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《美国病理学杂志》。2006年9月；169(3): 861–876.
数字对象标识：10.2353/ajpath.2006.050767
预防性维修识别码：项目经理1698820
PMID：16936262

血清素（5-HT）在肝星形细胞功能和肝纤维化中的作用

理查德·鲁德尔,*† 菲奥娜·奥克利,* 齐亚法特·侯赛因,* 艾琳·杨,* 莱斯利·J·布莱恩·卢卡,‡ 格兰特·拉姆,†和德里克·曼恩*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肝星状细胞（HSC）是肝创伤愈合和纤维化的关键细胞成分。有新的证据表明，HSC的成纤维功能可能受到神经化学和神经营养因子的影响。本研究探讨了5-羟色胺（5-HT）系统影响HSC生物学的可能性。大鼠和人HSC表达5-HT1B年，5-羟色胺1楼5-羟色胺2安培5-羟色胺2B型和5-HT7受体，表达5-HT1B年5-羟色胺2安培和5-HT2B型在HSC激活时被诱导。5-HT的诱导2安培和5-HT2B型分别是静止细胞的106±39倍和52±8.5倍。5-羟色胺2B型与病鼠肝脏纤维化组织密切相关。5-HT治疗HSC2拮抗剂抑制增殖并提高细胞凋亡率；相比之下，5-HT对神经生长因子诱导的细胞凋亡具有保护作用。5-HT与血小板衍生生长因子协同刺激HSC增殖增加。HSC表达功能性5-羟色胺转运体，参与5-HT的主动摄取和释放。我们得出结论，HSC表达5-HT系统的关键调节成分，使其能够储存和释放5-HT，并以促纤维生成的方式对神经递质作出反应。选择性靶向5-HT类受体的拮抗剂可以用作抗纤维化药物。

肝星状细胞（HSC）被认为是肝纤维化进展的关键介质之一。1–3在正常健康的肝脏中，HSC的功能是调节窦性血流和大分子在Diss空间的运输，同时也作为维生素a的储存库。作为对肝损伤的反应，HSC在一个被称为“激活”的过程中，在功能和表型方面发生了大体形态变化，向肌纤维母细胞样细胞转化。1–3肌纤维母细胞样激活的HSC（aHSC）的特征是平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）的表达、胶原蛋白的生成增强、金属蛋白酶组织抑制剂-1的表达以及维生素A储备的丢失。此外，激活后，正常静止的HSC进入细胞周期，并对自分泌和旁分泌刺激物作出反应，在受损的肝脏中增殖产生大量促纤维化细胞。由于aHSC表型相对抗凋亡，部分原因是金属蛋白酶组织抑制剂-1的抗凋亡作用及其高基础核因子-κB活性，4,5在慢性损伤的肝脏中，aHSC有持续存在的倾向。这导致交联胶原蛋白的过度沉积，导致肝脏细胞外基质（ECM）的定性和定量改变。6如果ECM重塑过程继续，那么肝脏就会变得纤维化，最终发展为肝硬化，伴随着威胁生命的正常肝脏生理障碍。目前，人们对提高我们对HSC增殖和凋亡是如何调控的理解非常感兴趣，因为体内已知这些过程的实验操作可以减弱纤维形成过程。5,7–9特别是，有一种动力在aHSC上发现新的表面受体，这种受体能够减弱增殖和/或凋亡，以响应特定配体。

几种有丝分裂原促进aHSC的增殖，包括血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和结缔组织生长因子（CTGF）。7,10,11在这些因素中，PDGF是最有效的有丝分裂原。肝损伤期间，肝PDGF水平升高，HSC激活伴随着PDGF受体的表面表达。12通过PDGF受体阻断PDGF信号传导可抑制aHSC的增殖并减轻实验诱导的肝纤维化。7已对介导PDGF刺激aHSC增殖的信号事件进行了研究，并涉及多种途径，包括导致磷脂酶Cγ、磷脂酰肌醇3-激酶和ERK1/2活化的途径。13最近，由于aHSC凋亡过程的刺激，该过程受到了广泛关注体内加快大鼠肝纤维化的恢复速度。5,8与aHSC凋亡调控相关的表面受体包括p75低亲和力神经生长因子（NGF）受体、转化生长因子（TGF）-β和肿瘤坏死因子-α受体、αV（V）β三整合素、N-钙粘蛋白、大麻素受体2、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和Fas受体。14–18然而，仍然需要确定能够对特定药理激动剂/拮抗剂产生反应的aHSC的新型表面受体，因为这些受体将为抗纤维化药物的开发提供快速途径。

血清素（5-羟色胺[5-HT]）是一种生物胺，通过七个主要受体家族（5-HT）发挥其生物活性1至5-HT7).195-HT2受体家族包括三个成员，5-HT2安培，5-羟色胺2B型和5-HT2摄氏度，通过G耦合q个蛋白质转化为磷脂酶C和磷脂酶A2.205-HT2受体亚型是临床上用作抗精神病药、抗抑郁药和抗组胺药的大量药物的靶点。21, 225-羟色胺与异常细胞增殖和纤维化疾病有关，但迄今为止，还没有关于5-HT在肝纤维化中的作用的文献。然而，对肾系膜细胞（在表型和功能上与HSC相似）的研究表明，血清素具有促有丝分裂作用，并通过激活5-HT刺激TGF-β1和CTGF的产生2安培受体和ERK1/2。23,24因此，有必要对5-HT系统在aHSC功能和肝纤维化调节中的作用进行研究。

在本研究中，我们报道了功能性5-HT受体在人类上的表达(在体外)和老鼠(在体外和就地)并证明5-HT受体拮抗剂可减弱aHSC的增殖并增强其凋亡特性。我们通过显示5-HT与PDGF协同作用以刺激增殖来定义5-HT在肝脏中的成纤维作用。此外，我们还证明了培养激活的HSC表达5-羟色胺转运体（SERT）并能将5-HT释放到培养基中。因此，我们首次描述了5-HT影响aHSC增殖和凋亡的自分泌途径，并证明选择性5-HT受体家族拮抗剂可能具有抗纤维化的潜力。

材料和方法

细胞分离

如前所述，通过用蛋白酶和胶原酶连续灌注，从正常雄性Sprague-Dawley大鼠（400±50 g）的肝脏中分离出大鼠HSC。8将HSC接种到塑料上，在Dulbecco改良的Eagle’s培养基（马里兰州Rockville的Life Technologies公司）中培养，补充16%胎牛血清（FCS；Life Technonics公司），并在5%CO的湿润环境中保持在37°C2如前所述，人类HSC是从结肠转移疾病切除的正常人类肝脏边缘提取的。8人类HSC在原代培养中激活后或第四代之前用于实验。使用人体肝组织进行科学研究得到了英国西南部地方研究伦理委员会的批准，并须征得患者同意。如前所述，维持COS-7细胞。25

十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳

通过在150 mmol/L NaCl、1%（v/v）Triton X-100、0.1%（w/v）SDS、2mmol/L乙二胺四乙酸和10mmol/L Na中溶解磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤培养物制备全细胞蛋白提取物2高性能操作4然后通过9%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量（20μg）的全细胞蛋白。如前所述，凝胶在100V恒定电压下运行1.5小时，然后转移到硝化纤维素上。在阻断非特异性蛋白结合后，用含有3%漫威的一级抗体（稀释在PBS/Tween 20[0.05%]中）培养印迹1小时。识别5-HT的小鼠单克隆抗体2安培和5-HT2B型受体（BD Biosciences Pharmingen，新泽西州富兰克林湖）以1:1000的稀释度使用。然后用PBS/Tween 20清洗印迹四次，然后用兔抗鼠辣根过氧化物酶抗体（1:1000）孵育1小时，然后在PBS/Tween 20中进行广泛清洗，然后处理到蒸馏水中，使用ECL系统检测抗原（英国白金汉郡Amersham Pharmacia Biotech）。

从HSC中提取RNA

根据制造商的说明，在使用RNeasy迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）分离总RNA之前，先用冰镇PBS将次级流入（80-90%）的大鼠和人HSC清洗三次，然后放在冰上。然后在37°C下，用1μl RQ1 RNase-freed DNase I（1U/μl；Promega，Madison，WI）每1μg总RNA处理总RNA 1小时，以确保完全去除所有DNA污染。通过添加含有20 mmol/L EGTA（pH 8.0）的停止缓冲液终止酶消化。然后通过分光光度法在260nm处估计总RNA浓度。

逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）

以一定的时间间隔从接受培养激活和第2代人类HSC（如上所述）的HSC中提取500毫微克总RNA，使用随机六聚体引物（oligo（dN））生成第一链cDNA6). 使用在每个特定基因编码区内选择的特定寡核苷酸引物，对大鼠和人类5-HT受体、SERT碱性转录因子3（BTF3）和β-肌动蛋白cDNA进行PCR扩增。请参阅表1了解引物序列、最佳退火温度和PCR产物大小的确切细节。半定量PCR反应由1μl cDNA、100 ng正反义寡核苷酸引物和12.5μl含有50个单位/ml的2×PCR主混合（Promega）组成塔克DNA聚合酶、400μmol/L dATP、400μmol/L dGTP、400μol/L dCTP、400µmol/L dTTP和3 mmol/L MgCl2最终体积为25μl。在94°C下初始培养5分钟后，在每个引物对指定的温度下使用1分钟退火步骤进行PCR，然后在72°C下进行1分钟伸长步骤，在94°C.下进行1 min变性步骤。进行半定量PCR分析时，最多进行40个PCR循环，然后在72°C下进行5分钟的最终延伸反应。PCR产物通过1%醋酸三钠缓冲琼脂糖凝胶在50V下电泳1小时后分离，并使用溴化乙锭染色进行检测。通过参考1-kb DNA梯形图（Promega）验证特定PCR产物的预期大小。实时PCR分析反应包括1μl cDNA、1μmol/l正反义寡核苷酸引物和7.5μl SYBR Green PCR Master Mix（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司），最终反应体积为15μl。在95°C下初始培养10分钟后，使用以下反应条件：95°C持续20秒，寡核苷酸对的最佳退火温度（参考表1)持续20秒，然后在72°C下持续20秒。最多进行40个PCR周期，之后，使用以下条件对PCR产生的DNA进行熔融分析：通过每一步升高1°C将温度从60°C升高到99°C，第一步保持20秒，其余步骤保持4秒，然后测量样品荧光。使用Corbett Research（NSW，Sydney，Australia）的RG-3000进行PCR。

表1

PCR反应中使用的寡核苷酸的详细信息

目标基因底漆顺序退火温度（°C）产品尺寸（bp）
大鼠5-HT1安培正向5′-GGGCAGTGAGGCAGGGTGAC-3′59.2122
反向5′-GGCGGGCATAGGAGTTAGAT-3′
大鼠5-HT1B年正向5′-CACGGTGGGGCTTTATTTAC-3′56110
反向5′-TGCCGTCTTGTTGGGTGTTCT-3′
大鼠5-HT一维前进5′-AGCCCGAGAAAGGAAGCCACTA-3′5597
反向5′-GGGGAGGACCAAGACCAACAA-3′
大鼠5-HT1楼正向5′-AGTCGAGTATGCCAGAGAGGA-3′53.692
反向5′-GAGGAGCACGGAGATGAACAC-3′
大鼠5-HT2安培前进5′-TACGCAGGCCCGAAGGAGAT-3′55.598
反向5′-GGGCACCATTACAAAACAGG-3′
大鼠5-HT2B型正向5′-TTTTGGGTCACTGGCTGTTTTT-3′55.3132
反向5′-AGTCCCACCGTGTTAGGCTTGAG-3′
大鼠5-HT2摄氏度正向5′-CACACCGAGGAACTGCTAATA-3′55.1141
反向5′-TCTGGGACGCTTTTTCTTCTT-3′
大鼠5-HT三前进5′-GATAGCCCTCTTCCACAC-3′55.9125
反向5′-AACGAGTCCCTTGCCACCTC-3′
大鼠5-HT4前进5′-CAGGCAGCTCAGAAAAAAAACC-3′54.9149
反向5′-TCCGGACCAGCAAAACATCTC-3′
大鼠5-羟色胺5A级正向5′-GGTCAGTCGAGGCGAGCCTTCTA-3′55.9104
反向5′-TCGCAGCTTTGTAAATCTTCCAGTA-3′
大鼠5-HT第5页正向5′-TGGCGGGAGCAGAGAGAGAA-3′57.7165
反向5′-TGAATAGCCAAGCAGAATA-3′
大鼠5-HT6正向5′-GCTGGCTCGGCACGAACT-3′59.1160
反向5′-GCGGGCAGCCAGAAGGAT-3′
大鼠5-HT7正向5′-CGTGCGCCGGAGTGTC-3′55.4124
反向5′-CCCGCTTTGAAGATGGATGTT-3′
大鼠SERT前进5′-CACAGCGGAGAGGCGAGC-3′60.2673
反向5′-GGAGGCGATGTAAAAGGCGAT-3′
人类5-HT2安培正向5′-ACCACAGCCGCTCAACTCCA-3′57.2471
反向5′-AAGGCACCACATCACCACAAA-3′
人类5-HT2B型正向5′-GGCCCTCCCACTCTGTTCTAT-3′55.3413
反向5′-GGCGTGAGGTGTTT-3′
人体5-HT2摄氏度正向5′-TGTGCCCGTCTGGATTTCTTTAG-3′58.1487
反向5′-TCGCGTGCGTTCTGGTCT-3′
BTF3型正向5′-TGGCAGCAAAACACCTTC-CACC-3′55.4124
反向5′-AGCTTCAGCAGTCTCAAAC-3′
CTGF公司正向5′-AGCGCCTGTTCTAAGACCTGTG-3′56154
反向5′-TTTTGCCCTTCTTAATGTTTTCCTC-3′

细胞凋亡的量化

通过在10 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.4）中用1μg/ml吖啶橙（Sigma）溶液染色，观察凋亡HSC。使用FITC过滤器在×20放大倍数的重复孔中计数五个随机场中的凋亡细胞，在四个独立实验中计数细胞。使用caspACE 3（DEVDase）比色法测定Caspase 3活性，并按照制造商（Promega）的说明进行计算。

测量[三H] 血清素摄取

七天培养激活的大鼠HSC或COS-7细胞，用脂质体转染大鼠SERT cDNA（如前所述25)分别在6孔板和12孔板中播种。HSC放置24小时，然后放置在低血清培养基（0.01%）中过夜。然后用温热的PBS（37°C）清洗HSC两次，并用5-羟基[G-三H] 在含有120 mmol/L NaCl、5 mmol/L-KCl、1.2 mmol/L-CaCl的介质中的硫酸色氨酸肌酐（10至20 Ci/mmol；Amersham）2，1.2 mmol/L硫酸镁4，5.6 mmol/L葡萄糖，4 mmol/L-Tris-HCl，6.25 mmol/L-HEPES和0.5 mmol/L/抗坏血酸，pH 7.4（吸收缓冲液）。转染后将COS-7细胞保留48小时，然后与5-羟基[G-三H] 在吸收缓冲液中稀释的色氨酸-硫酸肌酐。在这些条件下，大鼠HSC和COS-7细胞的摄取在至少10分钟内呈线性。因此，在37°C（总摄取）和4°C（非特异性摄取）下进行5分钟的分析。在培养期结束时，取出培养基，用吸收缓冲液清洗细胞三次。然后通过添加200μl 0.2 N NaOH对细胞进行裂解，并通过液体闪烁光谱法对裂解产物的放射性进行计数。摄取量表示为[三H] 每10次吸收5-HT6每分钟个单元格。

HSC生长培养基中5-HT浓度的测定

第7天培养物激活的大鼠HSC用含有0%FCS的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）洗涤两次，并在实验开始前在含有0%FCS的DMEM中孵育16小时。在每个实验开始时，再次将生长培养基更换为含有齐美利定（10μmol/L）的DMEM，然后在细胞应用后的10分钟和360分钟收获。根据制造商的说明，使用酶联免疫吸附试验（ELISA；德国汉堡IBL）测定5-HT浓度。

细胞增殖的测定

通过两种方法之一测定细胞增殖。在这两种分析中，在含有16%FCS的培养基中培养7至10天激活的大鼠HSC以10的密度接种在96周板中4每个孔的细胞数。然后将细胞放置24小时，然后用Hanks缓冲盐水溶液/）清洗细胞，并用含有0.01%FCS和50 mmol/L HEPES的DMEM替换生长培养基16小时。然后，在添加溴脱氧尿苷（BrdU）之前，按照每个图的图例所示对细胞进行2小时的处理，并在根据制造商的说明确定BrdU掺入之前将细胞放置14小时（加利福尼亚州圣地亚哥市癌基因研究产品公司）。另一种用于测定细胞增殖的方法是CellTiter96 AQ尤斯一种含有[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2的溶液试剂（Promega）H（H）-四氮唑，内盐：MTS]。除细胞在每孔加入20μl CellTiter96 AQ之前处理24小时外，细胞处理方式与上述相同尤斯一种溶液试剂。然后在37°C下将细胞再培养2小时，然后在490 nm处读取每个微孔的吸光度。

四氯化碳（CCl4)肝损伤模型

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200至225 g）服用CCl4（CCL4/橄榄油，1:1[v/v]）1 ml/kg体重，每周两次腹腔注射，持续4周。最后一次CCl后三天4注射，动物被一氧化碳杀死2窒息后，取肝脏进行免疫组化分析。

5-羟色胺2安培受体和5-HT2B型受体免疫染色

载玻片在二甲苯中脱蜡并在酒精中脱水，抗原回收通过在柠檬盐水中微波15分钟来实现。通过过氧化氢预处理15分钟阻断内源性过氧化物酶活性，然后使用avadin/生物素阻断试剂盒（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）进一步阻断，每段3滴，持续20分钟，每个阶段之间使用Tris缓冲盐水（TBS）冲洗。将载玻片与完整培养基孵育20分钟，然后添加小鼠单克隆5-HT2安培受体和5-HT2B型受体抗体（BD Biosciences Pharmingen）分别在TBS中稀释1:80和1:160，涂在载玻片上，并在4°C下培养过夜。在TBS中清洗载玻片，然后在抗体孵育之间用TBS清洗液孵育次级和抗IgG辣根过氧化物酶结合三级抗体20分钟（Vector Laboratories）。5-羟色胺2安培受体和5-HT2B型受体阳性细胞通过3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物（DAB）染色可见。将载玻片用迈尔苏木精复染30秒，脱水，在二甲苯中清除，然后装入DPX中。

结果

大鼠和人HSC表达5-HT2家族受体

为了确定大鼠HSC表达哪些5-HT受体，我们最初进行了实时RT-PCR，以检测培养物激活（直到第10天）大鼠HSC（aHSCs）中的转录物。发现大鼠HSC表达许多5-HT受体的mRNA，包括5-HT1B年受体，在HSC激活期间诱导（图1A）和5-HT1楼受体，其表达水平一致（图1B），而5-HT的mRNA7受体在分离后2天表达显著下降（图1C）.5-HT的成绩单2年和5-HT2B型HSC激活诱导受体（图1、D和E）其余大鼠5-HT受体亚型（1A、1D、2C、3、4、5A、5B和6）低于检测水平（数据未显示）。结果被归一化为公认的看家基因BTF3，我们手中的BTF3在培养激活后HSC表达没有变化（结果未显示）。5-HT的表达2安培和5-HT2B型免疫印迹进一步证实了受体的存在。首先，我们参考HSC活化的经典标记物的表达，确认了新分离和活化HSC的表型状态（图1F）正如预期的那样，新分离的大鼠HSC表达无法检测到的α-SMA水平和低水平结蛋白，而aHSC表达高水平的这两种蛋白。5-HT含量丰富2安培和5-HT2B型在活化的大鼠HSC中检测到蛋白质；相比之下，新分离的大鼠HSC表达低水平的5-HT2安培，而5-HT的表达2B型无法检测到。我们还确定人类aHSC表达5-HT2安培和5-HT2B型转录物和蛋白质（图2），但正如用大鼠aHSC观察到的那样，人HSC缺乏可检测的5-HT表达2摄氏度（未显示数据）。为了确认功能性5-HT受体的表面表达，将aHSC与4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑（NBD）-氨基己酰氨基苯乙二硫醚（NBD-spiperone）孵育，后者是5-HT的荧光类似物1/2受体选择性拮抗剂spiperone。如所示图1G，培养物中的所有细胞在其表面都用荧光spiperone标记，而用未标记的spiperone进行预培养可以抑制这种现象（图1G）.

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大鼠HSC中5-HT受体亚型表达的检测。A类–电子邮箱：在塑料培养皿上培养1至6天后，在常规24小时内对从大鼠HSC中分离的总mRNA进行实时RT-PCR分析。使用针对大鼠5-HT受体个别亚型的引物启动PCR反应（参见表1用于列表）。5-HT受体表达水平归一化为BTF3的表达水平，发现BTF3在HSC激活时没有显著变化。结果显示，所有受体亚型均在检测限内；未检测到缺失的受体。所有PCR反应的效率均≥95%，扩增DNA的熔融分析表明，在每个反应中都会产生单个DNA物种（结果未显示）。蛋白质印迹分析(F类)还对从第1天和第10天大鼠HSC中提取的20μg全细胞蛋白进行了研究。一旦转移到硝化纤维素膜上，用β-肌动蛋白、α-SMA、结蛋白、5-HT的特异性抗体检测这些蛋白质2安培和5-HT2B型受体。可见条带的近似分子量是根据与全细胞蛋白同时运行的预处理蛋白标记来估算的。传真：从大鼠胃底提取的全细胞蛋白用作5-HT阳性对照2B型受体。德国：5-羟色胺2使用荧光标记的spiperone衍生物（10μmol/L NBD-spiperone）观察受体/配体相互作用（图1），并在大鼠HSC与NBD-spiperone和未标记的10μmol/L spiperon孵育时显示结合特异性（图2）。这里显示的结果代表了来自至少三个单独细胞制剂的三个独立实验。

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5-HT的RT-PCR和Western blotting检测2人类HSC中的受体表达。答：对第3代人HSC分离的总mRNA进行RT-PCR分析。人类5-HT特异性引物2安培（2A）和5-HT2B型（2B）受体用于启动PCR反应。PCR反应在预定的周期数（不超过40个）后终止。对照如下：在试验条件下同时运行水替代cDNA（车道W），使用β-actin引物进行40个周期的PCR(B类)其中cDNA被mRNA取代（阴性对照），阳性对照使用20个PCR分析周期检测β-actin基因表达。每个扩增片段的大致大小是从1kb的DNA梯形图中估计的。蛋白质印迹分析(C类)还对从第3代人HSC中提取的20μg全细胞蛋白进行了检测。一旦转移到硝化纤维素膜上，用α-SMA、结蛋白、5-HT特异性抗体检测这些蛋白质2安培和5-HT2B型受体。可见条带的近似分子量是根据与全细胞蛋白同时运行的预处理蛋白标记来估算的。这里显示的结果代表了来自至少三个单独细胞制剂的三个独立实验。

5-HT选择性拮抗剂2受体诱导aHSC凋亡和抑制增殖

接下来我们研究了表面5-HT的可能性2受体影响aHSC的两个关键表型特征、凋亡指数和增殖。我们初步确定了5-HT的能力2受体选择性拮抗剂通过手工计数吖啶橙染色细胞诱导凋亡，如前所述。4大鼠aHSC与斯匹珀龙、LY53857和甲硫氨酸孵育后，以剂量依赖性方式诱导凋亡aHSC数量增加（图3，A和B）。如所示图3C每种拮抗剂的最佳剂量在暴露3小时后诱导细胞凋亡率（从基线水平）升高。作为细胞凋亡的生化测量，我们使用caspase 3活性测定。Spiperone能够在aHSC中诱导caspase 3活性，其水平与使用强促凋亡真菌代谢物-胶质毒素处理的细胞中测得的水平相似（图3D）将aHSC与spiperone和5-HT孵育，可部分但显著阻断凋亡，表明spiperone通过5-HT受体相关机制诱导凋亡。5-HT还抑制NGF（100 ng/ml）诱导的HSC凋亡，测试了所有三种浓度的5-HT（1、10和50μmol/L），并分别显著抑制NGF诱导的凋亡64.8%、70.5%和76.1%（图3E）.

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5-HT诱导大鼠HSC凋亡2受体特异性拮抗剂。答：用10μmol/L斯匹珀龙处理24小时后，用吖啶橙（1μg/ml）观察到核凝聚和碎裂（如图所示白色箭头).B类：用指定的化合物处理细胞（已知所有化合物都能结合5-HT的成员2受体家族）。然后对浓缩和破碎的细胞核进行计数，结果用可见细胞核总数的百分比表示。导致部分最佳核凝结的指示化合物的浓度(B类)然后与大鼠HSC孵育不同的时间段，如图所示(C类). 再次，计算浓缩核和碎片核，并将其表示为可见核总数的百分比。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的比活性(D类)然后，在不存在或存在10μmol/L 5-HT、Z-VAD-FMK caspase 3抑制剂（50μmol/L）和胶质毒素（1.5μmol/L，3小时）的情况下，用斯匹珀龙（100μmol/L.24小时）进行aHSC治疗后评估。还研究了5-HT抑制NGF诱导的HSC凋亡的能力(E类). 在应用100 ng/ml NGF 6小时之前，用各种5-HT浓度预培养细胞30分钟。然后评估核浓缩和碎裂（由吖啶橙识别），并将其表示为可见细胞核总数的百分比。这里显示的结果代表了来自三种不同细胞制剂的三个独立实验，在核浓缩和分裂的情况下，数据是从每个数据点的每个处理的三个不同的视角生成的。★/★★ 表示SD值(P（P）< 0.05/0.01).

5-HT的影响2通过不同剂量拮抗剂处理的aHSC培养物上的BrdU掺入法测定大鼠aHSC增殖的受体信号。甲硫平、斯匹珀龙和利坦司林（图4，A–C）分别在2.31、1.03和6.31μmol/L剂量下观察到对aHSC增殖的强大的剂量依赖性抑制，抑制率为50%。LY53857的效果较差，但在44.2μmol/L的剂量下仍能实现50%的增殖抑制（图4D）.由于目前我们无法解释的原因，酮糖醇对5-HT具有选择性2安培和5-HT2摄氏度受体，没有作用（图4E）但值得注意的是，WAY100635对5-HT具有特异性1安培aHSC上未检测到受体，对aHSC增殖无影响（图4F）IC摘要50与每个5-HT拮抗剂相关的BrdU掺入抑制值，见表2鉴于拮抗剂对5-HT具有选择性2受体家族抑制aHSC增殖，5-HT可能刺激增殖。然而，我们一再未能观察到5-HT对大鼠aHSC的任何刺激作用（图5A）因此，我们探讨了5-HT与其他HSC生长因子（如PDGF）协同作用的可能性。如所示图5B和表3培养基中添加10μmol/L 5-HT显著增强PDGF-BB对aHSC增殖的刺激作用。还发现，用固定剂量的PDGF-BB（20 ng/ml）补充HSC生长培养基，并将5-HT 100 nmol/L的浓度增加到100μmol/L，也可以增加细胞增殖（图5C）相反，5-HT对IGF-1刺激的增殖没有影响（表3）虽然5-HT（高达100μmol/L）单独对增殖率没有影响，但在HSC与不同浓度的5-HT孵育3小时后，观察到CTGF的细胞水平显著增加（对照组的328%）（图5D）.

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5-羟色胺的作用2激活大鼠HSC增殖的拮抗剂。培养激活的大鼠HSC（第10天或更大）在DMEM加上0.1%胎牛血清和50 mmol/L HEPES中培养24小时，然后与各种5-HT受体拮抗剂马来酸甲硫肝素孵育(A类)，斯皮珀龙(B类)，利坦司林(C类)，LY53857(D类)、酮糖醇(E类)和WAY100635(F类)以指示的浓度。在向细胞培养基中添加BrdU之前，细胞处理2小时，16小时后测定BrdU掺入的程度。数据是相对于控制值表示的，并以三份单独实验的平均值±SEM表示。

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大鼠活化HSC中5-HT增殖和CTGF基因表达的影响。培养激活的大鼠HSC（第10天或更长时间）在DMEM加0.1%胎牛血清和50mmol/L HEPES中培养24小时，然后与5-HT孵育(A类)或PDGF-BB(B类)（±10μmol/L 5-HT）。在向细胞培养基中添加BrdU之前，细胞处理2小时，16小时后测定BrdU掺入的程度。抄送：使用单一次最大浓度的PDGF-BB（20 ng/ml），还测试了5-HT对PDGF-BB-刺激增殖作用的剂量依赖性。细胞被剥夺血清16小时，然后用5-HT（指定浓度）处理细胞30分钟。然后将PDGF-BB（10 ng/ml）引入培养基中继续23.5小时。24小时后，向每个孔中添加20μl MTS四氮唑试剂，2小时后读取吸光度。此处的结果针对PDGF-BB单独引起的490nm处吸光度的变化进行了校正。在提取RNA和合成第一链cDNA之前，还将缺乏血清的活化HSC与不同浓度的5-HT孵育3小时。5-HT孵育后监测CTGF RNA表达的变化(D类)采用实时PCR SYBR绿色技术。所有实验的数据均表示为相对于对照值的数据，并以三份单独实验的平均值±SEM表示。★ 表示SD值(P（P）< 0.05).

表2

集成电路505-HT值2拮抗剂对大鼠活化HSC中BrdU掺入的抑制作用

敌手斯皮珀龙甲硫平利坦司林LY53857号酮糖醇道路100635
集成电路50（μmol/L）1.03 ± 0.292.31 ± 0.286.31 ± 0.1544.2 ± 0.56——

培养激活的大鼠HSC（第10天或更大）在DMEM加0.1%胎牛血清和50 mmol/L HEPES中培养24小时，然后与各种5-HT受体拮抗剂孵育。在向细胞培养基中添加BrdU之前，细胞处理2小时，16小时后测定BrdU掺入的程度。数据表示为与对照组（仅生长培养基）±SEM相比，抑制BrdU掺入50%所需的拮抗剂浓度，用于三次单独的实验。 

表3

欧盟委员会50大鼠活化HSC中PDGF-BB±5-HT和IGF-1±5-HT刺激的BrdU掺入值

兴奋剂5-羟色胺PDGF BB公司血小板衍生生长因子BB+5-HTIGF-1型IGF-1+5-HT型
欧盟委员会50（纳克/毫升）—12.7 ± 0.096.3 ± 0.15*106 ± 89102 ± 130

培养激活的大鼠HSC（第10天或更大）在DMEM加0.1%胎牛血清和50 mmol/L HEPES中培养24小时，然后在指定浓度下与5-HT或PDGF-BB（±10μmol/L 5-HT）孵育。在向细胞培养基中添加BrdU之前，细胞处理2小时，16小时后测定BrdU掺入的程度。数据表示为刺激BrdU掺入所需的PDGF-BB/IGF-1±5-HT浓度，相对于最大BrdU参入±SEM，该浓度为三个单独的实验（一式三份）的50%。 

*PDGF-BB处理细胞的SD值(P（P）< 0.05). 

HSC表达SERT，并能通过质膜主动转运血清素

我们观察到5-HT拮抗剂能够影响HSC的凋亡和增殖，这表明除了表达5-HT受体的aHSC外，它们还可能能够摄取和释放5-HT。RT-PCR和免疫印迹分析表明，大鼠HSC表达SERT，这似乎在很大程度上诱导了培养激活（图6，A–C）为了评估aHSC摄取5-HT的能力，我们将培养激活的大鼠HSC与[三H] 在细胞裂解和细胞内定量之前，在4°C（非特异性转运）或37°C（主动转运）条件下维持10分钟的5-羟色胺[三H] 血清素。表4显示活化的大鼠HSC（细胞内[三H] 37°C下的血清素；细胞内的[三H] 血清素（4°C）V（V）最大值343.7±50.3 pmol/1×106单元格/分钟和K（K）米值为302.9±18.4 nmol/L。将这些数据与使用相同方法从瞬时转染大鼠SERT的COS-7细胞（缺乏天然SERT的细胞）收集的数据进行比较，结果表明类似K（K）米值，均在300和400 nmol/L之间。然而，瞬时转染的COS-7确实显示略微升高V（V）最大值这表明COS-7细胞中SERT的表达水平较高。接下来，我们确定aHSC是否主动释放5-HT。将大鼠aHSC培养在含有齐美利定的无血清培养基中，齐美利丁可通过SERT阻断5-HT的再摄取。然后在将细胞交换到含齐美定的培养基中后的10分钟和360分钟收集培养基，并通过ELISA和参考标准曲线（未显示）测定培养基中的5-HT浓度。在两个时间点的培养基中均检测到5-HT升高，分别在10分钟和360分钟时测得11.5和9 ng/ml（图7）结合5-HT摄取数据，这些结果表明aHSC能够通过SERT在细胞内和细胞外隔室之间主动循环5-HT。

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大鼠HSC中5-羟色胺转运体的表达和功能。答：对第1天（d1）和第10天（d10）培养激活的大鼠HSC分离的总mRNA进行RT-PCR分析。使用大鼠SERT特异性引物启动PCR反应。PCR反应在预定的周期数（不超过40个）后终止。对照如下：在试验条件下同时运行水替代cDNA（车道W），使用β-actin引物进行40个周期的PCR(B类)其中cDNA被mRNA取代（阴性对照），阳性对照使用20个PCR分析周期检测β-actin基因表达。每个扩增片段的大致大小是根据1kb DNA梯状图估算的。抄送：对从d1和d10大鼠HSC中提取的20μg全细胞蛋白进行Western blotting分析。一旦转移到硝化纤维素膜上，用针对大鼠SERT的兔多克隆抗体来探测这些蛋白质。可见条带的近似分子量是根据与全细胞蛋白同时运行的预处理蛋白标记来估算的。这里显示的结果代表了来自至少三种分离的细胞制剂的三个独立实验。

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ELISA法定量测定大鼠HSC培养基中的5-HT。用含有0%FCS的DMEM清洗培养激活的大鼠HSC两次，并在含有0%FCS DMEM中培养过夜。再次将生长培养基更换为含有齐美定（10μmol/L）的DMEM，用于阻止大鼠HSC对5-羟色胺的摄取。然后在指定时间收获培养基，通过ELISA测定5-HT浓度。数据是两个重复实验的代表。

表4

吸纳[三H] 大鼠aHSC和COS-7细胞瞬时表达大鼠SERT的5-HT

单元格V（V）最大值（pmol/1×106单元格/分钟）K（K）米（毫摩尔/升）
活化大鼠HSC343.7 ± 50.3302.9 ± 18.4
COS-7公司604.6 ± 35.09373.1 ± 32.17

第10天，瞬时表达大鼠SERT的大鼠HSC和COS-7细胞与[三H] 5-羟色胺在4°C（非特异性转运）或37°C（主动转运）下持续5分钟。在细胞溶解之前，用冰镇PBS清洗细胞三次[三H] 定量摄入血清素。非特异性转运从总活性转运中减去，得出特异性转运[三H] 血清素转运V（V）最大值（pmol/1[倍]106单元格/分钟）和K（K）米（nmol/L）这里显示的结果代表了来自至少三种不同细胞制剂的至少三个独立实验。 

5-羟色胺2B型受体是纤维化大鼠肝aHSC的选择性标记物

确定5-HT是否2受体也在纤维化肝脏中表达，我们对5-HT进行了免疫组织化学染色2安培和5-HT2B型每周两次腹腔注射CCl造成大鼠肝脏损伤8周4或橄榄油（对照）。5-HT染色2安培在未损伤的肝脏中，表现出微弱的弥漫性表达，在整个损伤肝脏中强度增加（但再次以弥漫方式增加）（图8A）相比之下，5-HT2B型在对照肝中基本上没有表达，但在与纤维化带相关的细长细胞中选择性诱导。组织切片的高倍分析也显示5-HT的肝细胞染色较弱2B型 （图8B）根据这些数据，我们建议5-HT2B型受体是纤维化大鼠肝脏aHSC的选择性标记物。

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5-HT的表达2安培和5-HT2B型在8周CCl中4-诱导大鼠肝纤维化。每周两次注射CCl的大鼠的肝脏4持续8周。然后用PBS中的多聚甲醛固定分离的肝脏24小时。然后使用5-HT特异性抗体对至少三个大鼠对照肝脏（仅橄榄油）和三个纤维化肝脏的切片进行免疫组织学分析2安培(A类)和5-HT2B型(B类)受体。在这两种情况下，面板1表示在纤维化大鼠肝脏中观察到的染色，面板2表示当5-HT特异性抗体出现时，在纤维化大鼠肝中观察到染色2安培或5-HT2B型实验方案中没有受体。面板3表示在对照肝切片中观察到的染色（无纤维化），面板4表示5-HT阳性对照组织（大鼠胃）2安培或5-HT2B型受体。面板5（5-HT2B型仅受体）代表5-HT的高倍图像2B型在纤维化大鼠肝脏中观察到受体染色。红箭表示阳性染色的HSC；黄色箭头表示染色的肝细胞。

讨论

在慢性肝病中，胶原蛋白生成激活的HSC持续存在和增殖的细胞机制正在被详细揭示。这些研究的一个关键目标是鉴定aHSC表型和寿命的分子调控因子，以便为减轻纤维化过程的治疗药物的设计提供信息。在本研究中，我们发现aHSC可以通过表达SERT和5-HT受体家族成员而摄取、释放5-HT并对其作出反应。此外，我们还证明了aHSC对PDGF-BB和5-HT共刺激的反应增强了增殖，对5-HT的反应增加了CTGF转录，以及特异性5-HT2受体拮抗剂抑制增殖并刺激HSC凋亡。因为5-HT2受体拮抗剂已经在进行临床试验，用于治疗一系列疾病，包括雷诺现象，26各种心理障碍，如抑郁症和焦虑症，27和红细胞增多症，28我们的研究提出了这种药物也可能用于治疗肝病的可能性。

5-HT和5-HT2特别是受体与几种纤维化疾病的病因有关，包括腹膜后纤维化、类癌性心脏病、肺动脉高压和主动脉瓣疾病29,30; 然而，到目前为止，还没有报告表明5-HT在患病肝脏中具有促纤维化作用。然而，几项研究暗示了5-HT在正常和纤维化肝脏中的作用。在正常肝脏中，5-HT受体家族的几个成员在包括肝细胞（5-HT）在内的多种细胞中表达2)、胆管细胞（5-HT1安培和5-HT1B年)和窦内皮细胞（5-HT2). 在这些不同类型的细胞中，已知5-HT受体调节细胞增殖、胆道树生长和局部血流。31–33肝硬化患者的非结合（活性）血浆5-HT水平显著升高，相反，肝硬化患者的5-HT代谢产物5-羟基吲哚乙酸水平显著降低。34Marasini等人提供的数据35和Laffi等人36还发现，血清素水平受肝损伤的影响；更具体地说，观察到血小板内血清素浓度下降，这被认为是肝硬化患者出血倾向的原因。35,36CCl公司4-自发性高血压大鼠和Wistar-Kyoto大鼠诱发的肝硬化与弥漫性5-羟色胺颗粒有关，在纤维化基质中发现大量肥大细胞（5-HT的来源），表明5-羟色素颗粒和肥大细胞参与了肝损伤反应的某些阶段。37,38这些研究表明，5-HT在肝纤维化的进展中确实发挥着重要作用。然而，尚不清楚5-HT稳态的改变是肝纤维化进展的驱动力，还是纤维化的结果。以前对HSC以外的细胞类型的研究已经证明5-HT的能力2受体家族调节细胞外基质和纤维生成关键调节因子的表达。例如，5-HT2受体积极调节IGF-1、IV型胶原、TGF-β1和MMP1的表达39–43负调控I型胶原、层粘连蛋白β1+β2、纤维连接蛋白和III型胶原的表达。41这些观察结果与我们对5-HT表达的证明相结合2HSC表面的受体使我们研究了这类5-HT受体作为HSC表型调节器的潜力。

大鼠和人HSC的培养激活导致5-HT的表达稳定增加2安培和5-HT2B型受体。这些受体在激发5-HT效应方面具有功能性，包括促进细胞增殖、防止NGF诱导的凋亡和增强CTGF基因表达。单用5-HT孵育的aHSC未显示BrdU掺入水平升高。然而，与单独用PDGF-BB培养的细胞相比，用PDGF-BB和5-HT培养的aHSC同时显示出较高的增殖水平。Eto等人也进行了类似的观察，44他证明了5-HT和PDGF-BB孵育对5-HT的累积效应2安培与5-HT或PDGF-BB单独作用相比，系膜细胞表达受体。5-羟色胺2B型受体还被证明与PDGF受体相关的信号级联相互作用，通过ERK1/2导致细胞周期进展。45在这里介绍的实验中，为什么在缺乏PDGF-BB的情况下，5-HT不能增强HSC增殖的原因尚不清楚。一种可能的解释是，aHSC相对较高的增殖率和较高的内源性丝裂原活化蛋白激酶活性水平（R.G.Ruddell，未发表的观察结果）可能掩盖了5-HT在分裂速度较慢的细胞中所引发的促有丝分裂作用。与其增强PDGF-BB诱导增殖的能力相反，5-HT不能改变HSC对有丝分裂原IGF-1的反应性。已知IGF-1通过IGF-1受体发出信号，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶激活来增强HSC增殖，这有助于ERK1/2和Ras的激活。46因为5-HT2受体能够与其他受体酪氨酸激酶（如PDGF受体）相关的信号通路相互作用，理论上5-HT可能上调HSC对IGF-1的反应性。然而，我们的数据表明，至少对于aHSC而言，5-HT和受体酪氨酸激酶途径之间的串扰具有选择性，因此5-HT可以与PDGF-BB协同作用，但不能与IGF-1协同作用。就其本身而言，5-HT也能够以剂量依赖的方式改变CTGF的mRNA水平。Hahn等人曾在系膜细胞中证明了这一现象24并被证明由5-HT介导2安培受体和百日咳毒素不敏感的G蛋白。激活的HSC中是否也存在这种情况尚待阐明。

5-HT的细胞外水平及其生理功能由血清素转运体调节。在Na之后+/氯−-依赖性摄取过程是完全的，内化的5-羟色胺要么被单胺氧化酶降解，要么重新包装成囊泡，直到释放回细胞外环境。正常人和小鼠肝脏不表达SERT mRNA或蛋白。47,48在这里，我们表明培养激活的HSC确实表达功能性SERT，并且我们的数据与之前关于SERT对5-HT的相对亲和力的研究一致，之前克隆的大鼠SERT具有几乎相同的亲和力K（K）米320 nmol/L的值49至本研究报告的数值（302.9±18.4 nmol/L）。SERT在活化的HSC上的表达和功能的原因尚有待推测，但我们的数据提供了进一步的证据，表明HSC是5-HT的作用位点。SERT的表达似乎至少部分受到各种应激相关因素的调节，包括缺氧和生长因子的释放，即碱性成纤维细胞生长因子。50,51在系膜细胞上，SERT被认为对5-HT对肾小球的有害影响起保护作用，5-HT的增殖和纤维生成作用被5-HT清除和随后的降解所抵消。52相反，缺氧性肺动脉平滑肌细胞中SERT的表达被认为使肺动脉平滑肌细胞对5-HT的促有丝分裂作用敏感。50需要进一步研究以确定SERT在肝纤维化中的作用；然而，SERT可能发挥抗增殖作用（类似于系膜细胞中的作用），这可能部分解释了5-HT对HSC增殖的有限作用。对HSC培养基中5-HT浓度的分析表明，在缺乏5-HT外源性的情况下，即使完全去除血清，HSC培养液中仍含有大量细胞外5-HT。这种5-HT的来源是否为HSC，或者HSC是否已将早期培养基中的5-HT内化并储存，尚待确定。然而，HSC储存和释放5-HT的能力的后果是相当大的，因为实际上细胞会有一种自我维持的5-羟色胺能/有丝分裂原刺激。这也解释了为什么5-HT2受体拮抗剂能够影响HSC的增殖和凋亡。超出本研究范围的未来研究需要解决一个重要问题，即HSC除了能够运输和应对5-HT外，是否还能够合成或浓缩5-HT。

就我们发现5-HT获得的治疗潜力而言2aHSC上的受体表达，最相关的发现是5-HT2-特异性拮抗剂将促进aHSC凋亡。利坦司林、斯匹珀龙、LY53857和甲硫肝素对HSC增殖的影响是剂量依赖性的，具有抗增殖IC50值在低微摩尔范围内。此外，发现斯匹珀龙诱导的细胞凋亡程度与用于促进HSC凋亡的胶质毒素诱导的凋亡程度相当体内促进大鼠纤维化的恢复。8鉴于各种5-HT受体调节增殖的能力已得到充分证明，31,32,44相比之下，它们作为细胞凋亡调节器的功能还不太明确。Choi等人的研究53展示5-HT的作用2B型受体在小鼠胚胎发育的关键阶段具有拮抗作用，导致头区、心脏和神经管的凋亡和异常肉瘤组织。同一组的进一步研究表明，血清素能够通过共同激活Akt和ERK 1/2信号通路，保护心肌细胞免受血清剥夺引发的凋亡。54我们目前无法确定5-HT2-特异性拮抗剂通过5-HT诱导细胞凋亡2安培5-HT2B型受体，或者就此而言，通过本文所示的由aHSC表达的任何其他亚型。此外，我们没有关于这些受体可能通过哪些信号通路传递凋亡信号或这些通路的下游靶点的信息。然而，我们的发现增加了5-HT受体拮抗剂作为未来肝病治疗药物的潜力。最近的研究表明，肝纤维化的恢复与aHSC的凋亡有关，并表明可以选择性诱导HSC凋亡的药物可能具有作为治疗药物的潜力。5,8不幸的是，目前可用的5-HT2就配体结合所有5-HT的能力而言，受体拮抗剂相对来说是非特异性的2受体家族成员。因此，我们不能正式排除本研究中使用的拮抗剂可能至少部分通过多种5-HT和非5-HT受体（如D2受体）介导其对HSC功能的影响的可能性。更特异的5-HT的进化2安培和5-HT2B型受体配体可以确定每个受体在肝纤维化中的作用；然而，现有的药理学工具不允许这样做。值得注意的是，我们对就地5-HT的表达2安培和5-HT2B型受体表明后一受体可能是最有希望的靶点。尽管5-HT2安培相比之下，5-HT在正常和病变肝脏中的表达呈弥漫性2B型在健康肝脏中缺失，在纤维化肝脏中选择性地与aHSC相关。5-羟色胺2B型因此，受体是aHSC的新标记物和潜在的治疗靶点。

我们的数据证明了aHSC体内和在体外在人类和大鼠来源中，表达多种5-HT受体类型，尤其是5-HT2安培和5-HT2B型受体，反过来能够介导HSC增殖、转录和凋亡的变化。几种5-HT受体类型的表达也可能具有生理相关性，因为5-HT能够与所有人结合并通过所有人发出信号，导致5-HT触发的信号中间体之间的复杂相互作用。本研究中显示的5-HT对HSC功能的影响可能是由于多种受体类型所致。HSC也表达功能性SERT，并能在血清剥夺后将5-HT释放回培养基。这些发现都支持这样的结论，即5-HT可能在调节HSC响应性肝损伤的特征表型变化中发挥关键作用。随着越来越具体的5-HT的不断发展2安培和5-羟色胺2B型配体，每个受体在肝纤维化发展中的作用可能得到解答，最终导致开发新的治疗肝纤维化的药物。

致谢

我们感谢Hao Ngoc Nguyen在COS-7血清素摄取研究中提供的技术援助。

脚注

请向英国纽卡斯尔NE1 7RU纽卡斯尔大学临床医学院细胞医学研究所肝脏研究组Derek A.Mann教授发送转载请求。.ku.ca.lcn@nnam.kered：liam-E

由威康信托基金（拨款050443/Z/02和068524/Z/02/Z）、英国医学研究委员会（COG部分拨款G9900279）和澳大利亚国家卫生和医学研究委员会支持（向G.A.R.拨款339400）。

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文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会