞得-9，防止细胞死亡(5–7). 重要的是，这些基因编码具有重要序列和与哺乳动物细胞死亡调节器的功能同源性。EGL-1是与BH3-类似，只有促凋亡蛋白(7,8)，CED-3是一个天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员(9,10)，CED-4类似于蛋白酶激活因子（Apaf-1）(11,12)，而CED-9是抗凋亡蛋白家族首次由哺乳动物Bcl-2蛋白(8,13,14). 一些秀丽线虫蛋白质及其哺乳动物同源物已被证明是功能上可互换(4)表明细胞死亡该途径在进化上是保守的。
Bcl-2首次被鉴定为凋亡抑制剂其抗淋巴细胞死亡的能力(14–16). 随后，一个与Bcl-2相关的蛋白质家族四个保守BH结构域中至少有一个被鉴定出来(8,14),其中一些（例如Bak和EGL-1）是促凋亡的，而其他（如Bcl-2和CED-9）是抗凋亡的。几个生化特性与Bcl-2家族蛋白有关，包括定位于线粒体外膜的能力以及内质网的细胞核和膜，形成异二聚体与其他家族成员形成离子传导通道合成膜（参考文献。17). 然而，精确的与每个生化特性相关的功能仍然很差了解，尤其是异二聚体在Bcl-2样蛋白和带有两亲性螺旋BH3的蛋白领域(17). EGL-1和CED-9的生化功能研究BH3-only蛋白质和Bcl-2-like蛋白质的无脊椎动物原型，可能会为这个基本问题提供重要的见解。
在秀丽线虫，CED-9定位于线粒体能够以多种方式与EGL-1和CED-4相互作用在里面体外蛋白质相互作用分析（18，参考文献。19).CED-4与CED-9在活细胞线粒体共定位，但转位到细胞核膜导致死亡EGL-1过度表达，提示CED-9和CED-4可能在生理上线粒体结合体内EGL-1可能导致CED-4/CED-9复合物释放CED-4导致细胞死亡(18). 这些观察结果导致蛋白质相互作用级联模型，其中EGL-1与CED-9的结合诱导CED-4从线粒体定位的CED-4/CED-9复合物及其后续CED-4向核膜的移位。有趣的是，CED-4向核膜的移位被一种不寻常的获得功能突变(1950年)在中塞得-9能有效抑制几乎所有程序性细胞死亡的基因秀丽线虫是甘氨酸169取代的结果CED-9的BH1结构域中含有谷氨酸(18,20). 这个发现表明CED-9（G169E）要么无法与EGL-1相互作用，要么无法释放CED-4。然而，没有检测到差异EGL-1与CED-9或CED-9（G169E）之间的相互作用在体外蛋白质相互作用测定(18). 这一结果提高了关于EGL-1是否与第9版体内或间接通过中间蛋白质发布CED-4和1950年在里面阻断CED-4从线粒体到细胞核的移位膜。
在本报告中，我们进行了生化分析，以证明这个塞得-9（1950年）突变阻断CED-4的释放CED-4/CED-9复合物通过破坏EGL-1与CED-9的结合，对第9版（1950年1月）突变。此外，使用同源建模，我们构建了EGL-1/CED-9复合物的模型结构用它设计并产生第二位点补偿性突变抑制CED-9（G169E）活性的EGL-1在里面体外和体内提供了令人信服的证据EGL-1和CED-9在秀丽线虫而且这种相互作用对于激活线虫的细胞死亡至关重要。
材料和方法
质粒构建。
我们使用分子生物学的标准方法生成各种EGL-1、CED-9和CED-4结构体及其突变衍生物(21).
蛋白质纯化。
谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-CED-4在大肠杆菌XA-90细胞，谷胱甘肽纯化制造商（Amersham）指示的亲和层析法玛西亚）。His-tagged CED-9蛋白在E.公司。大肠杆菌BL21（DE3）pLysS细胞及Ni-NTA亲和纯化按照供应商（Qiagen）的指示进行色谱分析。GST-CED-4和伊斯6CED-9（68–251）或伊斯6CED-9（68–251；G169E）在BL21（DE3）pLysS细胞并通过谷胱甘肽或Ni-NTA亲和层析。EGL-1蛋白表达于BL21（DE3）pLysS，并使用UNC-86的纯化(22). 用此方法制备的EGL-1蛋白该程序的纯度约为90%。
电泳迁移率测定。
纯化的CED-9与纯化的EGL-1在CED-3缓冲液中孵育(23)室内含有2.5 mM DTT/0.01%Nonide P-40/10%甘油温度（除非另有说明）30分钟，分辨率为6%含有0.01%Nonide P-40的天然聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）4°C，然后转移到硝化纤维素膜上，用于Western印迹和ECL检测（Amersham Pharmacia）。添加Nonide P-40指示的结合反应。
CED-4释放分析。
GST-CED-4/他的6CED-9（68–251）复合物（野生型或G169E）被纯化并固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖上将500 ng EGL-1蛋白添加到固定化蛋白中0.25%Nonide P-40存在下的络合物。上清液在室温下30分钟后收集，并通过天然PAGE进行解析。Western blot检测释放的EGL-1/CED-9复合物使用anti-His进行分析6抗体。或者，从谷胱甘肽-脑葡萄糖中洗脱蛋白质复合物20 mM还原型谷胱甘肽，固定在Ni-NTA琼脂糖上，以及随后与500 ng EGL-1蛋白孵育，如上所述。上清液通过SDS-PAGE进行分析，GST-CD-4的释放使用抗GST抗体进行Western blotting检测。
结构建模。
CED-9/EGL-1 BH3结构域结构的同源建模使用SWISS-MODEL软件包执行复杂操作(24)使用Bcl-x的已发布结构L（左）/烘焙BH3域复合体作为模板(25). 建模的CED-9/EGL-1结构通过堆积密度分析和残渣分析进一步评估使用SWISS-MODEL并被判断为合理。
结果和讨论
CED-9中的G169E替代物损害EGL-1与CED-9，但不影响CED-9与CED-4的关联。
因为1950年CED-9突变使BH1结构域中的保守残基（Gly-169）参与调节蛋白质相互作用(26)，我们调查了这种突变是否影响EGL-1与CED-9的结合或CED-4/CED-9复合物的形成。使用删除分析和有限的蛋白酶消化分析，我们确定了CED-9（氨基酸68至251）足以介导CED-9与EGL-1和CED-4的相互作用（图。A类和A类和数据未显示）。这个核心结构域也足以赋予功能获得表型与CED-9（G169E）相关（参考。27和数据未显示）。这个因此，抗蛋白酶核心（）用于在里面体外蛋白质相互作用分析如下所述。使用电泳迁移分析，可分解蛋白质或通过天然PAGE，我们发现G169E取代在CED-9中，EGL-1对CED-9的结合亲和力降低约无非离子洗涤剂时为4倍（图1B类). 在非离子洗涤剂（0.1%或更多Nonide P-40）的存在EGL-1对CED-9（68–251；G169E）的亲和力进一步降低，而EGL-1与CED-9（68–251）的结合不受影响（图。C类). 这些结果表明G169E突变损伤EGL-1与CED-9的结合。非离子洗涤剂的观察破坏EGL-1与CED-9（68–251；G169E）的结合，但不会CED-9（68–251）可能对EGL-1和CED-9的相互作用体内EGL-1和CED-9可能定位于或插入膜结合细胞器，如线粒体(18)以类似于哺乳动物的方式副本，投标书和Bcl-xL（左），两者都是包含与膜相似的结构图案细菌毒素的易位域，如白喉毒素(28–32).
EGL-1和CED-9蛋白之间相互作用的特征。(A类)CED-9（68–251）足以结合EGL-1。已净化伊斯10CED-9（1-251）或His6CED-9（68–251）（1.5μg）与指示量的EGL-1和进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行考马斯蓝染色。(B类)CED-9中的G169E取代削弱了结合EGL-1至CED-9。净化了他的6CED-9（68–251）或伊斯6CED-9（68–251；G169E）（每个500 ng）与增加纯化EGL-1的浓度，然后使用抗-His的天然PAGE和蛋白质印迹分析6抗体。定量结合和未结合CED-9的数量使用ImageQuant软件（分子动力学）。CED-9的百分比与EGL-1复合显示为EGL-1量的函数用于结合反应。(C类)形成CED-9（G169E）/EGL-1复合物而不是CED-9/EGL-1复合物是对非离子洗涤剂Nonide P-40的浓度敏感。按所述进行结合反应(B类)使用500 ng CED-9和EGL-1蛋白Nonide P-40的指示量。(D类)互动在CED-9和突变EGL-1蛋白之间。野生型或突变型EGL-1蛋白质（每个250 ng）与500 ng的指示蛋白孵育存在或不存在0.25%Nonide P-40的CED-9蛋白，以及按照所述进行分析(B类).
CED-9与CED-4和EGL-1相互作用诱导CED-4释放来自CED-4/CED-9复合物。(A类)伊斯6CED-9（68–251；G169E）结合GST-CED-4以及伊斯6CED-9（68–251）。纯化的CED-9蛋白（2.5μg）用等量的固定化GST-CED-4或GST-Sxl培养谷胱甘肽-脑葡萄糖珠。蛋白质复合物清洗三次使用CED-3缓冲器的次数(23)含有0.01%的Triton X-100和进行SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色。这个GST-CED-4拉下的CED-9蛋白用星号表示（2-4车道）。(B类)CED-4与CED-9蛋白铜化比例为1:1。GST-CED-4和他的6CED-9（68–251）或伊斯6CED-9（68–251；G169E）单独表达或共存于大肠杆菌并使用亲和性进行纯化色谱法。(C类)EGL-1从CED-4/CED-9复合物。五毫微克野生型或突变型将EGL-1添加到约1μg纯化的GST-CED-4/他的6CED-9（68–251）或GST-CED-4/他的6固定化CED-9（68–251；G169E）复合物在Ni-NTA珠上，将所得上清液使用抗GST抗体进行SDS-PAGE和Western blot分析以评估GST-CED-4的释放量。作为阳性对照，1M NaCl和使用1%Nonide P-40将GST-CED-4与GST-CED-4/CED-9复合物。(D类)EGL-1取代CED-4来自CED-4/CED-9复合物。五毫微克野生型或将突变EGL-1添加到约1μg纯化的GST-CED-4/他的6CED-9（68–251）或GST-CED-4/他的6固定化CED-9（68–251；G169E）复合物在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，产生的上清液是使用天然PAGE和Western blot分析反他的6抗体来显示释放EGL-1/CED-9复合物。在通道1和8中，净化CED-9（250ng）作为游离CED-9物种的对照。EGL-1/CED-9含有EGL-1（D63R）、EGL-1比野生型EGL-1复合物慢，因为带负电的天冬氨酸残余物。
我们发现CED-9中的G169E替代物似乎没有影响CED-4与CED-9的结合基于两个不同的实验。首先，在GST-融合蛋白下拉实验中，GST-CED-4结合具有相似亲和力的CED-9（68–251）和CED-9（68–251；G169E）（图。A类，车道3和4）。类似结果如下当不同浓度的CED-9蛋白（野生型或G169E）与GST-CED-4孵育或当不同的CED-4融合时蛋白质（CED-4-FLAG）用于抗FLAG的下拉实验亲和层析（数据未显示）。第二，当我们共存时GST-CED-4与CED-9（68–251）或CED-9发现CED-9（68–251）和CED-9GST-CED-4的比例约为1:1，进一步表明G169E替代不影响CED-4与CED-9的结合（图。B类，车道4和5）。
EGL-1诱导CED-9/CED-4复合物释放CED-4，但不诱导来自CED-9（G169E）/CED-4复合物。
接下来，我们测试了EGL-1与CED-9（G169E）的结合是否减少影响CED-4/CED-9（G169E）复合物中CED-4的释放。我们使用两种不同的分析检查了这一过程。在第一次化验中，我们监测了EGL-1诱导的GST-CED-4从GST-CED-4/他的6CED-9（68–251）或GST-CED-4/他的6CED-9（68–251；G169E）复合物固定在Ni-NTA珠上，该珠结合了CED-9蛋白。我们发现GST-CED-4从GST-CED-4/他的6CED-9（68–251）复合物，但不是来自GST-CED-4/他的6CED-9（68–251；G169E）通过添加EGL-1（图。C类，车道2和8）。在在第二次检测中，我们分析了CED-9从GST-CED-4/CED-9复合物固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，结合GST-CED-4和EGL-1/CED-9复合物的形成采用电泳迁移率测定法。如图所示。D类（车道3和10），增加EGL-1后，伊斯6CED-9（68–251）从GST-CED-4/他的6CED-9（68–251）复合物和新的EGL-1/他的6形成CED-9（68–281）配合物，表明CED-4从CED-4/CED-9复合物中的位移EGL-1。相反，他的释放6CED-9（68–251；G169E）来自GST-CED-4/His6CED-9（68–251；G169E）复合物无法检测到。综上所述，这些结果表明CED-9中的G169E取代削弱了EGL-1与CED-9的结合以及EGL-1从CED-4/CED-9复合物中释放CED-4的能力，导致CED-9（G169E）在秀丽线虫这一发现提供了一个机械的解释对于有趣的观察1950年突变阻断CED-4从线粒体到细胞核的移位EGL-1表达诱导的细胞膜(18). 此外，我们的能力重建早期死亡激活事件（EGL-1介导CED-4的发布）在体外使用纯化重组蛋白质强烈表明，拟议的蛋白质相互作用是直接。
CED-9/EGL-1复合结构的同调建模基于结构的第二位置抑制器的设计塞得-9（1950年）突变。
了解G169E效应的结构基础通过替换EGL-1与CED-9的结合，我们进行了同源性研究EGL-1 BH3域之间复合体结构的建模和CED-9基于已发布的综合体结构Bcl-x公司L（左）、CED-9同源物和16氨基酸促凋亡蛋白Bak的BH3结构域肽(25). 在这种模型化的结构，CED-9的Gly-169位于由CED-9的BH1、BH2和BH3结构域和可能与四种残留物中的一种或多种（Asp-63，BH3结构域羧基末端的Asp-64、Phe-65和Asp-66）EGL-1（图。A类).谷氨酸替代Gly-169可能会破坏相互作用EGL-1和CED-9之间通过两种可能的机制。首先CED-9（G169E）中带负电荷的谷氨酸可能会产生静电击退BH3中三个带负电荷的残留物中的一个或多个EGL-1的结构域（Asp-63、Asp-64和Asp-66）。或者体积较大的谷氨酸侧链可能会阻止BH3结构域的进入EGL-1连接到CED-9中的疏水结合袋。要区分在这两种可能性之间，我们试图做出补偿EGL-1的第二位点突变可能缓解静电排斥（D63R、D64RD66R或D63ND64ND66N）或空间排斥CED-9中G169E替代引起的阻碍（D64G或D64A）。我们发现没有EGL-1蛋白携带第一组结合CED-9（68–251；G169E）的突变（D63R、D64RD66R或D63ND64ND66N）（图。D类). 这些突变也影响EGL-1的结合至CED-9（68–251）；EGL-1（D63R）的结合亲和力或CED-9（68–251）的EGL-1（D63ND64ND66N）部分减少EGL-1（D64RD66R）与CED-9（68–251）的结合被完全废除（图。D类). 相反，EGL-1突变蛋白第二类（D64G或D64A），同时绑定CED-9（68–251）以及EGL-1，结合CED-9（68–251；G169E）明显优于EGL-1和形成对处理不敏感的稳定复合物Nonidet P-40（图。D类). 这些结果表明，空间位阻CED-9中G169E替代引起的障碍可以部分地说明EGL-1与CED-9（68–251；G169E）结合减少，但他们不排除静电斥力可能仍在破坏EGL-1与CED-9（68–251；G169E）。
EGL-1 BH3域与CED-9。(A类)建模复合体的带状立体图。CED-9和EGL-1（BH3域）的主干以绿色和分别是洋红。潜在的关键界面残留物是用彩色棒描绘：Y168（黄色）、G169（红色）和R170CED-9中的（蓝色）和EGL-1中的D63、D64和D66（全部为红色）。虚线CED-9中G169位置的谷氨酸残留表明CED-9获得功能突变。(B类)顺序EGL-1和人类Bak的BH3域之间以及CED-9和Bcl-xL（左）CED-9和Bcl-x公司L（左）使用SWISS-MODEL程序进行了优化(24).Bcl-x中先前定义的七个α螺旋（H1–H7）L（左）用绿色条表示(25).
与EGL-1与CED-9结合的假设一致对从CED-4/CED-9复合物中释放CED-4很重要，无携带第一组突变的EGL-1蛋白促进CED-4/CED-9（68–251；G169E）中CED-4的释放复合物，而EGL-1（D64G）和EGL-1从CED-4/CED-9（68–251；通过与CED-9（68–251；G169E）形成新的络合物来形成G169E络合物（图。C类，7-12车道；图。D类，8–14车道）。强化这一结论的是，EGL-1突变体保留了bind CED-9（D63R、D64A或D64G）也能够从CED-4/CED-9（68–251）复合物，而EGL-1（D64RD66R）不能结合CED-9，不能释放CED-4（图。D类; 图。C类，3–6车道；图。D类，车道4-7）。
EGL-1的第二位点突变抑制塞得-9（1950年）突变在体内.
接下来我们研究了EGL-1结合CED-9和从CED-4/CED-9复合物中释放CED-4在体外与它诱导线虫细胞死亡的能力相关。简要地，我们产生了表达野生型或突变型的转基因线虫EGL-1蛋白在秀丽线虫热冲击启动子或内源性egl-1发起人。我们然后确定表达这些蛋白质通过计算转基因动物胚胎(7). 转基因被引入塞得-1(电子1735);egl-1(编号3082)动物救援试验egl-1（n3082）功能丧失表型和塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年)测试细胞杀伤的动物这个塞得-9(1950年)背景（塞得-1突变导致持续的细胞尸体表型，促进经历程序性细胞死亡的细胞的评分；裁判。33). 当在20°C下检查时塞得-1(电子1735),第1阶段(电子1735);egl-1(编号3082)，以及塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年)动物的平均细胞尸体分别为31、0.2和3.3个，表明在没有EGL-1或CED-9（G169E）很少发生细胞死亡（表). 热休克诱导的野生型EGL-1蛋白恢复了细胞杀伤并导致平均约40具细胞尸体塞得-1(电子1735);egl-1(编号3082)但未能诱导任何额外的细胞死亡塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年)动物（表). 相反，EGL-1（D64RD66R）的表达不能结合CED-9或CED-9（G169E）的蛋白质没有诱导任一突变动物的任何额外细胞死亡（图。D类和表). 此外，表示EGL-1（D63R）或EGL-1CED-9（G169E），在塞得-1(电子1735);egl-1(编号3082)但没有导致任何额外的细胞死亡塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年1月)动物（图。D类和表). 这些结果提供了进一步的信息支持EGL-1与CED-9结合的假设对其细胞杀伤活性很重要。
表1
| 热休克蛋白建造* | 阵列 | egl-1（n3082）
| 塞得-9（1950年）
|
|---|
| 胚胎数量 | 第个，共个尸体† | 胚胎数量 | 第个，共个尸体† |
|---|
| 无 | | 30 | 0.2 ± 0.4 | 30 | 3.3 ± 1.8 |
| 矢量 | 1 | 30 | 0.3 ± 0.5 | 30 | 1.6 ± 1.6 |
| 2 | 30 | 0.2 ± 0.5 | 30 | 2.7 ± 1.7 |
| 三 | 30 | 0.3 ± 0.5 | 30 | 2.6 ± 1.3 |
| EGL-1型 | 1 | 31 | 46.0 ± 24.6 | 30 | 4.0 ± 1.9 |
| 2 | 31 | 33.6 ± 20.9 | 30 | 3.8 ± 1.8 |
| 三 | 30 | 40.5 ± 15.7 | 30 | 2.3 ± 1.8 |
| EGL-1（D63R） | 1 | 32 | 43.4 ± 24.3 | 31 | 2.6 ± 2.3 |
| 2 | 30 | 31.9 ± 25.1 | 30 | 2.8 ± 2.7 |
| 三 | 30 | 46.9 ± 13.2 | 30 | 3.2 ± 2.0 |
| EGL-1（D64RD66R） | 1 | 30 | 0.6 ± 1.3 | 30 | 3.2 ± 2.6 |
| 2 | 33 | 0.2 ± 0.6 | 32 | 2.6 ± 1.5 |
| 三 | 31 | 0.7 ± 1.3 | 30 | 3.4 ± 1.8 |
| EGL-1（D63ND64ND66N） | 1 | 30 | 34.8 ± 17.0 | 30 | 3.6 ± 2.5 |
| 2 | 30 | 32.2 ± 19.0 | 30 | 2.6 ± 1.5 |
| 三 | 30 | 35.0 ± 17.6 | 30 | 3.4 ± 1.9 |
有趣的是，当EGL-1（D64A）或EGL-1蛋白（D64G）结合CED-9（G169E）明显优于EGL-1并结合CED-9以及EGL-1在热休克促进剂的控制下表达，我们观察到两种药物的细胞杀伤不一致塞得-1(电子1735);egl-1型(编号3082)和塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年)动物，包括强壮的细胞从杀死到不杀死细胞（数据未显示）。一个可能的解释细胞杀伤的这种不一致性EGL-1突变蛋白，是突变（D64A或D64G）可能具有温度敏感性对EGL-1或其稳定性的影响与CED-9相互作用。事实上，我们发现在体外EGL-1（D64G）和EGL-1的结合（D64A）与CED-9（野生型或G169E）在33°C下失稳热冲击实验（数据未显示）。EGL-1与CED-9的结合或CED-9（G169E）也受温度影响，但影响较小范围（未显示数据；请参见下文）。检查死亡诱因正常情况下EGL-1（D64G）和EGL-1蛋白的活性温度，我们在控制的发起人egl-1被认为是表达的基因在大多数注定死于线虫的细胞中(34)，并得分突变蛋白在三个温度（15，20和25°C），通常用于生长线虫。如上所述，很少有细胞死亡发生在塞得-9(1950年)动物。平均观察到4.5、3.3和3.2个细胞尸体塞得-1(电子1735);第9版(1950年)动物分别处于15、20和25°C（图。). 野生型EGL-1的表达在egl-1发起人导致年细胞死亡人数增加塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年)动物在25、20和15°C时平均分别有一具、三具和六具牢房尸体，表明CED-9（G169E）突变体对较高水平的EGL-1产生反应以温度敏感的方式表达（图。). 符合这些体内观察，我们发现EGL-1结合CED-9（G169E）在体外15°C时的亲和力高于25°C（数据未显示）。重要的是，在所有三个测试温度下，EGL-1（D64G）和EGL-1更强的死亡诱导活性塞得-1(电子1735);塞得-9(1950年)动物比野生型EGL-1蛋白质(P（P）<0.0001），最强在15°C下观察到的死亡诱导活性[平均20个细胞用EGL-1（D64G）观察尸体；图。]. 这些结果表明D64G和D64A替代物增强了EGL-1至CED-9（G169E），也显著增强细胞杀伤EGL-1活性塞得-9（1950年）突变体。与平行在这些实验中，我们检测了这两种药物的致死活性EGL-1突变蛋白ced-1（e1735）；egl-1（n3082）动物使用野生型塞得-9基因。我们发现EGL-1（D64G）或EGL-1egl-1启动子在15°C下诱导的强烈细胞杀伤水平与野生型EGL-1。这一发现与结果一致EGL-1（D64G）和EGL-1（D64A）结合CED-9并从CED-4/CED-9复合物在体外以及EGL-1（图。D类,C类和D类和4）。20和25℃时，EGL-1（D64G）和EGL-1显著降低，进一步证实了温度敏感性这些突变的性质。相比之下，野生型EGL-1蛋白温和的温度敏感性和诱导的细胞数量相当在所有三种测试温度下死亡（图。). 总的来说，这些结果在体内EGL-1的细胞杀伤活性及其对CED-9 as的结合亲和力以及从CED-4/CED-9复合物中释放CED-4的能力在体外清楚地确立了EGL-1和CED-9之间需要相互作用体内对于EGL-1诱导细胞死亡。
EGL-1（D64G）和EGL-1塞得-9（1950年）EGL-1的突变体。10千字节egl-1型野生型基因组片段（阴影框）上游3.8 kbegl-1启动密码子和下游5.7 kbegl-1终止密码子(34)或相应的egl-1携带40岁时引入D64G（灰盒）或D64A（空盒）突变μg/ml注入ced-1（e1735）；egl-1（n1084 n3082）unc-76（e911）或ced-1（e1735）；塞得-9（1950年）pTG96的动物（20μg/ml）(35)和p76–16B（50μg/ml）(36).转基因动物在三种温度（15、20或25℃），EGL-1蛋白的细胞杀伤活性为通过计算头部区域的细胞尸体数量进行评估3倍或晚期转基因胚胎。所有数据均为平均值±结果的标准偏差(n个>50）从三个独立的转基因株系。
EGL-1 BH3结构域中的关键残基与其他含BH3结构域的促凋亡蛋白质类。
Asp-63是EGL-1 BH3结构域中的一个残基在所有BH3结构域蛋白中保守，并且已经证明对Bcl-2家族蛋白中异二聚体的形成至关重要BH3域的细胞杀伤活性促凋亡蛋白（参考文献综述。8). 有趣的是EGL-1（D63R）突变体，其中Asp-63被相反的带电荷的精氨酸仍然能够结合CED-9，尽管结合亲和力降低，仍然可以诱导有效的细胞杀伤在里面塞得-1(电子1735);egl-1(编号3082)动物（图。D类和表). 另一个EGL-1突变体也获得了类似的结果，EGL-1（D63ND64ND66N）。相反，在EGL-1的Asp-64和Asp-66（D64RD66R）废除了EGL-1与CED-9和体内EGL-1的杀伤活性（图。D类和表). 这些结果和D64G的结果或者D64A取代可以部分恢复EGL-1与CED-9（G169E）表明保守度较低的Asp-64残基比高度保守的Asp-63残基，是EGL-1/CED-9复合物的界面有助于EGL-1对CED-9的结合特异性。在这方面，EGL-1/CED-9复合体似乎与人类不同Bcl-x公司L（左）/Bak复合体用作我们的模板同源建模。一个与我们的结果是EGL-1 BH3螺旋线在与Bak的方向相比，CED-9中的装订袋Bcl-x内的BH3螺旋L（左）装订袋。
有趣的是，Bcl-2中的类似突变（G145E）并没有导致获得功能表型(26). 很可能是Bcl-2及其同源BH3配体之间的界面为与EGL-1/CED-9不同。因此，这将是有趣的看看其他Bcl-2家族成员之间的结合特异性是否为主要由在复合体的界面。我们成功创建了第二个站点基于这种跨物种同源性建模的抑制突变应鼓励进一步应用此方法进行调查分子相互作用，如蛋白质、蛋白质、DNA和蛋白质–RNA相互作用对其他基础生物过程，特别是在基因接近的系统中不可用。
我们对这个塞得-9（1950年）its的突变及其鉴定CED-9结合伙伴EGL-1的补偿性抑制突变建立了一个体内蛋白质-蛋白质机理控制程序化细胞适当激活的相互作用年死亡秀丽线虫假设细胞死亡途径是高度保守，是这个调节电路的基本组成部分，抗凋亡药物之间的直接物理相互作用类Bcl-2死亡调节器（CED-9）和BH3轴承促凋亡蛋白（EGL-1）导致释放和激活另一种死亡激活蛋白（CED-4）抑制蛋白复合物（CED-4/CED-9）或隔室状线粒体，可以调节包括人类在内的许多物种的细胞凋亡。
