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基因组研究。2007年1月；17(1): 74–81.
数字对象标识：10.1101/克5767907
预防性维修识别码：第716270页
PMID：17135569

组蛋白乙酰化模式对保守和非保守增强子的全基因组预测

大英·卢,1 刚伟（Gang Wei）,1 凯瑟琳·法雷尔,和赵克吉2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

比较基因组研究有助于确定高等真核生物基因组中的转录调控元件，但由于进化变异和比对工具的局限性，许多重要调控元件无法通过此类分析检测到。因此，在本研究中，我们利用表观遗传修饰的高度保守性质来识别潜在的转录增强因子。通过使用高分辨率全基因组定位技术，结合染色质免疫沉淀和基因表达分析的系列分析，我们最近确定了赖氨酸9/14-二乙酰化组蛋白H3在人类T细胞中的分布。我们发现存在46813个组蛋白乙酰化簇区域，称为组蛋白乙酰化岛，其中一些对应于已知的转录调控元件。在本研究中，我们发现人类和河豚之间保守的4679个序列与组蛋白乙酰化岛一致，随机抽样显示其中33%（13/39）可以作为人类Jurkat T细胞的转录增强子。此外，通过比较人类组蛋白乙酰化岛序列和小鼠基因组序列，我们发现尽管这些物种之间的许多区域保持不变，但其中21855个序列并不保守。此外，我们证明，这些非服务序列中约50%（26/51）在Jurkat细胞中具有增强子活性，并且许多直向同源小鼠序列除了在小鼠T细胞染色质中具有保守的表观遗传修饰模式外，还具有增强子活性。因此，通过结合表观遗传修饰和序列数据，我们建立了一种新的全基因组方法，用于识别仅通过比较基因组学无法识别的调控元件。

越来越多的生物体的基因组测序使科学家能够进行比较基因组分析，这在鉴定进化上保守的序列中特别有用，其中许多序列已被证明是重要的转录调控元件(Hardison等人，1997年;哈迪逊2000;Loots等人，2000年;Pennacchio和Rubin，2001年;Miller等人，2004年). 然而，由于可能影响比较结果的各种因素，例如所使用的比对方法、DNA序列的窗口大小以及用于比较的其他参数的严格性，仅基于DNA序列的基因组比较已被证明是具有挑战性的。比较基因组学表明，在密切相关的物种之间存在大量保守的非编码序列，因此很难识别具有功能重要性的序列。因此，经常需要对多个进化上不同物种的基因组进行比较，以筛选出具有显著保守性的区域，甚至由于存在缓慢进化的中性区域，这也可能导致识别假阳性（有关审查，请参阅Stone等人，2005年). 由于功能重要序列的退化，比较基因组分析也很复杂，例如，许多转录因子可以识别多个结合位点，并最终产生相同的功能效应。此外，保守功能区内通常嵌入少量中性进化序列，因此在分析中可能会遗漏这些区域，尤其是在更严格的比较中。

相对较小且紧凑的河豚河豚为我们提供了一种鉴定脊椎动物保守功能元件的有用工具(Brenner等人，1993年;Aparicio等人，2002年;Venkatesh和Yap 2004). 这是因为河豚已经消除了大部分非必需的DNA，而这种生物是哺乳动物最远亲的脊椎动物之一，与哺乳动物有着相似的基因库，这意味着它使用类似的调控机制。然而，应该注意的是，河豚和其他射线鱼的基因组发生了重复(Taylor等人，2003年;Christoffels等人，2004年)已经证明，一些重复的同源区域已经适应了新的或子功能角色（例如。，Tümpel等人，2006年). 然而，河豚和哺乳动物之间已经确定了许多保守的调控区域，例如，存在于小鼠和河豚之间的保守调控元件霍克斯b-4基因(Aparicio等人，1995年). 然而，尽管这些物种之间存在一些监管保护，但它们之间仍存在很大的进化距离，因此，使用河豚基因组的比较基因组学不太可能识别出在高等真核生物更复杂的调控机制中发挥关键作用的更专门的物种特异性调控元件。

真核基因表达调控的研究表明，不仅基因组DNA序列本身，而且染色质的高阶结构在建立和维持严格调控的基因表达中起着重要作用。已知许多表观遗传修饰发生在活性和抑制染色质区域（有关综述，请参阅Jenuwein和Allis 2001;Felsenfeld和Groudine 2003年;彼得森和拉尼尔2004;Lam等人，2005年;Margueron等人，2005年;Martin和Zhang 2005)已知许多这些修饰发生在重要的调控元件上，例如在基因启动子和许多增强子上发现的高水平组蛋白乙酰化。已知其中一些修饰与活性染色质有关，包括组蛋白H3在赖氨酸9和14上的乙酰化和赖氨酸4、36和79上的甲基化，而其他修饰，包括组分子H3在赖氨酸9或27上的甲基化都与抑制性染色质环境有关，尽管最近的数据显示，不同的染色质亚群中存在活性修饰和抑制修饰的重叠(Bernstein等人，2006年;Roh等人，2006年). 此外，众所周知，许多调控元件仅在特定的细胞/组织类型或根据环境条件携带这些表观遗传修饰，而这无法通过仅基于序列的比较基因组学来确定。因此，在进行基因组比较以确定可能具有重要功能的区域时，不仅应该考虑DNA序列本身，而且预计表观遗传修饰模式在高度重要的调控区域中是保守的。在一些哺乳动物基因座上已经证明了组蛋白修饰的这种保守性，例如，在鸟类和哺乳动物β-珠蛋白基因座的基因座控制区（LCR）DNaseI超敏位点元件上显示了保守的组蛋白H3乙酰化(Schübeler等人，2000年;Litt等人，2001年;Bulger等人，2002年,2003). 因此，表观基因组比较有助于筛选出密切相关序列（如小鼠和人类）之间具有重要功能的保守非编码序列。然而，迄今为止进行此类比较的主要缺点是缺乏关于不同物种表观遗传修饰模式的全基因组信息，此外，这些表观遗传改造模式（但不是基因组序列）也是如此可能因组织而异，并随环境条件的变化而变化，这取决于相关基因的染色质动力学。

在目前的工作中，我们利用了我们之前的研究，其中我们使用了克全基因组妈妈扑通t吨测定赖氨酸9/14-二乙酰化组蛋白H3在人类外周T细胞中分布的技术（GMAT）(Roh等人，2005年). 我们之前已经证明，这种染色质修饰与活性基因启动子和与基因表达相关的重要调控元件相关，并且我们已经将携带这种修饰的基因组区域定义为组蛋白乙酰化岛。由于这些组蛋白乙酰化岛很可能表示功能元件，我们将其序列与河豚和小鼠基因组序列进行了比较，Jurkat细胞报告基因检测的随机抽样显示，大量保守和非保守乙酰化岛序列都可以作为增强子发挥作用。此外，我们发现小鼠基因组中的一些同源区域也显示出增强活性，并丰富了小鼠T细胞染色质中的组蛋白乙酰化模式。因此，我们表明，通过将传统的比较基因组策略与全基因组的表观遗传信息相结合，我们可以更准确地定位具有功能重要性的区域，并发现在DNA序列水平上不一定保守的功能重要区域，从而为识别调控元件提供了一种新的全基因组技术。

结果

我们之前使用一种称为GMAT的无偏见全基因组定位技术，绘制了人类外周T细胞组蛋白H3乙酰化的图谱(Roh等人，2004年,2005,2006). 这项技术结合了染色质免疫沉淀（ChIP）分析和基因表达系列分析（SAGE）分析，包括从乙酰化组蛋白富集的染色质中分离DNA标签并进行后续测序，测序DNA中这些标签的频率与人类T细胞基因组中特定位置的组蛋白乙酰化水平相对应。通过GMAT分析，我们确定了46813个基因组区域，其中存在两个或多个独特的乙酰化标签簇，并命名了这些组蛋白乙酰化岛。具体而言，组蛋白乙酰化岛的定义基于以下标准：（1）它们由来自两个以上相邻NlaIII位点的GMAT序列标签组成（GMAT分析中用于切割免疫沉淀染色质的限制性内切酶）；（2） 标签的检测频率≥1；相邻乙酰化岛之间的距离大于500bp。此外，这些乙酰化岛序列的长度范围为44至7827 bp（平均大小为508 bp），并且考虑到GMAT分析的ChIP步骤的分辨率为500 bp–1 kb，乙酰化染色质的精确基因组位置可能距离GMAT序列标签的位置高达1 kb。许多乙酰化岛与保守的人类-啮齿动物非编码序列（CNS）和T细胞中已知的调节元件显著相关，启动子区域检测到高水平的H3乙酰化，尤其是在人类T细胞中高表达的基因(Roh等人，2005年).

在本研究中，为了确定人类T细胞组蛋白乙酰化岛和河豚基因组之间的序列保守性，我们使用VISTA基因组浏览器确定了这些基因组的预先计算的比对序列(Mayor等人，2000年;弗雷泽等人，2004年;http://pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2). 在这两种远亲脊椎动物之间保守的91915个基因组序列中（其中70339或76.5%在小鼠中也保守，68494个是蛋白质编码区，1338个是未翻译区，22083个是其他非编码序列；有关用于定义保守的标准，请参阅方法），我们发现其中14068个序列（或15%）位于从UCSC基因组浏览器下载的RefSeq转录起始位点（TSS）的5kb内(http://www.genome.ucsc.edu/). 所有在VISTA数据库中显示命中的人类区域都被认为是保守的，无论它们在河豚基因组中出现一次还是两次。通过计算50-bp窗口大小的序列数量，我们绘制了14068个保守序列的分布图，这些保守序列位于人类基因组中已知或预测TSS的5kb范围内(图1A). 我们发现，这些保守序列中的大多数倾向于映射到TSS的下游或基因体中，而不是映射到上游或启动子区，这反映了大量的保守编码区序列。在检查与组蛋白乙酰化岛相关的保守序列的分布后（参见表1我们发现4679个乙酰化岛与保守序列一致，其中2459个位于TSS的5kb范围内，如图所示图1B：。我们发现这些保守的乙酰化岛序列中有很大一部分（57.8%）位于TSS（阴影盒，图1B). 我们还注意到，这些序列中的许多仍然存在于TSS上游的5-kb区域，这表明其中一些可能是T细胞中的功能转录调控元件，尽管与组蛋白乙酰化相关的许多远端调控元件可能存在于此处研究的5kb限值之外。

表1。

人与河豚/小鼠的乙酰化岛和序列保守性

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人类和河豚之间保守序列的分布。(A类)人类-河豚保守序列的分布。相对于人类基因组中最近的RefSeq转录起始位点（TSS）5 kb内的位置，共绘制了14068个保守序列。这个年-axis表示TSS上游或下游5kb的序列数（50-bp窗口大小）。(B类)与组蛋白乙酰化岛相关的人类-河豚保守序列的分布。共绘制了2459个与乙酰化岛相关的保守序列，如下所示A类。阴影框表示在TSS的1 kb范围内发现的序列。

为了研究人类T细胞组蛋白乙酰化岛与更密切相关的生物体的序列保守性程度，我们接下来将这些乙酰化岛序列与小鼠基因组序列进行了比较。通过VISTA分析，我们总共发现1362767个基因组区域在人和小鼠之间是保守的，其中162613个是蛋白质编码区，37664个是未翻译区，1162490个是其他非编码序列。通过比较46813个人类T细胞乙酰化岛序列和这些保守序列，我们发现24958个乙酰化岛与保守区域一致（参见表1详细信息）。此外，我们还对使用组蛋白乙酰化岛数据揭示人类和小鼠之间不保守但可能代表功能元件的序列感兴趣。根据该分析，我们计算了19070个非乙酰化岛序列与人类基因组中最近的RefSeq TSS的相对距离，并通过计算50 bp窗口大小的岛数，绘制了它们在TSS 100 kb范围内的分布(图2A). 同样，如图1，我们发现大多数这些非连续序列映射在TSS处或附近。这些乙酰化岛序列的很大一部分存在于距离TSS很远的地方（>20kb），这表明它们可能代表参与长程基因调控或染色质结构域形成的远距离功能元件，如增强子、LCR、基质附着区或边界元件，或者它们可能代表未知的非编码RNA基因和/或基因间转录物。我们还想比较这些非保守乙酰化岛序列和保守乙酰化岛屿序列的分布。因此，我们绘制了22796个保守序列的分布图，这些保守序列位于TSS的100kb范围内(图2B). 保守乙酰化岛序列的这种分布与非保守序列的分布毫不奇怪地相似，但我们注意到更多的保守序列位于或接近TSS。

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人-鼠保守和非保守组蛋白乙酰化岛序列的分布。(A类)绘制了19070个非服务乙酰化岛序列相对于它们在最近的RefSeq TSS 100kb内的位置的分布。这个年-axis表示从TSS中发现的±100 kb的序列数（50-bp窗口大小）。(B类)22796人-鼠保守乙酰化岛序列的分布如图所示A类.

为了确定保留的人-河豚或人-鼠非保留的乙酰化岛序列显示功能增强子活性的比例，我们决定在报告基因分析中随机抽取其中一些人类序列进行增强子活动。在这些分析中，我们插入了跨越热休克启动子驱动荧光素酶报告基因上游乙酰化岛的1.2-kb测试序列(图3A)，我们将这些构建物瞬时转染到人类Jurkat T细胞中。通过比较每个结构体与没有插入的相同结构体的荧光素酶活性，我们确定了所选乙酰化岛序列的相对增强活性(图3B，C; 补充表S1和S2）。为了测试河豚人保守序列的增强子活性，从TSS中选择了39个大于1 kb的序列，省略了在图1。数据显示，在39个测试的人类保守序列中，13个显示出至少1.5倍的增强子活性(图3 B、D; 补充表S1），与这些序列代表功能元素的预期一致。此外，我们测试了51个位于转录起始点>1kb的人-鼠非融合序列，我们发现其中26个序列在我们的分析中显示了增强子活性(图3C、D; 补充表S2），表明这些组蛋白乙酰化岛是人类T细胞中的重要元素，尽管缺乏序列保守性。鉴于在我们的分析中，我们的保守序列和非保守序列的数量惊人地高，分别为33%和50%，因此有必要确定这些序列中的增强子活性对于乙酰化区域是否具有统计意义。因此，我们随机选择了人类基因组中的九个非乙酰化序列，在我们的报告基因检测中测试这些序列后，我们发现没有显著的增强子活性超过我们的阈值水平（补充表S3），这强烈表明我们取样的乙酰化序列中有很大一部分是真正的调控元件。此外，通过利用这些随机选择的非乙酰化序列的结果，我们执行了Studentt吨-测试和计算P（P）-在我们的分析中显示增强子活性的所有乙酰相关序列的值(图3; 补充表S1和S2），以及非常低的P（P）-获得的值，范围为8.1×10−13至1.3×10−5（补充表S1和S2）显示，我们的增强子活性具有统计学意义。

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保守和非保守乙酰化岛序列的增强活性分析。(A类)用于测试增强子活性的构造。每个构造都包含一个包含乙酰化岛序列的1.2kb序列，乙酰化岛是由热休克基因启动子（HS-pr）驱动的荧光素酶报告基因上游克隆的。(B类)在Jurkat细胞中瞬时转染构建物后，39个乙酰化岛序列的报告基因活性在人类和河豚之间保守。相对荧光素酶活性(x个-axis）通过将测试构建体的荧光素酶活性与没有假定的增强子插入的类似构建体的荧光素酶活性进行比较来确定。施工编号（如补充表S1所示）显示在年-轴。误差线表示平均值的标准偏差。(C类)51个乙酰化岛序列的报告基因活性在人和小鼠之间不保守，如图所示B类。上的构造编号年-轴如补充表S2所述。(D类)增强子分析结果摘要。（AI）乙酰化岛。

已知人类非乙酰化岛序列的分布(图2A)事实上，其中大约一半的人表现出增强子活性(图3C、D)，我们感兴趣的是确定在增强子分析中，同源非连续小鼠序列是否具有功能，以及它们在小鼠T细胞中是否也含有乙酰化组蛋白H3。因此，我们从这些在上述分析中显示增强子活性的非候选人类乙酰化岛序列中选择了9个，并通过使用VISTA基因组浏览器，我们确定了小鼠基因组中的空间等效或候选同源序列（补充表S4），根据浏览器使用的标准，对应于位于人类-小鼠共有基因组区域保守序列块之间的序列。然后，我们在增强子分析中测试了这些序列（补充表S4），比较了它们在人类Jurkat T细胞和小鼠胸腺衍生EL4 T细胞系中的增强子活性(图4). Jurkat细胞中测试的序列(图4; 补充表S4），我们发现44%的相应小鼠序列显示出增强子活性，这表明尽管序列本身并不保守，但这些相应区域之间仍存在一些功能保守。此外，当测试这些序列在小鼠EL4细胞中的增强子活性时，我们发现这些序列中有更高比例的序列（67%）表现出增强子的活性，而小鼠EL4没有人类Jurkat细胞中可能存在的跨物种变异(图4; 补充表S4）。

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增强非连续但相应的小鼠序列的活性。在人Jurkat细胞和小鼠EL4细胞中瞬时转染后，显示了九个非同源小鼠序列的增强子活性。相关增强子活性测定如下图3。构件编号(x个-轴）如补充表S4所述。

接下来，我们想确定Jurkat细胞和小鼠T细胞染色质中这些序列的组蛋白乙酰化修饰模式。我们首先对Jurkat细胞中显示增强子活性的一些人类序列进行了ChIP分析(图5A). 尽管这些序列在人类外周血pan T细胞的GMAT分析中被定义为组蛋白乙酰化岛(Roh等人，2005年)，增强子分析中使用的Jurkat细胞是CD4+T细胞系和可能没有与GMAT分析中使用的原代T细胞相同的修饰。因此，我们分析了组蛋白H3的赖氨酸9/14二乙酰化和组蛋白H4的赖氨酰4二甲基化(图5A)我们发现，这些序列中的大多数（九个测试序列中至少有七个），但并非全部，在Jurkat细胞中显示了这些组蛋白修饰。接下来，我们想对同源小鼠序列进行取样，以确定它们在小鼠T细胞染色质中是否也有保守的组蛋白乙酰化，类似于人类T细胞染色素中的组蛋白酰化岛。因此，我们用赖氨酸9/14二乙酰组蛋白H3抗体对15个不同的同源小鼠区域进行了ChIP分析，我们发现大约三分之二的序列在序列水平上不保守，在小鼠胸腺细胞中也携带这种组蛋白修饰(图5B). 因此，增强子分析(图4)组蛋白修饰分析(图5)这可能意味着，至少其中一些非连续但相应的小鼠序列具有功能保守性（尽管由于适应性进化或新功能化可能导致功能改变），这不是由序列本身决定的，而是由表观遗传修饰模式决定的。

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乙酰化岛序列的组蛋白修饰。(A类)使用人Jurkat细胞中的二乙酰K9/K14组蛋白H3和二甲基K4组蛋白H1抗体进行ChIP分析。序列号见补充表S2。(B类)使用小鼠胸腺细胞中的二乙酰K9/K14组蛋白H3抗体进行ChIP分析。补充表S2和S4中描述了序列号。

讨论

在这项研究中，我们利用了我们之前在人类T细胞中的全基因组组蛋白乙酰化数据，并将乙酰化岛序列与远缘脊椎动物河豚以及更近缘物种小鼠的基因组序列进行了比较。通过这种方式，我们在河豚鱼和人类之间鉴定了许多进化上保守的序列，并且我们已经证明，这些序列中约有三分之一在报告基因分析中充当增强子，因此这些序列可能具有高度的功能。在我们的人-小鼠乙酰化岛序列比较中，我们将重点放在了这些物种之间不保守的序列上。我们的数据显示，大约一半的序列在人类Jurkat T细胞中具有增强活性，因此可能代表重要的调控区域。此外，我们已经表明，在我们的小鼠T细胞系报告基因检测中，约三分之二的已取样的同源但非同源的小鼠序列显示出增强活性，并且其中许多序列在小鼠胸腺细胞中也有保守的组蛋白乙酰化。因此，考虑到40%的小鼠基因组可以与人类基因组对齐(Waterston等人，2002年)我们利用表观基因组数据确定全基因组调控序列，包括那些不保守的调控序列，这标志着比较基因组学领域向前迈进了一步。

虽然我们的保守和非保守乙酰化岛序列在我们的报告基因分析中都作为增强子发挥作用，但我们不能排除那些没有显示增强子活性的序列可能仍然具有功能意义的可能性。这些组蛋白乙酰化岛序列可能在其他细胞系、不同发育阶段、不同环境条件下，与它们占据的染色质域中的其他元素结合，具有增强活性，或者它们可能与我们在分析中测试的热休克促进剂不兼容。这些组蛋白乙酰化区域也有可能不是增强子，但可能代表其他具有生物学重要性的区域，例如，它们可能是边界元件、DNA重组或修复位点或复制起源。众所周知，组蛋白乙酰化的高水平并不一定局限于启动子或增强子区域，在这类情况的文献中有各种报道（例如。，Ikura等人，2000年;McBlane和Boyes 2000;麦克默里和克兰格尔2000;Litt等人，2001年;Bird等人，2002年;Mutskov等人，2002年;Bulger等人，2003年;Aggarwal和Calvi 2004). 此外，对于在我们的分析中显示增强子活性的保守和非保守序列，重要的是要注意，即使组蛋白乙酰化岛保持不变，我们也不能仅根据这些分析得出功能性结论，并且可以对这些区域进行各种推测，包括适应性进化或新功能化导致功能改变的可能性，或它们可能代表未知非编码RNA的可能性。

在小鼠基因组中未显示增强子活性的非同源区的情况下，人类T细胞乙酰化岛可能代表物种特异性增强子/调节区。这方面的一个例子是存在于IL13号机组基因在吨H（H）2细胞因子位点(Roh等人，2005年)与另一个乙酰化岛并列，该乙酰化岛以前被确定为CNS，是协调表达吨H（H）2基因(Loots等人，2000年). 然而，在分析非连续但“对应”的小鼠序列时，需要注意的是，定义这些高度分散但同源的区域的准确性受到我们使用的VISTA对齐程序的能力的限制。虽然此对准器通常用于计算全局比对，并且不断改进以处理染色体重排，如反转、缺失、重复、插入和核苷酸替换(Mayor等人，2000年;Couronne等人，2003年;弗雷泽等人，2003年,2004)，总是有可能预计算的对齐序列不是真正的同源或对应区域，也许另一种对齐方法，例如局部对齐程序或系统发育足迹分析，可以发现更精确的对应区域或确定是否，其他物种中存在真正的同源区。因此，为了确定此处测试的单个非保守乙酰化序列的生物/进化相关性，对我们表观基因组比较的进一步深入分析必须涉及更精确的局部比对和因子结合位点数据，这超出了当前研究的范围。尽管如此，尽管存在这些局限性，但值得注意的是，在我们的分析中，如此高比例的非保守序列显示出增强活性，并且其中许多序列在小鼠T细胞染色质中具有保守的组蛋白乙酰化。在一项由Bernstein等人（2005年）其中，组蛋白H3赖氨酸4甲基化在人类21号和22号染色体以及一系列人类和小鼠基因座上进行了比较。然而，我们的研究已经扩展到全基因组范围，除了显示这些区域的组蛋白乙酰化保守外，我们还通过证明非保守人类-小鼠序列的体外增强子活性，进一步推进了分析。

虽然我们的研究是表观基因组序列比较新时代的一部分，但利用表观遗传学特征识别重要染色质调节区的概念在生物学中已经使用了一段时间，例如，CpG岛的出现及其甲基化状态，或出现DNaseI超敏位点，这些位点后来被证明具有增强子、LCR或边界元素活性，甚至在潜在DNA序列已知之前。然而，这些先前的研究大多受到序列和/或克隆可用性的限制，只能局限于正在调查的特定位点。如今，越来越多的高等真核生物基因组的最新测序，以及绘制全基因组染色质修饰图的新技术的出现（有关综述，请参阅Huebert和Bernstein 2005年;Barrera和Ren 2006年;Callinan和Feinberg 2006)包括我们的GMAT分析，为未来破译人类基因组功能相关领域的突破铺平了道路。组蛋白修饰数据不仅可以用于此类目的，而且特定转录因子的全基因组结合位点、DNA甲基化模式或DNaseI超敏反应的知识也可以用于识别具有重要功能的基因组区域。为此，最近的一项研究使用全基因组染色质免疫沉淀研究来识别人类基因组中独立于mRNA序列的启动子(Kim等人，2005a,b). 此外，还开发了绘制全基因组DNaseI超敏反应图的方法(Dorschner等人，2004年;Sabo等人，2004年;Crawford等人，2006年)最近的研究还比较了正常和人类癌细胞中的DNA甲基化(Weber等人，2005年;Callinan和Feinberg 2006;Wilson等人，2006年).

总之，我们将全基因组表观基因组数据与传统比较基因组学相结合，以揭示人类和小鼠基因组中的保守和非保守功能重要区域，从而发现了仅通过序列比较无法识别的新功能区域。未来，通过比较人类T细胞组蛋白修饰序列和小鼠T细胞染色质全基因组组蛋白修饰，该方法可以得到更多信息。在不断挖掘人类基因组并剔除重要调控区域的过程中，很明显，不同生物体之间的基因组比较有其局限性，未来的比较不仅要考虑DNA序列本身，还要考虑周围染色质的结构及其相关修饰。来自不同细胞类型和生物体的未来全基因组表观基因组数据的出现无疑将有助于这些表观基因组比较，从而大大增加我们发现重要调控区域的机会，这反过来将进一步加深我们对基因调控、发育过程、，以及人类疾病的根本原因。

方法

序列对齐

为了进行序列比较，将UCSC人类2003年7月（hg16/NCBI构建34）的基本序列组合与鼠标mm4 2003年10月的组合或河豚v.3.0 2002年8月组装。根据VISTA分析网站上的预计算比对，下载了保存的序列和相应的比对序列(http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml)使用默认滑动窗口大小100 bp计算VISTA曲线中每个碱基对的守恒得分。在我们的分析中，具有至少70%一致性的区域被认为是保守的，所有其他参数都是为VISTA数据库中的预计算比对定义的。人类hg16组装体的RefSeq基因表可从UCSC网站下载(http://www.genome.ucsc.edu/). 如前所述获得组蛋白乙酰化岛序列(Roh等人，2005年;http://dir.nhlbi.nih.gov/labs/lmi/zhao/epigenome/G&D2005.htm).

细胞系

Jurkat细胞和EL4细胞维持在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合物的RPMI 1640培养基中。

报告基因分析

使用高保真铂金Taq DNA聚合酶（Invitrogen）扩增增强子候选物，所有产物的长度约为1.2 kb，中心为乙酰化岛序列（补充表S1–S4）。可根据要求提供引物序列。为了在增强子分析中测试这些序列，通过将来自pIND（Invitrogen）的SmaI–NheI（钝端）最小热休克启动子片段亚克隆到pGL3-basic（Promega）的钝端HindIII位点来构建pGL3-HS。然后将扩增的候选序列亚克隆到热休克启动子上游pGL3-HS结构的KpnI或BglII限制位点。根据制造商的指示，使用Superfect转染试剂（Qiagen）将每个报告构建物的2μg转染Jurkat细胞，并使用BIO-RAD基因脉冲器（250 V，960μF）电穿孔，将每个报告构造物的10μg转印EL4细胞。制备细胞提取物，并在转染48 h后使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素素酶活性。所有增强子测定至少重复进行一次。

ChIP分析

如前所述，使用Jurkat细胞和小鼠胸腺细胞进行ChIP分析(Roh等人，2004年). 免疫前血清（Santa Cruz Biotechnologies）、抗乙酰化K9/K14组蛋白H3（Upstate）和二甲基K4组蛋白-H3（Abcam）抗体用于免疫沉淀。PCR反应中使用的引物序列可根据要求提供。32次PCR扩增后，用琼脂糖凝胶电泳检测输入和免疫沉淀DNA样品。

致谢

我们感谢Michael Zhang博士和Warren Leonard博士对手稿的批判性阅读，感谢Dangsheng Li博士和Zhao实验室成员的有益建议和讨论，感谢Deyou Zheng博士建议检查补充表S1中的第25和34区域。这项工作得到了NIH、国家心脏、肺和血液研究所的院内研究计划的支持。

脚注

[补充材料可在线获取，网址为网址：www.genome.org.]

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.5767907

工具书类

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文章来自基因组研究由以下人员提供冷泉港实验室出版社