肝线粒体叶酸代谢模型的计算机实验

模型概述

图​图11显示了本文所用肝细胞模型中的生化途径。矩形框表示模型中可以变化的底物，椭圆包含催化特定反应的酶的缩写。底物和酶的全名出现在附加文件1。非盒式基板被视为常数。该模型由23个耦合微分方程组成，用于盒装基板的时间进程。如有可能，各种反应速度的公式取自实验文献。在某些情况下，我们调整了实验范围内的速率常数，使细胞液和线粒体中叶酸的浓度与实验观察到的浓度相似。在这个模型中，MTD、MTCH、FTD和FTS在线粒体中是活跃的，TS和DHFR在胞浆中上调，所以这个模型代表了一个正在积极分裂的肝细胞。

该模型是Reed等人使用的模型的扩展[30]. 添加了线粒体叶酸底物和酶，肌氨酸和二甲基甘氨酸是新的变量（假设每个变量在胞浆和线粒体中的浓度相同）。细胞外丝氨酸、甘氨酸和蛋氨酸浓度可以指定为时间的函数。细胞溶质和线粒体丝氨酸和甘氨酸的浓度可以变化，细胞溶质蛋氨酸的浓度也可以变化。适当的动力学用于外部、细胞溶质和线粒体隔室之间的运输。在本模型中，线粒体和细胞溶质中的六氯环己烷浓度可以变化，甲酸盐在线粒体和细胞溶解室之间运输。此外，AICAR是模型中耦合PGT和AICART反应的变量。最后，我们添加了一个丝氨酸汇，该汇对应于细胞溶质丝氨酸在糖异生和三羧酸循环中的使用。模型的详细信息见附加文件1.

表​表11显示了模型中的稳态浓度和速度，假设细胞外甘氨酸、丝氨酸和蛋氨酸的浓度分别保持恒定在300μM、150μM和30μM。对于图中的可逆反应​图1，1，正方向如下：5,10-CH₂-对于MTD和MTCH，THF至5,10-CH=THF至10f-THF；FTS的THF至10f-THF；丝氨酸转甘氨酸用于SHMT；SAH转化为SAAH的同型半胱氨酸。我们参考表中所示的值​表11作为本文中的“正常”。叶酸在胞浆和线粒体中的计算分布与Cook报告的类似[15].

在模型中，我们用浓度表示底物的数量，并假设线粒体占细胞体积的1/4。所以相同数量的分子在两个隔间中的浓度不同。例如，我们假设“正常”细胞叶酸总浓度为20μM。如果叶酸分子在细胞质和线粒体之间平均分配[15]则细胞液和线粒体中的叶酸总浓度分别为13.3μM和40μM。我们假设肌氨酸和二甲基甘氨酸自由扩散，因此在细胞质和线粒体中的浓度相同。对于隔室之间的运输，速率（μM/h）是细胞质中浓度的变化速率。如果基质浓度为C_c（c）细胞溶质和浓度C_米在线粒体中，观察到的细胞总浓度（当隔室合并时）将为（0.75）C_c（c）+（0.25）摄氏度_米.表​表22显示叶酸代谢物和氨基酸的正常细胞总浓度。

表​表3三显示了丝氨酸、甘氨酸和HCOOH在隔间之间的正常运输速率。例如，在正常稳态下，胞浆从细胞外介质中接收799μM/h的丝氨酸，并向线粒体损失30.4μM/h（表​（表3）。三). 当然，通过CBS反应，胞浆也损失99.7μM/h，通过胞浆SHMT反应损失8.19μM/h和糖异生损失662μM/h（表​（表11和​和3三).

B.叶酸减少状态

图​图3三显示了叶酸水平降低50%时各种代谢物和反应的稳态浓度或速率的百分比变化。当然，5mTHF的浓度会下降，这会释放GNMT的抑制作用，因此GNMT反应会更快并耗尽SAM。蛋氨酸和SAM也会耗尽，因为同型半胱氨酸的重甲基化更少。由于蛋氨酸循环中的长程调节[29]，DNMT甲基化反应的速率仅适度降低。线粒体中甲酸盐的转运减少，胸苷酸合成和嘌呤合成速率显著降低。线粒体中GDC反应的速率下降是因为线粒体THF低得多。由于GDC反应分解甘氨酸，甘氨酸的浓度升高，这也通过SHMT反应提高了丝氨酸的浓度。Allen等人观察到了这一现象[31]叶酸缺乏症患者的肌氨酸和二甲基甘氨酸均升高，我们在模型中也观察到了临床结果（图​（图3）。三). 由于GNMT速率升高（因为5mTHF的抑制作用较小），细胞质中产生更多的肌氨酸，并且由于BHMT反应速率升高，产生更多的二甲基甘氨酸。由于THF的浓度较低，肌氨酸和二甲基甘氨酸在线粒体中的使用率较低。

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图3

叶酸水平降低50%时，选定代谢物的稳态浓度和选定反应的稳态反应速度发生变化。

C.SHMT表达

MacFarlane等人[32]报告显示，缺乏肝细胞溶质SHMT的小鼠SAM/SAH比率正常。为了在模型中验证这一点，我们完全消除了细胞溶质SHMT反应。这导致稳态[SAM]=62.6μM，[SAH]=13.1μM。这些代谢物的正常值在模型[SAM]=63.6μM，[SAH]=13.1μM中。这并不奇怪，因为cSHMT反应的正常净速率非常低（9.2μM/h），因为这种酶准备通过相互转换来调节丝氨酸和甘氨酸的波动。

Herbig等人[14]发现增加cSHMT的表达以甘氨酸依赖的方式降低SAM浓度。他们提出了两种可能的替代机制：（1）cSHMT与MTHFR竞争5,10-CH₂-THF，因此较高的SHMT表达应降低[5mTHF]，从而降低同型半胱氨酸重甲基化为蛋氨酸的速率，降低SAM；或（2）cSHMT隔离5mTHF，降低其自由浓度，从而降低SAM，如（1）所示。在当前模型中，如果SHMT不与5mTHF结合，我们发现SAM浓度对cSHMT的量非常不敏感，也对外部甘氨酸浓度不敏感，这不支持第一个假设。当我们将5mTHF与SHMT的结合添加到模型中，然后上调cSHMT时，我们发现SAM浓度显著降低，支持第二个假设（模拟未显示）。

几位作者观察到，缺乏mSHMT的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是甘氨酸营养缺陷型细胞（例如，见[32,33]). 这些发现被解释为表明线粒体通常向胞浆供应甘氨酸。该模型表明情况更复杂、更有趣。在该模型中，在正常情况下，肝细胞中的甘氨酸净流入线粒体（表​（表4）。4). 如果我们消除mSHMT反应，细胞溶质和线粒体甘氨酸会略有减少，但从细胞溶质到线粒体的净流量仍然存在。另一方面，如果mSHMT正常，我们将外部甘氨酸设置为零，胞浆和线粒体中甘氨酸的浓度下降到正常值的四分之一左右，但不为零。此外，线粒体成为甘氨酸向胞浆的净输出者（表​（表4）。4). 这是因为mSHMT从丝氨酸到甘氨酸的反应速度增加了10倍。但是，如果消除了mSHMT和外部甘氨酸设置为零，然后甘氨酸浓度下降到其正常值的近十分之一，线粒体的甲酸盐生成量减半。因此，mSHMT和外源甘氨酸的清除对细胞显然非常有害。有趣的是，甘氨酸从细胞质到线粒体的净流量仍然存在。如果将甘氨酸重新添加到外部介质中，则细胞几乎正常（表​（表44).

D.GDC反应

为了研究GDC反应的贡献，我们在模型中将其速度设置为零，并计算新稳态下浓度和通量的百分比变化（图​（图4）。4). 由于GDC反应被关闭，5,10-CH的浓度₂-线粒体中的THF急剧下降，这降低了通过MTD、MTCH和FTS反应的流量。因此，线粒体中产生的甲酸盐要少得多，因此甲酸盐输出到胞浆的速率下降到原来值的50%左右。由于甲酸盐供应减少，细胞溶质10f-THF的浓度下降。这有两个影响。首先，产生的嘌呤更少，其次，10f-THF到5,10-CH的净通量₂-THF反向，使净通量为5,10-CH₂-THF至10f-THF。这会降低5,10-CH的细胞溶质浓度₂-THF，导致胸苷合成下降。它还使5mTHF浓度下降，导致同型半胱氨酸浓度升高。[5mTHF]的下降释放了GNMT的抑制作用，从而降低[SAM]。

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图4

消除GDC反应时，选定代谢物的稳态浓度和选定反应的稳态速度的变化。

E.消除线粒体双功能酶

线粒体双功能酶在胚胎发育和转化细胞中是活跃的[17,24]但成人肝脏中没有。我们通过设置V_最大值线粒体MTD和MTCH反应为零。线粒体和细胞溶质单碳代谢的显著变化如图所示​图5。5线粒体GDC反应稍微减慢，mSHMT在丝氨酸生成方向上急剧逆转。线粒体产生的甲酸盐减少到零。因此，线粒体已经从甲酸工厂转变为丝氨酸工厂。

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图5

消除线粒体双功能酶的作用。A： 当双功能酶活性时选择的反应速度。B： 消除双功能酶时的反应速度。反应速度用红色数字表示，单位为μM/h。

在胞浆中，胸腺嘧啶和嘌呤的合成明显减少，cMTD和cMTCH反应逆转，现在强烈地朝5,10-CH方向运行₂-THF至10f-THF。丝氨酸在糖异生中的输出大于从血液中进入细胞的丝氨酸输入（当存在双功能酶时则相反）。因此，当存在双功能酶时（我们称之为正常情况），线粒体叶酸代谢为胞浆生成甲酸盐，用于嘌呤和嘧啶的合成和甲基化反应。当双功能酶不存在时，线粒体叶酸代谢为胞浆产生丝氨酸，而整体叶酸代谢为糖异生产生丝氨酸的净生产者。

F.消除线粒体

通过完全消除线粒体叶酸反应（将所有速度设置为零），我们检查了线粒体叶酸循环对整体单碳代谢的重要性。细胞溶质单碳代谢的显著变化如图所示​图6：。6线粒体现在根本没有甲酸盐供应，因此胸苷酸合成和嘌呤合成的速率大大降低。细胞溶质SHMT的速率增加约18倍，细胞溶质MTD和MTCH反应反向，现在从5,10-CH开始₂-THF至10f-THF（未显示）。5,10-CH的胞浆浓度₂-THF下降，导致5mTHF浓度下降，进而导致同型半胱氨酸升高。蛋氨酸和SAM的浓度受影响不大。有趣的是，线粒体叶酸代谢的消除并没有完全破坏细胞内叶酸代谢；事实上，唯一的主要影响是对胸苷酸和嘌呤合成速率的影响，而蛋氨酸循环的行为（包括DNMT反应）在很大程度上不受影响。这与线粒体叶酸代谢的主要作用是以甲酸盐的形式向胞浆提供额外的1-碳单位的假设相一致[16,17,24].

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图6

当线粒体反应从模型中消除时，选定代谢物的稳态浓度和选定反应的稳态反应速度的变化。