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美国国家科学院院刊。2003年8月5日；100(16): 9366–9370.
2003年7月16日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1233635100
预防性维修识别码：项目经理170924
PMID：12867591

血管需要血清反应因子辅激活剂心肌蛋白平滑肌发育

李世杰,*† 王大志,*†‡§ 王志高,* 詹姆斯·理查德森,*和埃里克·N·奥尔森*§
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

血管系统的形成需要分化和模式化内皮和平滑肌细胞（SMC）。尽管受到了很多关注重点研究血管内皮网络的发展、机制控制血管平滑肌细胞发育的机制尚不清楚。Myocardin是一个血清平滑肌和心肌特异性转录辅激活物反应因子，一种普遍存在的与平滑肌有关的转录因子基因表达。当肌钙蛋白在非肌肉细胞中体外表达时，可以通过血清反应诱导平滑肌分化因素。在这里我们报道了小鼠胚胎心肌蛋白纯合功能丧失突变在胚胎第10.5天死亡，没有证据表明血管平滑肌细胞分化。肌卡蛋白是唯一已知的转录因子对于血管平滑肌细胞的分化是必要和充分的。

心血管系统是第一个形成和发挥功能的器官系统在胚胎发生期间。血管的发育始于组织内皮细胞进入原始血管丛，逐渐变为重塑以最终形成复杂的血管网络(1). 平滑肌细胞（SMC）被招募到内皮血管系统并将其包裹支持和收缩血管系统。几种肽生长因子及其酪氨酸激酶受体已被证明发挥关键作用内皮血管系统的组装和模式化以及内皮细胞的募集SMC。相比之下，很少有人知道与此相关的转录事件用于血管平滑肌细胞的开发体内.

血管平滑肌细胞来源于多种胚胎祖细胞，包括外侧中胚层、颅间质和神经嵴(2,三). SMC的区别在于由细胞外信号触发，并伴随着转录平滑肌（SM）基因阵列的激活，其产物赋予独特的收缩、形态和结构特性它们来自其他类型的肌肉细胞。mcm1，无糖，缺陷，血清反应因子（SRF）盒转录因子在SM中起关键作用基因激活。SRF与一个称为CArG盒的DNA序列结合，即迄今为止分析的几乎所有SM基因的表达都需要(4–10).SRF对SM基因表达的重要性也由发现显性负性SRF突变体可以阻断SM在心外膜外植体培养(11). 然而，SRF的作用在SM开发中体内被SRF的事实蒙蔽了基因敲除小鼠在原肠胚形成期间因缺乏中胚层而死亡血管发育开始(12). 此外，因为SRF在整个胚胎中表达，它本身不能解释这种特异性SM基因转录。因此，有人建议SRF控制SM通过招募细胞类型特异性辅因子来获得基因。事实上，转录本培养细胞中SRF的活性可以通过其与阳性和阴性辅因子以及通过细胞外信号传导，但存在很少或没有直接证据表明这些类型的SRF控制SM基因的机制体内(13).

SAP域转录辅激活子，心肌蛋白，是一种特别强大的SRF辅因子在光滑和心肌细胞(14).肌卡蛋白通过其选择性激活平滑肌和心肌促进剂与SRF的互动。一个显性负性心肌梗死突变体的表达爪蟾胚胎阻碍心脏形成，表明心肌蛋白与SRF合作激活心脏基因表达(14). 有趣的是，当在非肌肉细胞中表达在体外，肌钙蛋白激活平稳，但非心肌基因表达(15–18).两种心肌相关转录因子（MRTF）也与SRF相关但在胚胎发生期间表达的模式比心肌蛋白(19).

为了确定心肌蛋白在胚胎发生过程中的功能，我们以老鼠心肌素基因同源重组。我们在这里展示缺乏心肌蛋白的小鼠在胚胎第（E）10.5天完全死亡血管平滑肌细胞缺失。相反，心脏发育在肌球蛋白突变胚胎。肌球蛋白突变小鼠的无血管表型，结合先前的研究表明，心肌蛋白可以激活SM基因在非肌肉细胞中的表达(15–18),证明心肌蛋白是SM发育的主要调节因子SMC差异化的充分必要性。

方法

Myocardin突变小鼠的产生。基因结构心肌素已描述(19). A类心肌素-通过构建靶向载体来删除外显子8和9使用pN-Z-TK2载体，其中包含一个核LacZ公司(nLacZ公司)磁带和新霉素耐药性基因位于RNA聚合酶II启动子和两种单纯疱疹病毒的控制胸苷激酶(TK公司)基因盒（R。西雅图华盛顿大学Palmiter）。基因组DNA侧翼心肌素从小鼠129SvEv中扩增出第8和第9外显子基因组DNA文库（Stratagene）并作为靶向载体插入分别是短臂和长臂。靶向载体被电穿孔129个SvEv衍生ES细胞，用G-418和FIAU。400个ES细胞克隆被分离出来并通过同源重组的Southern杂交。三个克隆被中断心肌素基因被注射到3.5天的小鼠C57BL/6囊胚中，并将产生的嵌合体雄性小鼠培育为C57BL/6雌性小鼠，以实现突变等位基因的生殖系传播。

逆转录聚合酶链反应。用TRIzol试剂从组织中纯化总RNA（Invitrogen）根据制造商的说明。对于RT-PCR，总计RNA被用作逆转录酶和随机六聚体的模板引物。可根据要求提供引物序列。

免疫染色和组织学。全贴装染色血小板内皮细胞粘附分子（PECAM）和SMα-肌动蛋白使用抗鼠PECAM mAb MEC13.3（Pharmigen）和SM执行α-肌动蛋白抗体（克隆1A4，Sigma），如所述(20). 组织学胚胎固定在4%多聚甲醛中，切片并加工在里面原地使用标准程序进行杂交(21).

SM22-lacZ转基因小鼠。lacZ转基因胚胎的染色按照描述执行表达式(22). SM22-lacZ转基因包含与lacZ连接的1343-bp SM22启动子(22). 转基因是通过杂交引入心肌蛋白突变背景合适的小鼠品系。

结果

Myocardin敲除小鼠的产生。确定在小鼠发育过程中，我们通过有针对性地破坏心肌素基因。蛋白质编码区鼠标的心肌素该基因包含13个外显子，跨度≈93kb基因组DNA的(图。1A类). 外显子8和9编码基本结构域，谷氨酰胺域和SAP域的一部分(19)，被替换为无启动子lacZ基因和一个新霉素耐药基因(图1A类). 基本的与SRF相互作用需要富含谷氨酰胺的结构域。删除这些结构域消除了心肌蛋白的所有肌源性活性(14,18). 因此，这种突变使基因失活。

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心肌蛋白突变小鼠的产生。(A类)目标战略。同源重组导致外显子8和9的缺失和插入lacZ和新肌球蛋白抵抗盒。5′和用于Southern分析的3′探针B类如图所示。内含子编码区域内的结点由下面的箭头表示图解蛋白质。外显子显示在方框中，内含子的大小为表明。(B类)Southern杂交分析。ES细胞基因组DNA从尾部活检中分离克隆并用Southern blot分析消化后的5′和3′探针生态意大利。这个显示了WT和突变带的位置。(C类)心肌病分析RT-PCR转录本。从WT和心肌蛋白突变体的心脏中分离出RNAE9.5的胚胎，用不同的引物对其进行RT-PCR分析显示在每个面板的左侧。基因型显示在顶部。示意图带有引物位置的外显子（E）如右图所示。成绩单检测GAPDH作为RNA负载和完整性的对照。在靶向等位基因第7外显子与第10外显子拼接。(天)分离出RNAE9.5时WT和心肌蛋白突变胚胎的心脏，并对其进行分析通过RT-PCR检测心肌蛋白、MRTF-A和MRTF-B转录物。

将靶向载体电穿孔至129SV/Ev ES细胞并靶向通过基因组DNA的Southern blot分析鉴定克隆(图1B类). 胚胎干细胞靶向杂合子心肌素基因被注入C57BL/6囊胚产生嵌合小鼠，嵌合小鼠传播突变通过生殖系的等位基因。

突变小鼠杂合子心肌素等位基因是活的，可育，表型正常。杂合子后代的基因分型等基因129背景或129/C57BL/6混合遗传的杂交背景产生WT和心肌蛋白+/–小鼠比例约为1:2，但没有心肌素–/–小鼠，指示纯合子突变导致胚胎死亡。分析定时交配胚胎的基因型显示孟德尔比率高达E10.5但在以后的发育时间点没有活的纯合突变体。

为了确认基因靶向事件，我们对mRNA进行了RT-PCR分析从WT心脏和E9.5突变胚胎中，使用代表基因缺失区及其周围的外显子序列(图1C类). 这些分析显示心肌素被替换为这个LacZ-Neo公司和预期一样，这种突变导致了在目标等位基因的选择性剪接中，外显子7被剪接第10外显子。RT-PCR序列分析进一步证实了这一点产品。由于这种选择性剪接，lacZ基因不是在突变小鼠中表达（数据未显示）。值得注意的是，被截断的转录本由突变等位基因产生的表达水平远低于WT心肌蛋白转录本，可能是因为突变的不稳定性成绩单(图。1C类).

因为心肌蛋白与MRTF-A和MRTF-B，也可以作为SRF辅因子(19)，我们分析了他们的E9.5胚胎心脏RNA的RT-PCR表达。如所示图1天，两者都是在WT和突变心脏中很容易检测到转录物，但两者都没有在缺乏心肌蛋白的情况下上调。

肌卡蛋白突变胚胎中致命的血管异常。分析肌钙蛋白–/–获得的胚胎从定时交配中发现E8.0之前没有异常，大多数胚胎似乎在E8.5之前发展正常（数据未显示）。然而，纯合子突变胚胎在E9.5可以通过其苍白的卵黄囊很容易识别，缺少血管(图。2澳大利亚–d日). 纯合子突变胚胎在E9.5表现出生长迟缓和发育迟缓。总量突变胚胎心脏形态正常向右循环和正常腔室形成。

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(A类)心肌蛋白突变胚胎的血管异常。显示的是野生型和突变体卵黄囊以及E9.5和E10.5的胚胎。在电子和（f），将卵黄囊从图中所示的胚胎中取出c（c）和d日. (B类)WT和突变株的苏木精/伊红切片E9.5时的胚胎。(下部)区域的高放大率背主动脉，箭头表示。

E9.5突变胚胎横切面的组织学分析证实心房和心室的外观正常，但显示严重的血管缺损，其中背主动脉清晰可见欠发达的(图。2B类). 然而，前主静脉似乎正常在这个阶段的突变胚胎中。值得注意的是，SM标记基因不是但在WT胚胎的主静脉中激活，而分化的SMC在这个阶段出现在背主动脉。到E10.5，突变胚胎发育严重延迟，常有心包积液，提示心血管功能不全(图2A e公司和（f）).

正常内皮细胞的分化和组织肌卡蛋白–/– 胚胎。血管发育在小鼠E7.5左右开始内皮祖细胞的分化和迁移(1–三).为了可视化胚胎血管系统，我们进行了全山抗体染色PECAM-1，一种内皮标记物(23). E8.5时，PECAM染色在WT和心肌病中，新形成的血管系统无法区分突变胚胎（数据未显示）。在E9.5，分化内皮细胞尽管突变胚胎开始发育在这个阶段显示生长迟缓(图3A类和B类). 值得注意的是，颅骨的复杂性和图案血管系统、体间血管系统和背主动脉PECAM-1染色在WT和心肌蛋白突变胚胎中表现相似。横切面清楚显示PECAM-1阳性WT和突变株背主动脉和主静脉中的内皮细胞胚胎，尽管突变胚胎的背主动脉比正常胚胎小(图3C类–F类). 同样，PECAM染色在WT和心肌蛋白突变的心脏心内膜层检测到胚胎。这些发现表明血管内皮细胞分化和组织不受心肌素突变。

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PECAM染色检测到的内皮细胞模式在心肌蛋白突变胚胎。(A类和B类)WT和心肌蛋白突变E9.5胚胎进行PECAM染色。箭头指向背主动脉。(C类–F类)胚胎组织切片染色佩卡姆(C类和E类，重量；天和F类,心肌素–/–).E类和F类显示背主动脉区域的高倍放大，用箭头表示。cv，主脉；da，背主动脉；h、 心脏；nt（奈特），神经管。

血管平滑肌细胞分化缺陷肌卡蛋白–/– 胚胎。确定心肌中是否存在血管异常SMC分化缺陷导致的突变胚胎，我们将E9.5染色具有SMα-肌动蛋白抗体的胚胎。如所示图4A类，山猫α-肌动蛋白阳性SMC存在于背主动脉和主动脉WT胚胎的静脉。然而，没有这种SMα-肌动蛋白阳性细胞在血管系统中检测到心肌素–/–胚胎。比较SMα-肌动蛋白染色胚胎的横切面显示SMCs从主动脉背侧失踪心肌素–/–胚胎(图4A类).然而，出乎意料的是，SM的表达没有减少肌球蛋白中的α-肌动蛋白–/–红心。

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心肌蛋白突变胚胎中SM标记缺乏表达。(A类)在E9.5对WT和心肌蛋白突变胚胎进行SMα-肌动蛋白染色。这个箭头指向背主动脉。(B类)平滑度和心肌转录物就地E9.5胚胎杂交部分。银色颗粒显示为假红色。箭头指向背主动脉。

我们通过以下方法进一步检测了SM基因的表达就地E9.5胚胎切片杂交(图4B类). 这个SM22型和性虐待α-肌动蛋白基因是直接靶点肌钙蛋白在转染成纤维细胞中诱导SRF和的基因(5–7,14,18). 两者的成绩单基因在WT胚胎的心脏和发育中的血管系统中表达(图4B类). 在相反，在心肌素–/–尽管是胚胎在突变胚胎的心脏中检测到正常表达。心房利钠素(ANF公司)基因，心脏特异性靶点肌钙蛋白在突变胚胎中也正常表达。这些发现证明血管平滑肌细胞分化在心肌素–/–胚胎，这是血管异常和胚胎致死的可能原因。

SM22-lacZ在肌卡蛋白–/– 胚胎。这个SM22型启动程序包含两个CArG框在E9.5时需要在平滑肌、心肌和骨骼肌细胞中表达以及心肌蛋白对启动子的反式激活在体外(4,5,14). 发现内源性的SM22型基因在心脏中表达心肌素–/–胚胎培养了这个启动子区域是否受心肌蛋白/SRF调节的问题在里面活泼地或者另一个监管区域是否能够维持的表达式SM22型在变异胚胎的心脏。因此，我们将SM22-lacZ转基因导入心肌蛋白突变背景育种到相应的转基因品系。如所示图5，SM22-lacZ表达在纯合子突变胚胎的背主动脉中被特异性切除，但不是在心脏或体节中，证实了肌卡丁是必需的专门用于血管SM基因表达。

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心肌蛋白突变胚胎中SM22-lacZ SM表达的消融。(A类和B类)WT和心肌素–/–突变胚胎携带SM22-lacZ转基因的人在E9.5处进行lacZ表达染色。箭头指向背主动脉。(C类–F类)章节WT和突变胚胎A类和B类复染浅曙红(C类和E类，重量；天和F类,心肌素–/–).E类和F类显示低放大倍数以包括心脏。箭头指向背主动脉。

讨论

心肌蛋白突变小鼠的表型揭示了心肌蛋白在血管平滑肌细胞分化中的作用。这些发现与以前的研究证明了心肌蛋白诱导SM基因的能力非肌肉细胞中的表达(15–18)确定心肌蛋白是已知的唯一两种转录因子SM区分的必要性和充分性。

肌卡蛋白在SM发育中的作用。SRF已报告给通过招募其他几种基因在转染试验中激活SM基因联合因子。例如，同源结构域蛋白Mhox和两个富含A/T的DNA结合蛋白被称为MRFα和β作为SRF靶基因的SM-限制性激活剂(24,25). GATA6的组合富含半胱氨酸的LIM-only蛋白家族的LIM域蛋白也具有据报道，SM基因在转染细胞，明显通过增强SRF DNA结合(26). 然而，它仍然存在不清楚这些所谓的SRF辅因子中哪些（如果有的话）对SM至关重要基因表达体内或者在SRF辅因子，SM基因不需要单一辅因子激活。

心肌蛋白突变胚胎血管发育异常包括对SMC高度特异，在缺乏相关心脏时发生异常，这与许多其他小鼠突变体形成对比，其中血管死亡继发于心脏功能障碍。SM的完整块心肌蛋白的研究进展–/–胚胎表明，肌钙蛋白是SM的基本激活剂差异化程序体内没有其他因素可以尽管有大量报道称转录因子可与SRF协同刺激SM基因表达在体外这些发现还表明，单靠SRF是无法做到的激活SM靶基因体内没有招募肌钙蛋白。

肌球蛋白和心脏基因表达。基于缺少心脏基因表达爪蟾表达a的胚胎显性负性心肌病突变体和心肌病激活能力转染检测中的心脏基因启动子(14)，我们预计小鼠心脏发育需要肌钙蛋白。然而，我们没有检测到心脏形态发生或基因表达的异常肌球蛋白突变胚胎。甚至心肌炎的直接靶基因，如SM22、SMα-肌动蛋白、和ANF公司表达了通常在心脏。

如何解释这些发现？我们支持MRTF-A的可能性或-B，在发育中的心脏中表达(19)，或其他心脏病转录因子，可能在早期阶段替代心肌蛋白，以及SM血统中缺乏这种冗余。值得注意的是早期的心脏管类似血管，表达许多SM基因，这些基因是后来下调了监管。我们认为肌钙蛋白控制早期肌肉平滑肌和心肌谱系共享的调节程序心肌细胞具有额外的肌生成调节因子，可以改变这种情况程序。将心肌蛋白突变与MRTF基因突变相结合或其他心脏转录因子应进一步阐明其潜力心肌蛋白在心脏发育中的作用。

致谢

我们感谢David Sutcliffe的组织学研究、Alisha Tizenor和Stephen Johnson图形方面的协助，Jennifer Page的编辑协助，以及Rhonda Bassel-Duby对论文发表评论。E.N.O得到了拨款的支持来自美国国立卫生研究院、唐纳德·雷诺兹基金会和麦高文基金会。D.-Z.W.得到了肌肉营养不良的支持协会和北卡罗来纳大学的启动基金。

笔记

缩写：SM，平滑肌；SMC、SM电池；PECAM，血小板内皮细胞细胞粘附分子；E类n个，胚胎期n个; SRF、血清响应因子；MRTF，心肌相关转录因子。

工具书类

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