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《美国病理学杂志》。2006年8月；169(2): 682–696.
数字对象标识：10.2353/ajpath.2006.051047
预防性维修识别码：项目经理1698802
PMID：16877366

雄激素受体对雄激素非依赖性CWR22前列腺癌细胞的细胞周期进展至关重要

鑫源,* 李童,* 王红云,* 张涛（Tao Zhang）,* 穆米塔·巴鲁阿,* 罗伯特·博尔盖西,* 格伦·巴布里,* 迈克尔·L·卢,†和史蒂文·巴尔克*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

雄激素剥夺治疗后复发的大多数前列腺癌（PCa）继续表达雄激素受体（AR）。为了研究AR在这些肿瘤中的功能重要性，我们在去势小鼠中获得了雄激素依赖性CWR22 PCa异种移植物，并从其中一种异种移植物中生成了细胞系（CWR22R3）。与患者的雄激素依赖性PCa类似，复发的异种移植物和细胞系表达AR，并且对比卡鲁胺治疗耐药。然而，AR的表达被调节PSA公司与复发的异种移植物相比，CWR22R3细胞系中的基因明显减少体内雄激素调节报告基因的转染进一步表明，细胞缺乏雄激素诱导的AR转录活性，尽管Erk/MAP激酶组分激活，但对低雄激素浓度不敏感。尽管如此，AR对雄激素依赖性生长仍然至关重要，因为逆转录病毒shRNA介导的AR下调导致显著的长期生长抑制。这与p27水平的增加有关基普1和视网膜母细胞瘤蛋白的低磷酸化，但与D型细胞周期蛋白水平或MAP激酶激活的降低无关。这些结果揭示了AR在雄激素依赖性PCa中的潜在关键功能，与之前描述的转录或非转录功能不同。

前列腺癌（PCa）最常见的表现为雄激素依赖性疾病，通过手术或药物去势（雄激素消除治疗）抑制雄激素受体（AR）活性可导致大多数患者的肿瘤退化和癌症相关症状缓解。1然而，最初对雄激素替代治疗有良好反应的患者最终复发为激素难治性或雄激素依赖性前列腺癌。重要的是，AR的高水平表达和雄激素调节基因（如前列腺特异性抗原）的重新表达(PSA公司)表明AR恢复其活性，并在疾病的这一阶段发挥重要作用。2,3一些雄激素消除治疗后复发的患者可能仍然对使用AR拮抗剂（如比卡鲁胺）或酮康唑（如抑制肾上腺残余雄激素生成的药物）进行二级激素治疗有反应，这表明肿瘤对手术或药物去势后残留的低水平雄激素有反应。4,5事实上，使用雄激素依赖性PCa细胞的研究表明，在雄激素减少的条件下长期生长可以选择AR被极低水平雄激素激活的细胞，并且下调这些细胞中AR的表达可以抑制其生长。6–11

可能介导PCa适应降低雄激素水平的机制包括AR扩增、AR突变、转录共激活蛋白表达增加以及其他信号转导途径的激活。以前的研究表明应收账mRNA高表达应收账该基因在雄激素依赖性PCa中频繁扩增，12,13AR表达增加在雄激素依赖性PCa的多种异种移植模型中是一致的发现。10雄激素非依赖性前列腺癌中AR突变的总体发生率较低，但确实发生的突变增强了AR对非雄激素类固醇激素和AR拮抗剂（如氟他胺和比卡鲁胺）的反应性。12,14–17此外，将氟他胺从AR拮抗剂转换为激动剂的AR突变主要发生在接受氟他胺和雄激素去激活联合治疗的患者中，这表明雄激素依赖性PCa中维持AR转录活性的选择性压力。16AR转录共激活蛋白（如类固醇受体共激活物（SRC）-1和-2）的表达增加可以增强AR活性，这在雄激素依赖性PCa中已有报道。18或者，激活细胞外信号调节激酶/有丝分裂原激活蛋白激酶（Erk/MAP激酶）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3激酶）信号转导途径（后者通过丢失第10号染色体PTEN上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）在晚期雄激素非依赖性前列腺癌中频繁发生，并可能增强AR共激活蛋白的活性。19–21

虽然目前的数据表明，在雄激素依赖型PCa中，多种机制可能会在低雄激素水平下增强AR转录活性，旨在进一步抑制AR活性的二级激素治疗的反应通常是部分的，尽管给药后雄激素水平和使用高剂量AR拮抗剂（如比卡鲁胺）治疗，大多数肿瘤仍在进展。4,22这些进行性雄激素依赖性肿瘤继续表达AR和AR调节基因，如PSA公司目前尚不清楚AR是否仍在疾病的这一阶段发挥关键作用，从而仍然是更有效治疗的有效靶点。为了评估AR在比卡鲁胺耐药、进行性雄激素依赖性PCa中的作用，我们检测了CWR22 PCa异种移植模型。23,24雄激素依赖型CWR22异种移植物最初对去势有反应，然后复发为雄激素依赖性肿瘤，这些肿瘤对高剂量比卡鲁胺治疗耐药，并保持AR和PSA表达水平与雄激素依赖的CWR22移植物相当。从复发的比卡鲁胺耐药异种移植物中建立细胞系（CWR22R3），并在类固醇激素缺乏培养基中长期繁殖。类似于其父母雄激素依赖性异种移植体内，该细胞系继续表达AR，并对比卡鲁胺耐药。然而，在没有添加配体的情况下，AR的表达会调节PSA公司基因明显低于异种移植物。雄激素反应元件（ARE）调控报告基因的瞬时转染进一步表明，CWR22R3细胞系中的AR缺乏雄激素依赖性转录活性，并且在低水平上对雄激素不敏感。尽管如此，AR下调导致标记G0/G公司1细胞周期阻滞，p27水平升高基普1和视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）的低磷酸化，但Erk-1和-2MAP激酶的组成型激活或D型细胞周期蛋白表达没有减少。这些结果表明雄激素依赖性PCa中AR的关键功能独立于其常规转录活性，并与以前报道的非转录功能不同。

材料和方法

质粒和抗体

AR、SRC-1、SRC-2、SRC-3、ARE的表达载体4-荧光素酶报告子、PSA-荧光素酶报告子和pGL3-启动子雷尼利亚荧光素酶控制载体（pGL3，pRL-CMV；Promega，Madison，WI）已在前面描述过。25,26抗体来自以下来源：Ber-EP4（DAKO，Carpindia，CA）、抗PSA（Biodesign，Saco，ME）、抗管蛋白（Sigma，St.Louis，MO）和抗AR（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY和Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru，CA）。其他抗体来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利），包括抗磷酸-Erk1和2（T202/Y204）、抗磷酸-Akt（S473）、抗Erk1和2、抗Akt、抗磷酸-pRb（S780）、抗p27基普1和抗PARP。次级抗鼠和抗兔抗体来自Promega。

CWR22异种移植物和细胞系

CWR22异种移植物由Tom Pretlow博士（俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学）慷慨提供。23,24,27CWR22异种移植物的细胞（～106)将50%基质胶（Becton Dickinson，Bedford，MA）植入雄性NCr裸鼠（Taconic，Germantown，NY）的侧翼，补充12.5mg持续释放的睾酮颗粒（Innovative Research of America，Sarasota，FL）。当肿瘤形成并达到最大尺寸1厘米时，对宿主小鼠进行去势，并去除睾酮丸。随后，对去势小鼠复发的肿瘤进行1 mg二甲基亚砜比卡鲁胺（阿斯利康，威明顿，DE）腹腔注射，每周三次，每次0.1 ml。定期通过逆行窦给小鼠放血，以评估血清PSA。去势前、比卡鲁胺治疗开始时或牺牲时获得的肿瘤切除活检，要么在−80°C下冷冻，要么固定在10%的福尔马林缓冲液中。

牺牲时，在麻醉下对肿瘤进行无菌切除，并将其切成约1毫米的碎片三磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。然后将组织旋转下来，并在37°C下用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（0.05%胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA；马里兰州罗克维尔的Life Technologies，Inc.）处理10分钟，并频繁搅拌。再次离心细胞悬液，并将其置于添加有10%胎牛血清（FBS）或10-20%木炭/右旋糖酐剥离FBS（甾体激素缺失）（CDS-FBS；Hyclone、Logan、UT）和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基中的10-cm组织培养皿上。来自最初异种移植物的肿瘤细胞在CDS培养基中生长更快；因此，所有后续培养都是在含有10-20%CDS-FBS的培养基上进行的。细胞大约每隔5-10天进行一次胰酶消化和传代。

采用差异胰蛋白酶法分离上皮肿瘤细胞和基质细胞。用胰蛋白酶/EDTA处理细胞1至5分钟，然后在显微镜下观察上皮细胞的分离，收集上皮细胞并重新移植。或者，将完全胰蛋白酶化的细胞放入培养基中，使基质细胞粘附在组织培养板上10至60分钟，从而耗尽基质细胞，此时回收粘附较少的上皮肿瘤细胞，并将其置于单独的培养皿中。用免疫磁珠进一步富集上皮细胞。用胰蛋白酶化细胞，并用磁性蛋白A珠与抗人上皮抗原（Ber-EP4）单克隆抗体（Dynabeads蛋白A；挪威奥斯陆Dynal）结合培养细胞。经过三轮清洗后，将附着在磁珠上的细胞重新放置在Dulbecco改良的Eagle’s培养基中，其中含有20%的CDS-FBS培养基。传代数代后，将培养物断奶至含有10%CDS-FBS的培养基。

细胞生长和PSA测量

为了进行细胞生长测量，将细胞置于96个培养皿中，并按照指示进行处理。按照制造商的建议，使用CellTiter 96水溶液细胞增殖试验（Promega）测量治疗结束时的活细胞；或者直接使用血细胞仪或Coulter Z1计数器（佛罗里达州迈阿密Coulter）对细胞进行计数。使用临床试剂盒（Hybridtech，San Diego，CA）通过酶联免疫吸附测定法测量异种移植动物血清中的PSA。

免疫印迹法

切除肿瘤异种移植物并在PBS中切成1 mm三用玻璃Dounce均质器均质，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L-NaCl，1.0%Nonide P-40，0.5%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠，1 mmol/LEDTA和1 mmol/L EGTA）中进行超声处理。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液直接裂解培养细胞。蛋白质含量通过Bradford分析测定（加州Hercules的Bio-Rad Laboratories，Inc.）。蛋白质在还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后通过电印迹转移到0.45μm硝化纤维素膜上。在PBS中用5%脱脂奶粉封闭膜，然后在含有0.2%吐温20（TBST）和5%牛奶的Tris缓冲盐水中以1:1000的稀释度用一级抗体进行检测。然后用TBST广泛清洗膜，并用1:2000稀释度的辣根过氧化物酶结合二级抗体在含有5%牛奶的TBST中进行检测。在TBST中进一步清洗后，使用ECL Western印迹检测系统（伊利诺伊州罗克福德Pierce Biotech）开发膜。ImageJ程序（Wayne Rasband，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）根据作者的指示，用于量化Western blots上感兴趣的蛋白质带密度。

免疫组织化学

将石蜡包埋组织块的5μm切片脱蜡、复水，并通过在50 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中高压保存20分钟进行抗原回收。冷却至室温后，使用10%的山羊血清和亲和素封闭溶液封闭组织切片（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）。然后添加初级抗体，并在4°C下培养过夜。抗磷标记抗体在1:100时使用，而抗AR抗体在1:50时使用。在PBS中进行四次洗涤后，使用生物素化山羊抗兔抗体在1:400时检测抗体，然后使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶在1:400检测抗体（Vector Laboratories）。载玻片用3,3′-二氨基联苯胺显影，并用苏木精复染。

免疫荧光

细胞生长在盖玻片上，并在室温下用5%多聚甲醛固定10分钟。细胞在PBS中清洗，并在含有1%Triton X-100（PBST）的PBS中渗透。然后将细胞与抗AR抗体（PBST中1:30）在室温下孵育45分钟。随后在PBST中清洗细胞三次，并在室温下用Alexa Fluor 488-结合的抗兔抗体（PBST中1:400；加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）再培养45分钟。然后洗涤细胞并安装盖玻片，并用尼康荧光显微镜（尼康公司，日本东京）检查。

荧光激活细胞分类

根据制造商的建议，对CWR22R3或LNCaP细胞进行胰蛋白酶化、固定，并使用BD-Cytofix/Cytoperm Plus/固定/渗透试剂盒进行渗透。细胞与抗Ber-EP4或抗AR抗体在1:50的冰上孵育30分钟。清洗后，用异硫氰酸荧光素-抗鼠抗体（1:100）在冰上标记细胞30分钟。清洗后，用流式细胞仪对细胞进行分析。

转染

转染前一天，将细胞以70-80%的密度置于24或48周的平板中。根据制造商的建议，用DNA和/或siRNA与Lipofectamine 2000（Invitrogen）的混合物转染细胞24小时。然后将细胞切换到含有各种处理试剂的新鲜培养基中再培养24小时，然后用被动裂解缓冲液进行裂解，并使用双荧光素酶测量系统（Promega）分析荧光素瘤酶活性。抗AR siRNA序列为AR siRNA（5′-AAAAGGUUCUGCUAGACGAC-3′）。其控制Mut-siRNA（5′-AAAG无人值守地面加州大学铜无人值守地面控制单元通用航空公司ACGAC-3′）与AR siRNA在三个相邻核苷酸对（粗体字母）之间的位置切换不同。将siRNA序列与GenBank中的序列进行比较，发现与人类AR以外的任何基因的同源性不超过76%。

实时逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）

使用RNeasy protect mini kit（加利福尼亚州巴伦西亚市齐亚根）从CWR22异种移植物或培养细胞中分离出总RNA。总RNA的数量由分光光度计测定，每个样品中100 ng总RNA用于通过TaqMan实时RT-PCR使用ABI Prism 7000（加利福尼亚州福斯特城ABI应用生物系统公司）测定特定RNA水平。人类PSA的引物序列为：5′-TCTCCATAGGAGCTACAGGCC-3′（正向）、5′-GGAG-GAGCTAGCACTTGC-3′（反向）和5′-TGC-ATCAGGGTGATCTAATTGGAAC-3′（探针）。制造商质量控制和验证的18S人rRNA和OAS1引物和探针购自ABI。将每个样品中靶mRNA的量标准化为其18S rRNA，并表示为参考样品的相对倍数差异（ABI推荐的相对定量方法）。

逆转录病毒介导的shRNA

使用了以下低聚物：5′-GATCCCCAGG-TTCTGTGAGACGACTTCAAGAGAGAGGAGAGTCGTCTAGCAG-AGAACCTTTTTT-3′（pSuper-1981意义），5′-AGCTA-AAAAA-GGTTCTCGCTAGAC-GACTCTCGAAGTCGTCAGAGAGAACCGG-3′（p Super-1981-反义），5’-GATCCCGGATATACATTAGAGAGAGAGCGAGAGAGTGAGTCGTGG-AGTCTAGAGAG-AGCTTTTTTTT-3'（pSuper-1774意义），5′-AGCTAAAAAGGAGATATATTTAGGG-GCTCTCTTGAGCCCCCTAAGTAATTGTCGGG-3′（pSuper-1774反义），5′-GATCCCCAGTCCTCTG-CTGAACGACTTCAAGAGTCGTTCAGCAAGGAC-ACTTTTT-3′（p Super-1981-mut sense），5’-AGCTAIA-AAGTGTCCTGCTGAACGCTTGAAGTCTT-CTGCGCGCGAGAGAGAGCTGACTGGTG-3’（pSuper-1981mut反义）。将相应的引物对（pSuper-1981、pSuper-1774或pSuper-1881mut）退火并连接成Bgl公司二-后面的III线性化pSuper-retro puro向量（Oligoengine，西雅图，华盛顿州）。DNA测序验证了插入的正确性。为了产生逆转录病毒，将pSuper载体与PCG-gagpol和PCG-VSV-G共同转染到两栖型Phoenix细胞（加州圣地亚哥Orbigen）中，并在转染后2至3天收集培养基。CWR22R3电池（2×106)被镀成10厘米2感染前一天的培养皿，然后通过与4μg/ml聚brene（Calbiochem，La Jolla，CA）混合的Phoenix细胞培养基培养，感染逆转录病毒。在感染后3至5天内，用2μg/ml嘌呤霉素筛选感染细胞，并进一步研究存活的感染细胞。

细胞周期分析

逆转录病毒感染后7天，细胞在PBS中冲洗，胰酶化，用PBS洗涤三次，并用95%乙醇在4°C下固定15分钟。然后在室温下用碘化丙啶和核糖核酸酶A处理细胞30分钟，然后用流式细胞仪进行分析。使用CellQuest Pro软件对结果进行分析。

结果

雄激素非依赖性和比卡鲁他胺耐药的CWR22异种移植物

为了建立进行性雄激素依赖性PCa模型，我们从CWR22开始，CWR22是一种人类雄激素依赖型PCa异种移植物，去势后会退化，并且可能在相对较长的间隔数月后复发，成为雄激素依赖肿瘤，继续表达AR和AR调节基因，如PSA公司.24,28在补充缓释睾酮微丸的雄性NCr裸鼠侧翼皮下建立雄激素依赖性CWR22 PCa异种移植物。当肿瘤直径达到~1厘米时，取出睾酮颗粒并阉割小鼠。与之前的结果一致，CWR22异种移植物在去势后退化，四只小鼠中有两只在去势之后的7个月内长期复发，肿瘤大小和血清PSA水平增加。

为了确定复发的CWR22异种移植物（CWR22R3和CWR22R2）是否会对进一步的直接AR阻断产生反应，用高剂量AR拮抗剂比卡鲁胺治疗荷瘤小鼠，比卡鲁酰胺对CWR22表达的H874Y突变AR有效。29使用的比卡鲁胺剂量（每周三次，每次腹腔注射1毫克）比患者使用的剂量（每天口服50毫克）大约50倍，并且根据睾丸完整的小鼠精囊快速退化的初步试验证实其有效（数据未显示）。根据肿瘤大小或肿瘤衍生血清PSA，在4周的治疗期内，两组小鼠均未出现退化，这表明复发的肿瘤对比卡鲁胺具有内在抗性。

对复发和比卡鲁胺治疗的CWR22肿瘤的蛋白提取物进行免疫印迹分析表明，它们表达AR和PSA，AR水平相对于双亲雄激素依赖性CWR22异种移植物有所降低（图1、A和B）.整个DNA测序应收账复发性肿瘤的mRNA编码区显示密码子874突变，与亲代CWR22异种移植物中的密码子突变相同30但没有发现任何额外的突变（数据未显示）。总的来说，这些结果表明，复发的CWR22肿瘤在AR和PSA的表达以及对AR拮抗剂的耐药性方面与雄激素依赖性PCa相似，这些PCa发生在雄激素剥夺治疗的初始反应后。

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CWR22异种移植物和细胞系的特性。答：Western blot分析比较复发和比卡鲁胺耐药的CWR22异种移植物（复发R3、R4）中AR和PSA蛋白水平与其雄激素依赖性对等物（雄激素依赖型、AD1和AD2）中的水平。从每个样品中装载20μg蛋白质。β-管蛋白被印迹用于蛋白质负荷控制。B类：AR和PSA表达的定量。Western blot显示于A类用ImageJ程序进行分析，每个样本中AR和PSA的表达与每个样本中的β-微管蛋白相关。抄送：Ber-EP4和AR在CWR22R3和LNCaP细胞中的表达。在CDS培养基中培养CWR22R3细胞（R3）。LNCaP细胞在含有10%FBS的RPMI中生长。不添加额外的DHT。细胞固定并渗透。随后，用荧光素-异硫氰酸盐结合的抗鼠抗体单独处理细胞（第二抗体），或先用鼠抗Ber-EP4或AR抗体处理细胞，然后用荧光素-异硫氰盐结合抗鼠抗体处理细胞。用荧光激活细胞分选法对标记细胞进行分析。医生：CWR22R3和LNCaP细胞系AR和PSA蛋白表达的Western blot分析。细胞在CDS培养基中培养3天，然后在添加（+）或不添加（−）10 nmol/L DHT的情况下再培养24小时。此外，还对样品进行了α-微管蛋白印迹，以控制蛋白质负载量。电子邮箱：CWR22R3细胞AR表达的免疫荧光分析。细胞在CDS培养基中生长，并在无DHT或10 nmol/L DHT（DHT）的情况下培养24小时。这个左边面板显示了抗AR抗体的染色结果。这个正确的面板显示了细胞的相位对比图像。F：定量实时RT-PCR分析PSA公司mRNA水平。CWR22R3（R3）或LNCaP细胞在CDS培养基中培养48小时，然后换成添加（+）或不添加（−）10 nmol/L DHT的CDS培养液，再培养24小时。从上述处理的细胞以及CWR22R3和R4异种移植物（R3、R4）和雄激素依赖的CWR22异种移生物（AD）中提取总RNA。金额PSA公司每个样本中的mRNA以高于PSA公司不添加DHT的CDS培养基中CWR22R3细胞的mRNA数量。德国：对比卡鲁胺和DHT反应的CWR22R3细胞的生长。细胞在CDS培养基中单独生长或与比卡鲁胺（1至25μmol/L）或DHT（1至100 nmol/L）一起生长48小时。通过MTS分析，在490-nm波长下以任意OD单位测量重要细胞。原始放大倍数，×400。

CWR22R3细胞系的建立

为了进一步评估复发性和比卡鲁胺耐药肿瘤的AR功能，我们从两种复发性和比卡鲁胺耐药性的CWR22R异种移植物中建立了细胞系。将细胞培养在类固醇激素缺失培养基（Dulbecco改良的Eagle’s培养基，含10%木炭提取物剥离的FBS，CDS培养基）中。在最初的传代过程中，肿瘤和基质细胞都有生长。在一些传代过程中，使用差异胰蛋白酶化以及与抗上皮抗原（Ber-EP4）单克隆抗体结合的免疫磁珠来积极筛选肿瘤细胞。肿瘤细胞最初在基质细胞包围的小聚集体中生长，即使在基质细胞耗尽后仍继续成簇生长。其中一个细胞系CWR22R3被建立为长期（>2年）无基质细胞污染的细胞系，因为流式细胞术分析显示Ber-EP4上皮标记物和AR的表达与LNCaP细胞相似（图1C）这条线是进一步详细研究的重点。

在CDS培养基中培养2年多后，CWR22R3细胞系继续以与LNCaP PCa细胞系中AR水平相当的高水平表达AR（图1D）.AR DNA测序再次显示密码子874突变，CWR22R3细胞系中没有其他突变（数据未显示）。二氢睾酮（DHT；10 nmol/L）处理24小时后，两种细胞系中AR的数量均增加，这与配体对AR蛋白的稳定作用一致。7通过免疫荧光在CWR22R3细胞中也证实了DHT介导的AR蛋白水平的增加，在不存在或存在DHT的情况下，AR主要是核的（图1E）。即使在DHT刺激后，CWR22R3细胞中也未检测到PSA蛋白，而LNCaP细胞中很容易检测到PSA-蛋白，并且DHT显著增加（图1D）.评估PSA公司通过定量实时RT-PCR证实，CWR22R3细胞系中的mRNA表达相对于体内异种移植物（图1F）.PSA公司DHT可以刺激CWR22R3细胞中mRNA的表达，但相对于DHT刺激LNCaP细胞系中mRNA表达的增加，刺激水平（增加40%）较小。与比卡鲁胺在体内异种移植物中，比卡鲁胺不会抑制CWR22R3细胞系的生长，而DHT可以适度刺激其生长（图1G）.

CWR22R3细胞中Erk/MAP激酶和PI3激酶的激活

患者PCa进展为更具侵袭性的雄激素依赖性疾病与Erk1和Erk2 MAP激酶的激活以及PTEN丢失和随后PI3激酶/Akt通路的激活有关。31,32因此，接下来评估CWR22R3细胞这些激酶的激活情况。值得注意的是，在含有10%FBS或类固醇激素耗竭的CDS培养基中生长的CWR22R3细胞具有高水平的活化Erk1和2，如用磷酸特异性Erk1/2抗体的免疫印迹所评估的（图2A）24小时的血清饥饿并没有减弱这种激活，只有通过对饥饿细胞的血清刺激才能适度增强这种激活（图2A）如前所示，在FBS或CDS培养基中生长的LNCaP细胞中未检测到Erk磷酸化。与Erk激活相反，与PTEN缺陷的LNCaP细胞相比，CWR22R3细胞中Akt以非常低的水平磷酸化（图2B）与此结果一致，在CWR22R3细胞中通过免疫印迹很容易检测到PTEN的表达，表明雄激素非依赖性的进展与这些细胞中PTEN的丢失或PI3激酶的激活无关（数据未显示）。

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CWR22R3细胞系中的Erk激活。CWR22R3或LNCaP细胞在FBS（FBS+）或CDS培养基（CDS+）中培养24小时。额外的CWR22R3细胞在无血清培养基（FBS−、CDS−和stim−）中培养24小时，随后用或不用CDS培养基进行血清刺激20分钟（FBS–、CDS–、stim+或FBS–，CDS–和stim–）。用抗磷酸化Erk（p-p44 Erk1/p-p42 Erk2）和抗总Erk（总Erk）抗体对细胞裂解物进行印迹(A类,顶部); 或抗磷酸化Akt（p-Akt）和抗总Akt抗体(B,顶部). 这个底部小组展示了Erk磷酸化的量化(A类，p-p42/p42）或Akt磷酸化(B，p-Akt/Akt）通过ImageJ分析顶部面板。

接下来使用免疫组织化学来确定MAP激酶是否激活体内在CWR22异种移植物向雄激素非依赖性发展的过程中。去势前，对CWR22异种移植物的活检组织进行抗磷酸Erk1/2免疫染色，最终形成CWR22R3细胞系，结果显示只有罕见的分散肿瘤细胞弱染色和内皮细胞偶尔阳性染色（不到肿瘤细胞的2%）（图3A）相反，复发和比卡鲁胺耐药的CWR22R3异种移植物中核磷酸化-Erk1/2染色强的细胞数量增加(图3、B和C）。染色模式呈斑片状，在阳性染色区域内，p-Erk阳性的肿瘤细胞百分比增加（分离后异种移植物为20-30%，分离后和比卡鲁胺耐药异种移生物为50-60%）。阳性细胞的排列从分散到大聚集体不等。通过免疫染色，上述异种移植物中AR的表达呈现出更均匀的分布模式，所有肿瘤中绝大多数细胞（80-90%）为AR阳性（图3，D–F）总之，这些结果表明CWR22R3异种移植物中Erk1/2激活体内在向雄激素非依赖性发展的过程中，CWR22R3细胞系中维持了Erk1/2的激活。

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CWR22R3异种移植物复发期间的Erk激活。磷酸特异性抗体的免疫组织化学染色(A–C)或抗AR抗体(D–E型)关于去势前准备的CWR22R3异种移植物活检标本(A类,天)去势后，比卡鲁胺治疗开始前(B,E类)，或在比卡鲁胺治疗结束时(C,F类). 原始放大倍数，×200。

CWR22R3细胞对低水平雄激素不敏感

先前的研究表明，在雄激素缺失培养基中长期培养PCa细胞可以选择对雄激素过敏的细胞，这些细胞受到低浓度（微粒体）DHT的刺激，并受到刺激其亲代细胞的纳米摩尔浓度的抑制。6,7由于复发的CWR22异种移植物类似地适应于低去势雄激素水平，并且细胞系在雄激素缺乏的培养基中长期生长，因此进一步研究了CWR22R3细胞对低雄激素浓度的反应。CDS培养基中培养的细胞补充DHT，并在第2天和第4天通过MTS分析评估细胞生长。如所示图4A，细胞生长不受微粒体浓度DHT的刺激，仅受1至10 nmol/L DHT的促进。通过直接细胞计数获得了可比较的结果（图4B）.检查PSA公司通过定量实时RT-PCR，在10倍DHT浓度范围内，CWR22R3细胞中的mRNA水平−14到10−8mol/L，同样表明PSA公司表达对低水平的DHT不敏感，并且在纳米摩尔范围内受到DHT的刺激（图4C）这种DHT剂量反应与雄激素依赖性PCa细胞系LNCaP细胞中的剂量反应相似，尽管LNCaP中的反应幅度更大（图4D）综上所述，这些数据表明，尽管CWR22R3细胞在雄激素缺失培养基中长期繁殖，但对雄激素仍有适度反应，但对低雄激素水平不敏感。

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CWR22R3生长和PSA表达对DHT的反应。答：CWR22R3生长对添加的DHT的反应。细胞在CDS培养基中单独生长或添加DHT（10−15到10−7mol/L）持续48小时。通过MTS分析，在490-nm波长下以任意OD单位测量重要细胞。B类：CWR22R3在CDS培养基中单独生长或添加DHT（10−13到10−7mol/L），直接计数细胞数。C和医生：实时RT-PCR分析PSA公司CWR22R3细胞中mRNA的表达(C)和LNCaP(天)在CDS培养基中培养48小时，然后用0，10刺激−14到10−8mol/L DHT再延长24小时。PSA水平表示为未补充DHT的细胞中PSA水平的倍数变化（相对水平）。

CWR22R3细胞缺乏雄激素非依赖性AR转录活性

在激素缺失培养基中培养的CWR22R3细胞中，PSA表达水平较低，且缺乏低浓度DHT的刺激，这表明在没有添加雄激素的情况下，AR不具有转录活性。然而，也有可能AR仍然具有转录活性，并且PSA表达的缺乏是由于内源性PSA公司基因甲基化或其他与AR活性无关的机制。因此，接下来对AR调节报告基因进行转染研究，以更直接地评估配体依赖性或非依赖性AR转录活性。用荧光素酶报告子转染CWR22R3细胞，荧光素瘤报告子受四个串联一致雄激素反应元件（ARE）调节4-荧光素酶），并在没有或存在DHT的情况下测定荧光素酶活性。在缺乏雄激素的情况下，报告基因活性水平较低（与缺乏AREs的亲代pGL3启动子报告基因的水平相当），DHT对其刺激约为5倍（图5A）值得注意的是，比卡鲁胺抑制了DHT刺激的AR转录活性，证实该药物在这些细胞中仍起AR拮抗剂的作用。然而，比卡鲁胺对雄激素依赖型荧光素酶的基础活性没有影响。

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AR应答记者的AR转录活性。CDS培养基中生长的CWR22R3细胞转染无ARE-less pGL3/启动子（pGL3）或ARE-responsive element-driven firefly luciferase reporters，ARE4-Luc或PSA-Luc，以及pRL-CMV雷尼利亚荧光素酶报告子。转染后24小时，用添加或不添加10 nmol/L DHT的CDS培养基替换培养基，再延长24小时。在处理结束时对细胞进行裂解，AR转录活性显示为相对光单位（萤火虫荧光素酶雷尼利亚荧光素酶活性（RLU）。答：在过去24小时内，用不同浓度的比卡鲁胺（Bical）共同处理后转染细胞。B和抄送：是4-吕克(B)和PSA-Luc(C)与AR特异性（AR siRNA）或对照（mut siRNA）siRNA共同转染，并在过去24小时内与DHT或不与DHT共同培养。

接下来使用RNA干扰来进一步解决AR是否介导了基础雄激素非依赖性和比卡鲁胺抗性报告基因活性。用ARE共转染CWR22R3细胞4-针对AR而非突变对照的荧光素酶报告子和siRNA导致DHT刺激的转录活性显著降低（图5B）相反，与突变siRNA相比，AR siRNA并没有特异性抑制雄激素依赖性活性。本实验也使用由PSA公司基因调控区。PSA-荧光素酶报告子被DHT刺激了大约六倍，而这种DHT刺激的活性可以被AR siRNA完全抑制，但不能被突变的siRNA抑制（图5C）然而，正如ARE所观察到的4-荧光素酶报告子AR siRNA没有特异性抑制雄激素诱导的基础荧光素酶活性。这些结果表明，在不添加雄激素的CDS培养基中，AR缺乏转录活性。

p160类固醇受体辅激活剂不能恢复雄激素非依赖性或超敏AR转录活性

先前的研究表明，增加p160类固醇受体辅激活蛋白（SRC-1、-2和-3）的表达可以增强AR对低水平雄激素的反应，并可能增强雄激素依赖性PCa中AR的活性。18,26此外，Erk MAP激酶激活可以进一步增强类固醇激素受体和p160共激活蛋白之间的相互作用，在AR的情况下，这可能通过SRC-2（TIF-2）的磷酸化介导。19因此，我们评估了SRC-1、-2或-3在CWR22R3细胞中的增加表达是否会放大任何单用报告基因无法检测到的弱雄激素依赖性AR转录活性，这些细胞维持高水平的组成性Erk MAP激酶激活。如所示图6ASRC蛋白（尤其是SRC-3）的联合转染可以增强DHT依赖的报告基因活性。然而，这些共同激活物并没有刺激雄激素依赖性AR转录活性。

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补充SRC蛋白对AR转录活性的影响。答：CDS培养基中生长的CWR22R3细胞转染AR-应答报告子ARE4-Luc和pRL-CMV雷尼利亚萤光素酶报告基因。转染后24小时，用CDS培养基替换培养基（含或不含10−8mol/L DHT再延长24小时。如图所示，用0、50或100 ng SRCs 1至3共同转染细胞。B和抄送：将100 ng SRC-2共同转染细胞(B)或100 ng SRC-3(C)用0或10处理−14到10−8mol/L DHT在最后24小时的分析中。AR转录活性表示为萤火虫的相对轻单位雷尼利亚荧光素酶活性（RLU）。

接下来，我们讨论了增加共激活物表达是否可以增强AR对低水平雄激素刺激的反应。SRC-2和ARE联合转染的CWR22R3细胞4-荧光素酶报告子在广泛的DHT浓度范围内评估荧光素酶活性。与上述数据一致，SRC-2在10 nmol/L DHT时开始增强AR活性（图6B）然而，SRC-2并未使AR对较低水平的DHT过敏。与SRC-3或SRC-1的共转染同样不能增强AR对低水平DHT的反应(图6C和数据未显示）。总之，这些结果进一步支持了以下结论：CWR22R3细胞中的AR在ARE调节基因上缺乏雄激素依赖性转录活性。

AR下调导致增长放缓和G0/G公司1CWR22R3细胞的细胞周期阻滞

尽管缺乏可检测到的AR转录活性，但CWR22R3细胞在雄激素缺乏条件下的长期生长过程中保持较高水平的AR表达。这表明AR可能在这些细胞中继续发挥关键作用。通过逆转录病毒介导AR特异性短发夹RNA（shRNA）的表达，通过稳定的AR下调，进一步检测AR在CWR22R3细胞中的重要性。用编码AR特异性shRNA的逆转录病毒（pSuper-1981或pSuper-1774）或控制性shRNA（pSuper-1981mut）感染CWR22R3细胞，并用嘌呤霉素短暂筛选感染细胞。感染细胞的抗AR免疫印迹显示AR下调，表明感染pSuper-1981或pSuper-1774的细胞AR表达分别降低至对照感染细胞的29%和37%（图7A）.

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病毒介导的AR下调导致CWR22R3细胞生长迟缓。答：shRNA下调AR。CWR22R3细胞感染AR特异性（pSuper-1981或pSuper-1774）或对照（pSuper-1981mut）shRNA-生成逆转录病毒2天。然后将感染的细胞在含有2μg/ml嘌呤霉素的CDS培养基中选择3天。细胞在裂解前在无嘌呤霉素培养基中再恢复2天。对细胞提取物进行AR和α-微管蛋白（微管蛋白）的印迹(左边). 这个正确的小组通过分析左边使用ImageJ程序的面板螺栓。B类：AR下调后PSA基因表达。在两个独立的实验（实验1和实验2）中，用pSuper-1981mut（mut）或pSuper-1881（1981）感染CWR22R3细胞，并用嘌呤霉素选择感染细胞，如A类在感染后第7天（实验1）或第8天（实验2）分离出总RNA。定量实时RT-PCR分析PSA公司mRNA水平表示为相对于PSA公司mut感染细胞的mRNA水平。抄送：感染AR-特异性（1981或1774）或对照（mut）shRNA-生成的逆转录病毒和嘌呤霉素选择后第9天计数的细胞。医生：感染AR特异性（pSuper-1981或pSuper-1774）或对照（pSuper-1981mut）shRNA-generating retrovirus和嘌呤霉素选择后9天的CWR22R3细胞相位对比图。电子邮箱：病毒感染和嘌呤霉素选择的CWR22R3细胞（2×10三)感染后5天，在每个24孔中进行电镀，并在CDS培养基中生长。在感染后的指定天数，细胞生长后进行细胞计数。F：感染AR特异性（1981年或1774年）或对照（mut）shRNA-生成逆转录病毒并选择嘌呤霉素后11天，CWR22R3细胞中OAS1的诱导。通过实时定量RT-PCR测定诱导率，并将其表示为与共同感染细胞相比的相对变化倍数（相对水平）。德国：在感染后3天，不选择嘌呤霉素的情况下，对CWR22R3细胞的细胞提取物进行PARP和α-微管蛋白（微管蛋白）的印迹。安星号表示劈开的PARP产品。原始放大倍数，×200。

AR下调使我们能够进一步研究CWR22R3细胞中的AR在内源性PSA公司基因。在感染后7至8天，从用pSuper-1981和对照pSuper-1981mut感染的细胞中分离RNA，并评估PSA公司实时RT-PCR表达。值得注意的是PSA公司AR下调细胞中的表达，进一步表明PSA公司表达不受雄激素依赖性AR转录活性介导（图7B）的确，PSA公司在两种独立的感染中，AR阳性细胞的表达高于对照处理细胞。从绝对值来看，增幅不大，但由于基础水平较低，随着变化次数的增加，增幅似乎更大（图1F）在任何情况下，这种增加都可能反映出非连锁AR联合阻遏物募集（NCoR或SMRT）减少，或间接影响其他转录因子介导的低基础转录因子PSA公司表达式。

引人注目的是，与突变对照感染细胞相比，AR shRNA-表达的CWR22R3细胞的生长显著下降（图7、C和D）形态学上，表达AR shRNA的感染细胞的细胞密度降低，树突状突起增加，而细胞碎片或凋亡小体没有增加（图7D）为了评估AR下调对CDS培养基中细胞生长的长期影响，将等量的嘌呤霉素选择的感染细胞进行培养，然后进行生长。生长抑制持续了5周以上（图7E）如AR免疫荧光染色所示，pSuper-1981感染后继续生长的细胞有残余AR表达（数据未显示）。在三种不同的感染中也获得了类似的结果。这种生长抑制效应似乎与AR下调直接相关，因为在对照shRNA病毒感染的细胞中未观察到这种效应。为了排除shRNA诱导非特异性干扰素的潜在影响，我们评估了2′，5′-寡腺苷酸合成酶（OSA1）的诱导，这是一种经典的干扰素靶基因。先前的研究表明，干扰素应答诱导的OSA1诱导倍数大于50倍，而大多数siRNAs诱导的变化微不足道（少于3倍）。33,34如所示图7F，病毒介导的AR shRNA均未引起阻塞性睡眠呼吸暂停1mRNA水平与对照shRNA相比，表明AR shRNA的作用不是由干扰素介导的。

为了进一步检查pSuper-1981感染细胞的生长迟缓是否是因为凋亡增加，我们测定了PARP的裂解程度。如所示图7G感染pSuper-1981或对照pSuper-181mut的细胞中没有检测到PARP裂解。作为阳性对照，在用PI3激酶抑制剂LY294002处理的LNCaP细胞中容易检测到PARP裂解产物。通过末端dUTP缺口标记分析比较pSuper-1981感染细胞与对照感染细胞的细胞凋亡也没有发现任何显著差异（数据未显示）。因此，AR下调后细胞生长减少并不是因为凋亡增加。

接下来，我们检测了DNA含量，以确定AR下调是否影响细胞周期的特定阶段。S和G中的细胞比例2/在pSuper-1981感染的细胞中，M期明显减少，G期细胞相应增加0/G公司1阶段（图8A）。该细胞周期分析也证实了亚G的缺失0/G公司1凋亡细胞。与G区被捕的牢房一致0/G公司1，p27的表达增加基普1与pSuper-1981mut对照感染细胞相比，pSuper-188感染细胞中pRb磷酸化显著降低(图8、B和C）。

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AR下调对细胞周期的逮捕。在感染AR特异性（pSuper-1981）或对照（pSuper-1981mut）shRNA逆转录病毒和选择嘌呤霉素后的第7天收集嘌呤菌素选择的CWR22R3细胞。答：通过碘化丙啶标记和流式细胞术进行细胞周期分析。列出了每个细胞周期阶段的细胞百分比。对细胞裂解液进行p27蛋白印迹基普1（第27页）(B)，磷酸-视网膜母细胞瘤蛋白（p-pRB，S780）(C)，细胞周期蛋白D1–3(天)和磷酸-p44 Erk1和磷酸-p42 Erk2(E类). α-微管蛋白（Tubulin）也进行了印迹，以表明每个样品中的蛋白质负载量相当。

先前对雄激素依赖性LNCaP细胞、CWR22异种移植物和啮齿动物前列腺的研究表明，雄激素戒断同样会导致G0/G公司1细胞周期阻滞，p27增加基普1pRb磷酸化降低。35至38值得注意的是，雄激素停药后LNCaP细胞的细胞周期阻滞也与D型细胞周期蛋白表达降低有关。39相反，AR shRNA表达的CWR22R3细胞与对照细胞相比，细胞周期蛋白D1、D2和D3的水平没有降低，这表明细胞周期的进展被一种独立于D型细胞周期蛋白表达水平的独特机制所阻止（图8D）.

综上所述，这些结果表明AR在类固醇激素缺乏培养基中继续对CWR22R3细胞的生长起着关键的调节作用，并表明该功能与ARE调节基因的常规转录活性不同。先前的研究已经确定了激动剂配体AR和其他类固醇激素受体的非转录功能，导致MAP激酶和PI3激酶的激活。40–45因此，我们最终检测了AR shRNA-表达细胞与对照组相比，CWR22R3细胞中Erk1和Erk2的组成性激活是否受到影响。如所示图8E在表达AR shRNA的细胞中，Erk1或Erk2磷酸化没有检测到降低。同样，我们也没有检测到PI3激酶/Akt活性的任何变化（数据未显示）。

讨论

CWR22异种移植物被用作模型，以确定AR是否通过转录或非转录功能在晚期雄激素依赖性PCa中继续发挥关键作用。去势小鼠复发的CWR22肿瘤表达AR和PSA的水平与雄激素依赖性CWR22异种移植物相当，并且对高剂量比卡鲁胺具有耐药性。在类固醇激素缺失培养基中长期培养后，从复发的CWR22异种移植物中建立的CWR22R3细胞系继续表达AR，并对比卡鲁胺耐药，但PSA表达与对照组相比显著降低体内异种移植。与这种低水平的PSA表达一致，用AR调节报告基因的瞬时转染实验表明，CWR22R3细胞中的AR缺乏雄激素依赖性转录活性，并且对低水平雄激素不敏感。尽管如此，稳定的shRNA介导的AR表达下调导致细胞生长显著抑制和细胞在G0/G公司1这些结果确定了AR在雄激素依赖性PCa中调节细胞周期进展的关键功能，并证明AR功能不是通过其常规转录活性介导的。

与其他类固醇激素受体类似，据报道，AR对其配体具有快速的非转录信号传导功能，几项研究表明，AR可以直接与c-Src和PI3激酶相互作用。40–45非转录AR功能的生物学意义在卵母细胞中得到了最清楚的证明，其中激素刺激的AR通过这种非转录机制启动卵母细胞成熟。46然而，这些报道的AR非转录功能（类似于转录活性）是配体刺激的，它们在正常前列腺上皮或前列腺癌中的生理重要性尚未确定。值得注意的是，在CWR22R3细胞中，AR在没有配体刺激的情况下仍然具有功能，我们没有观察到Erk1、Erk2 MAP激酶或PI3激酶/Akt活性对AR下调的反应，进一步表明AR通过不同的机制发挥作用。

雄激素结合诱导AR配体结合域的构象变化，刺激同二聚体化，并通过LXXLL基序为转录共激活蛋白生成结合位点。1尽管如此，多种蛋白也可以通过不依赖雄激素介导的配体结合域构象变化的位点与AR结合，这种相互作用可能介导AR对细胞周期进展的雄激素依赖性效应。这些候选AR相互作用蛋白包括细胞周期蛋白D1和pRb，据报道它们与AR N末端相互作用并抑制（细胞周期蛋白D 1）或增强（pRb）雄激素刺激AR转录活性。47–49AR介导的CWR22R3细胞生长维持的分子机制，包括AR相互作用蛋白的作用目前正在研究中。最后，应该强调的是，虽然我们的研究没有检测到含有多个ARE的常规雄激素调节基因在缺乏配体的情况下残留AR转录活性，不能完全排除AR可能通过不依赖are结合的替代机制（例如通过与其他转录因子的相互作用）对某些基因的表达仍然至关重要。

先前的研究表明，当AR被转染的AR特异性siRNA、核酶或抗AR抗体注射下调时，适应于雄激素缺失条件下生长的LNCaP或LAPC4 PCa细胞的生长也可能受到抑制。8–11,50这些发现与我们在CWR22R3细胞中的结果一致。然而，在这些报道的研究中，雄激素依赖性PCa细胞表达大量PSA，表明AR仍具有转录活性。因此，他们没有说明生长抑制是由于残余雄激素介导的AR转录活性的消除（其中一项研究使用在不缺乏类固醇激素的培养基中生长的细胞）还是其他机制。此外，这些先前的研究并没有评估AR下调对细胞周期或细胞周期调节蛋白的影响，尤其是对D型细胞周期蛋白表达的影响（在CWR22R3细胞中，AR shRNA不会抑制D型周期蛋白的表达）。此外，在LNCaP-abl细胞中AR下调导致显著的凋亡细胞死亡，47这在CWR22R3细胞中没有观察到。因此，尽管这些先前的研究进一步支持了AR仍然是雄激素依赖性PCa细胞生长和存活的关键调节因子的假设，但AR在LNCaP和LAPC4细胞与CWR22R3细胞中是否具有相似或不同的功能尚待确定。

尽管CWR22R3细胞系中的AR在缺乏雄激素的情况下没有可检测的转录活性，但CWR22R3和CWR22R4异种移植物体内去势小鼠中PSA的表达水平与雄激素依赖性CWR22异种移植物相当。复发性CWR22异种移植模型和雄激素依赖性PCa患者中PSA和其他雄激素调节基因的高表达强烈表明AR在雄激素非依赖性进展过程中保持转录活性。28尽管去势和抗雄激素治疗后复发的PCa被称为雄激素依赖性PCa，但实际上这些肿瘤可能仍然对雄激素有反应。AR转录活性可能由低水平的残余雄激素介导体内具有多种机制，包括MAP激酶激活增强雄激素反应。值得注意的是，复发的CWR22异种移植物对比卡鲁胺也有耐药性，这可能反映了该拮抗剂的AR亲和力较低，并且与大多数雄激素剥夺治疗后复发的患者对比卡鲁胺的固有耐药性一致。4,22CWR22R3细胞系AR转录活性的丧失与雄激素的更可控和严格耗竭相一致在体外培养基中加入木炭提取物剥离血清。此外，这种转录活性的丧失也可能是由于其他因子的丢失，因为CWR22R3细胞中的AR活性对低水平的DHT不敏感，并且不能通过添加AR辅因子SRC1到SRC3来恢复。

总之，本研究表明AR对CWR22R3细胞系的雄激素依赖性生长仍然至关重要。此外，在没有雄激素的情况下或在低水平添加雄激素的条件下缺乏可检测的AR转录活性表明，CWR22R3细胞中的AR功能是由一种不同于其常规转录功能的机制介导的。进一步描述在体外关键的雄激素依赖性AR活性，无论是非转录还是新的转录功能，都是决定其在多大程度上参与体内肿瘤生长及其是否可能为药物开发提供新的治疗靶点。

致谢

我们感谢Tom Pretlow（俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院和癌症中心）非常慷慨地提供了CWR22异种移植物，感谢Balk实验室的成员审阅了原稿并提出了有益的建议。

脚注

地址：马萨诸塞州波士顿布鲁克林大道330号贝斯以色列女执事医疗中心血液/肿瘤科Xin Yuan，邮编：02215。.dravrah.cmdib@nauyx公司：liam-E

由美国国立卫生研究院（向S.P.B.拨款R01-CA65647，向X.Y.拨款K01-DK64739）、马萨诸塞州（向X.Y拨款前列腺癌研究）、国防部（向X.Y.拨款DAMD17-03-0164）和好时家庭前列腺癌研究基金支持。

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文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会