分子系统生物学。2006; 2: 2006.0033.
p53系统中的振荡和变异
,1,* ,1,* ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2和1,一
娜玛·格瓦·扎托尔斯基(Naama Geva-Zatorsky)
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
尼赞·罗森菲尔德
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
沙列夫·伊兹科维茨
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
罗恩·米洛
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
亚历克斯·西格尔
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
埃雷斯·德克尔
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
塔里亚·亚尼茨基
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
尤瓦拉尔·利隆
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
帕兹·波拉克
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
加利特·拉哈夫
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院系统生物学系
乌里·阿隆
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院系统生物学系
*这些作者对这项工作贡献均等
2005年8月5日收到;2006年3月28日接受。
- 补充资料
补充数字和信息
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补充电影
GUID:6D750747-3454-4908-A657-F91FD6372459
摘要
理解蛋白质回路的动力学和可变性需要在活细胞和理论模型中进行准确测量。为了解决这个问题,我们采用了人类细胞中研究得最好的蛋白质回路之一,即抑癌基因p53和癌基因Mdm2之间的负反馈回路。我们在几天内测量了荧光标记的p53和Mdm2在单个活细胞中的动态变化。我们发现,在DNA损伤的γ射线照射后,同一环境中的等基因细胞表现出高度可变的行为:一些细胞表现出至少3天的无阻尼振荡(超过10个峰值)。振荡幅度比周期变化大得多。姐妹细胞在细胞分裂后继续以相关方式振荡,但平均约11h后失去相关性。其他细胞表现出与振荡不同的低频波动。我们还分析了系统的不同数学模型族,包括一种新的检查点机制。这些模型指出了振荡变化的可能来源:蛋白质生产速率中的低频噪声,而不是降解速率等其他参数中的噪声。这项研究提供了一个观点,即活的人类细胞中蛋白质回路的行为随着时间的推移在细胞之间和在同一细胞中的广泛变化。
关键词:癌症遗传学、荧光显微镜、定量生物学、系统生物学
介绍
系统生物学的目标是理解控制蛋白质调节电路动力学的设计原则(哈特维尔等, 1999). 研究在各种生物网络中重现的网络基序和调控模式尤为重要(米洛等, 2002;Alon,2003年,2006). 了解特定网络基序的动力学特征可能有助于我们了解该基序出现的各种生物系统(李等, 2002;Shen-Orr公司等, 2002;Mangan和Alon,2003年;Kalir和Alon,2004年;奥多姆等, 2004;博伊尔等, 2005;马扬等, 2005;曼根等, 2006). 为此,利用活细胞的动态测量来研究最具特征的系统是很重要的。
为了理解蛋白质回路,研究生物反应的随机性对回路行为的影响是很重要的(诺维克和韦纳,1957年;斯普迪奇和科什兰,1976年;麦克亚当斯和阿金,1997年,1999;Becskei和Serrano,2000年;Thattai和van Oudenaarden,2001年;埃罗威兹等, 2002;匆忙等, 2002;乌兹巴达克等, 2002;布莱克等2003年;艾萨克斯等2003年;保尔森,2004;Raser和O'Shea,2004年,2005;拜奇凯伊等, 2005;布莱克和柯林斯,2005年;科尔曼-勒纳等, 2005;戈尔丁等, 2005;凯恩等, 2005;萨克斯等, 2005;温伯格等, 2005;沃尔夫森等, 2006). 为此,有必要研究单个细胞并测量生物反应中的细胞-细胞变化,而不是计算细胞群的平均值。迄今为止,大多数随机行为的研究都是在微生物中进行的。因此,测量单个人类细胞中蛋白质回路在长时间内的行为和变异性是很有意义的。
在这里,我们研究了一种在生物体中反复出现的网络基序的动力学和可变性:一个负反馈环,它由两个不同时间尺度上的相互作用组成——慢阳性转录臂和快阴性蛋白-蛋白相互作用臂(拉哈夫等, 2004;Yeger-Lotem公司等, 2004;马扬等, 2005). 我们研究了人类细胞中最具特征的系统之一,即p53和Mdm2之间的负反馈回路中的网络基序(库布塔特和沃斯登,1998年;Prives,1998年;拉金和杰克逊,1999年;Prives and Hall,1999年;沃格尔斯坦等, 2000;赖安等, 2001;Vousden和Lu,2002年;奥伦,2003;Meek,2004年;债券等, 2005;哈里斯和莱文,2005年).
在p53系统中,p53转录激活平方米Mdm2反过来通过抑制p53作为转录因子的活性和提高其降解速率来负调控p53(巴拉克等, 1993;吴等, 1993;搬运等, 1997;库布他特等, 1997;皮埃特等, 1997;莫曼等, 2000). p53的浓度随着压力信号的增加而增加,例如DNA损伤。这种增加的主要机制是由于与Mdm2的相互作用减少而使p53稳定。在应激信号发出后,p53激活数百个涉及生长停滞、凋亡、衰老和DNA修复的基因的转录。值得注意的是,许多额外的蛋白质与p53和Mdm2相互作用,因此负反馈环基序嵌入额外相互作用的网络中,其中许多还没有完全表征(哈里斯和莱文,2005年).
负反馈回路的模型,如p53和Mdm2之间的模型,表明它们可以在两种蛋白质之间产生一个具有时间延迟的振荡行为(Lev Bar-O或等, 2000;米哈拉斯等, 2000;霍夫曼等, 2002;蒂娜等, 2002;Michael和Oren,2003年;Monk,2003年;泰森等2003年;纳尔逊等, 2004;泰森,2004年;奇利贝托等, 2005;妈妈等, 2005). 对于反馈回路的不同参数,动力学可以显示单调响应、阻尼振荡或无阻尼(持续)振荡,其中每个峰值的振幅与前一个峰值的振幅相同(拉哈夫,2004). 蛋白质之间的相互作用越强,动力学振荡越大。其他参数,如蛋白质的高基础降解率,往往会减弱振荡。大多数p53网络模型使用确定性方程,因此没有考虑动态中的细胞-细胞变异性。
实验研究表明,γ射线照射引起DNA损伤后,p53和Mdm2发生振荡行为。在测量细胞数量平均值的分析中,这些波动似乎得到了抑制(Lev Bar-O或等, 2000). 在之前的一项研究中,我们开发了一个跟踪单个活细胞中p53和Mdm2动态的系统。该系统使用稳定转染p53融合青色荧光蛋白(CFP)的MCF7乳腺癌细胞系,Mdm2融合黄色荧光蛋白(YFP)。p53-CFP融合蛋白在引起凋亡和反式激活下游靶点方面很活跃。Western blots中发现这两种荧光标记蛋白的浓度和动力学可以可靠地重现这些细胞表达的内源性p53和Mdm2的浓度和动态(拉哈夫等, 2004). 在我们之前的研究中,使用荧光显微镜的单个细胞测量仅限于伽玛射线照射后16小时。在这16小时期间,我们观察到伽玛射线照射后p53-CFP浓度出现两个无阻尼峰值(拉哈夫等, 2004). 峰值振幅和时间与辐照剂量无关。平均峰数似乎随着辐照剂量的增加而增加,从这个意义上讲,16小时实验中出现两个峰的概率随着剂量的增加,而无振荡峰的概率则随着剂量的减少而降低。
在这里,我们对单个活乳腺癌(MCF7)细胞中p53和Mdm2的动力学进行了实验研究,研究时间比我们之前的研究要长得多。在大部分细胞中,我们发现p53-CFP和Mdm2-YFP持续无阻尼振荡,在γ射线照射后持续至少3天。我们还通过检测响应中的噪声来扩展我们之前的研究。我们发现,等基因细胞之间的振荡模式变化很大,但这种变化具有独特的特性:振荡幅度波动很大,但振荡频率变化较小。除了振荡的细胞外,其他细胞的蛋白质水平也呈现出动态波动,这与持续的振荡不同。延长的实验表明,振荡细胞的比例随着辐照剂量的增加而增加。
我们还对p53系统中的负反馈回路进行了理论分析。我们通过研究几个模型族,并通过研究模型反应中的随机性影响,扩展了先前的理论研究。我们发现,几个不同的模型族可以捕获实验观测到的振荡,并建议“一致参数”用于体内该系统中的降解和生产率。为了捕捉动力学中的变化,我们发现必须明确地将长波噪声添加到不同的模型参数中。分析表明,观察到的振荡特征变化源于蛋白质生产速率的波动,而不是其他参数的波动。从本质上讲,负反馈回路在反馈回路共振频率附近的频率放大蛋白质生产速率中缓慢变化的噪声。
结果
长时间的延时电影显示了几天内无阻尼的振荡
我们使用稳定转染p53-CFP和Mdm2-YFP的MCF7细胞系克隆(拉哈夫等, 2004). 我们描述的结果是从同基因细胞中获得的,这些细胞是从单个亲本细胞中生长出来的(拉哈夫等, 2004). 蛋白质印迹表明,我们细胞系中外源性p53 CFP和Mdm2-YFP蛋白的浓度与内源性p53和Mdm2蛋白的浓度相当(拉哈夫等, 2004). 因此,这些蛋白在当前系统中没有强烈过度表达。
我们获得了这些细胞在γ射线照射后长时间的延时荧光显微镜照片(和SM1电影补充信息). 总的来说,我们收集了1000多个细胞在不同剂量γ射线照射下的不同实验中的时间进程。大多数延时电影都是在湿度、温度和一氧化碳可控的培养箱环境中进行的2提供了允许数天增长的条件。每隔10–20分钟,采集荧光和相位照明下的细胞图像。在没有伽玛射线照射的情况下,细胞在电影中剧烈分裂至少3天。γ射线照射导致细胞进入生长停滞期。我们发现,当蛋白位于细胞核中时,p53-CFP和Mdm2-YFP荧光清晰可见(和补充图S1). 对于每个细胞,我们获得了与细胞核中p53-CFP和Mdm2-YFP的平均荧光强度相等的时间相关信号(和和补充图S2).
γ射线照射后单个MCF7、U280细胞中荧光标记的p53和Mdm2核水平的长期振荡。(A类)γ射线照射5 Gy后29小时内一个细胞的时间荧光图像。核p53-CFP和Mdm2-YFP分别以绿色和红色显示。时间以小时表示。(B)γ辐照后p53-CFP(绿色)和Mdm2-YFP(红色)的归一化核荧光水平。左上角:面板A中显示的细胞。其他面板:暴露于2.5 Gyγ射线照射后,从一个视野中观察五个细胞。
MCF7细胞中的核Mdm2-YFP荧光,U280。(A、 B类)暴露于5 Gy(A)和10 Gy(B)γ射线照射后Mdm2-YFP水平的振荡。(A)和(B)中的底部三个面板是非振荡单元。(C类)无γ辐照的Mdm2-YFP动力学。(D类)核Mdm2-YFP峰值的时间:水平线显示了37个具有~5.5-h振荡的细胞随时间的归一化Mdm2-YFP动力学。蓝色表示低荧光水平,黄色-红色表示高荧光水平。虚线是眼睛的指南,表示6小时的间隔。
在大量细胞中发现p53-CFP和Mdm2-YFP的核水平在γ射线照射后持续振荡。在大多数这些细胞中,这些振荡持续了整个电影期间(和).
我们使用傅里叶分析分析了每个单元的特征振荡频率(补充图S3)以及音调检测,这是一种在语音识别背景下通常用于确定噪声非平稳信号中的主频率的方法(见材料和方法)。在长电影中,我们发现约60%的细胞暴露于10 Gyγ射线脉冲照射下,表现出持续的Mdm2-YFP振荡,周期为5.5±1.5小时(图3)。
值得注意的是,相当一部分细胞(约占10 Gy的40%)显示出Mdm2-YFP动力学,与持续振荡不相似(和补充图S2). 这些细胞要么没有反应,要么波动缓慢(,底部面板)。在一些细胞中,振荡在1-2天后停止或频率改变。
不同细胞中振荡的开始与DNA损伤信号同步。由于振荡频率的变化,细胞逐渐失去了彼此的同步性(和补充图S2E). 在振荡电池中,Mdm2-YFP峰跟随p53-CFP峰,平均延迟2±0.5 h(和4C)。
我们评估了每个振荡单元中每个峰值的振幅和宽度,并计算了这些特性的平均值。随着时间的推移,振荡的平均振幅似乎没有显著变化(图4A)。同样,平均峰值宽度在整个电影中也没有显著变化(图4B)。在这个意义上,振荡可以描述为无阻尼。
峰值振幅变化很大,而峰值定时更精确
同一视野中克隆细胞的动力学表现出明显的细胞-细胞差异。不同细胞之间以及同一细胞中不同峰之间存在这些差异。我们检查了振荡峰值之间的变化(例如。). 我们发现,单个峰值的振幅随方差系数(标准偏差除以平均值)的变化而变化,约为70%(图4D)。Mdm2-YFP峰的振幅与之前或之后的p53-CFP峰振幅无关(相关系数为0±0.2)。在某些情况下,Mdm2-YFP峰值出现时没有检测到之前的p53-CFP峰值(补充图S4).
与振幅的巨大可变性相比,单个峰的峰宽和p53–Mdm2延迟更为恒定,变化仅约30%(图4E和F)。在大多数振荡单元中,每个单元的振荡周期变化(沿振荡信号的节距值变化)小于20%。
姐妹细胞之间的相关性在半代内消失
为了进一步研究每个细胞动力学的可变性,我们检查了电影中经历细胞分裂的细胞。在电影的前40小时,这些细胞包括约75%的未辐照细胞,约65%的0.3 Gy后的细胞,约50%的5 Gy后细胞,以及约10%的伽玛射线照射后的细胞。六个典型示例如所示图5A。
不同γ辐射剂量下细胞Mdm2-YFP信号的基音(特征周期)。(A类)暴露于0、0.3、5和10 Gy的细胞电影以及所有电影的音高值直方图。对于每部电影,都会显示单元的总数,以及具有可检测音调的振荡(osc.)单元的数量。(B)对于不同的伽马剂量,节距值为4-7小时的细胞比例(占细胞总数)。黑线是眼睛的向导。
振荡峰值的平均振幅、宽度和时间延迟及其方差。(A–C)在暴露于5 Gyγ辐射的146个细胞中,前五个p53-CFP(绿色三角形)和Mdm2-YFP(红色方形)振荡峰值的平均值及其标准误差。(A) 前五个峰值(峰到谷)中每个峰值的平均振幅。(B) 平均宽度(最大宽度的一半)。(C) p53峰值和连续Mdm2峰值之间的平均时间延迟。(D–F型)单个峰值振幅、宽度和延迟的分布除以平均值(注意对数刻度)。黑线:对数正态概率分布函数,平均值=0,标准偏差=0.22(D)、0.13(E)和0.11(F)。显示了原始(非对数)分布的变异系数(CV)。
我们在细胞分裂后分析了100多对姐妹细胞(见材料和方法)。我们发现,分裂后几个小时内,姐妹细胞之间的Mdm2-YFP动态相关。这种相关性平均在约11±5小时内降低了50%(图5B)。在这些细胞中未观察到动力学与细胞周期的显著相关性。
一些单元格显示非振荡波动
我们发现,一部分受照细胞和未受照细胞的Mdm2-YFP信号具有缓慢变化的波动,不类似于振荡(和补充图S2). 根据傅里叶分析和俯仰探测方法确定,波动相当缓慢,典型的时间尺度为8-12小时(). 波动最多显示2-3个此类峰值,而不是持续振荡(和补充图S2). p53-CFP中也观察到类似的波动(数据未显示)。表达YFP融合蛋白(YFP与组蛋白H2AZ融合)的对照细胞没有出现这种波动(数据未显示)。
具有约5.5小时振荡的细胞比例随γ剂量增加而增加
我们还测量了不同辐照剂量下的动力学。当以0.3或5 Gy的剂量进行γ射线照射时,部分细胞显示出周期约为5.5 h的振荡,类似于10 Gy实验中的振荡。我们使用基音检测来估计特征周期为4–7小时的细胞比例。我们发现,执行Mdm2-YFP振荡的细胞比例随着γ剂量的增加而增加(). 对于所有辐照剂量,这些细胞中的振荡通常显示出许多峰值,并且没有衰减。单个细胞的平均振幅和振荡周期似乎与辐照水平没有显著的依赖性(补充图S5).
姐妹细胞核Mdm2-YFP荧光动力学。(A类)电影中分裂细胞的Mdm2-YFP荧光强度动力学。Mdm2-YFP荧光在分裂前显示为黑色,在两个子细胞中显示为蓝色和绿色。右下角面板中的一个细胞经历了第二次分裂,第二代细胞显示为青色和紫色。顶部的三个面板显示了暴露于0.3 Gy伽马辐射的细胞(在时间零点),底部的三个板显示了暴露在5 Gy伽玛辐射下的细胞。(B)作为除法后时间的函数,112个姐妹细胞对之间的平均相关性(秩的归一化平均差,见材料和方法)。红线:指数拟合,C类=2−t吨/τ,τ=11h。
几个模型家族可以产生观测到的振荡,并显示出一致的生化参数值
我们考虑了p53–Mdm2反馈回路的几个数学模型。由于目前对系统的了解不完整,我们分析了最简单的可能模型,目的是了解模型族的一般属性。我们的动机是找到一个简单的模型,能够捕捉到许多细胞中无阻尼和噪声振荡的特征。
我们检查了六个模型家庭(和). 所有模型都包括负反馈回路,其中p53表示为x个,转录激活Mdm2,表示为年活性Mdm2增加了p53的降解速率。
p53–Mdm2反馈回路的模型。(A类)六个模型系列(见正文和表I)。(B)模型使用表II中的参数和初始条件获得的确定性或“无噪声”动力学,ξ(t吨)=1. 面板按照A部分进行订购(C–E)通过这些模型获得的蛋白质生产速率ξ中有噪声的动力学示例(t吨). 噪音ξ(t吨)用于每个管路的,对于所有型号都是相同的,并且在顶部面板中显示了每个管路。噪声是以随机相位的高斯波包形式产生的(补充图S7),周期以1 h(C)、12.5 h(D)和50 h(E)为中心,平均值(log[ξ(t吨)])=0,STD(对数[ξ(t吨)])=0.4和STD(ξ(t吨))≈0.5. (F类)连续峰值振幅之间的平均相对差(Δ小时/〈小时〉),作为噪声周期的函数。
其中三个模型是延迟振荡器(I、III和IV)(米哈拉斯等, 2000;Goldbeter,2002年;蒂娜等, 2002;Monk,2003年). 这些模型的数学细节不同,它们描述了x个和年以及年在x个模型I包括Mdm2前体,表示为年0,例如表示Mdm2 mRNA,以及年在x个在这两种情况下均由一级动力学描述x个和年.在模型四中年在x个是非线性的,并由饱和迈克尔斯-曼滕函数描述。在模型III中,Mdm2前体年0这使得Mdm2的产生速率直接取决于早期p53的浓度。最新模型妈妈等(2005年)和瓦格纳等(2005年)结合了III型和IV型的特点。
除了三个延迟振荡器外,我们还考虑了两个弛豫振荡器(II和V)(威廉和海因里希,1995年;默里,2003年;波美拉宁等2003年;泰森等2003年;奇利贝托等, 2005). 在这些模型中,负反馈回路由p53上的正反馈回路补充。这个正反馈回路可能以一种简化的方式表示额外的p53系统成分的作用,这些成分对p53具有总的上调作用(哈里斯和莱文,2005年). 这种模型最近由奇利贝托等(2005年)我们考虑了线性正调节(模型V)和基于饱和函数的非线性调节(模型II)。
这些模型(I–V)虽然在细节上有所不同,但依赖于单个负反馈回路。最后一个模型(VI)是一种新颖的检查点机制,它使用两个负反馈回路,一个是直接反馈回路,另一个是影响p53上游调节器的较长回路。在这个模型中,p53下游的蛋白质抑制了p53上游的信号蛋白(详见补充信息;巴宁等, 1998). 为简单起见,该抑制剂的模型如下年,但它不一定是Mdm2,也可以代表具有类似动力学的不同蛋白质。该模型预测上游元素(例如磷酸化ATM)也会经历振荡动力学(参见附录补充信息和补充图S9). 该模型的灵感来自于p53的上游调节器,即磷酸化ATM的观察(Bakkenist和Kastan,2003年)它对双链DNA断裂(DSB)作出反应,在一组测定蛋白质损伤后6小时的蛋白质动力学的Western blot实验中,显示了应用辐射模拟药物(NCS)后的活性脉冲(巴宁等, 1998;Stommel和Wahl,2004年).
我们对所有六个模型进行了广泛参数的数值求解。我们选择的参数值(表II)最好地再现了γ射线照射后核p53-CFP和Mdm2-YFP的有效平均单个细胞测量值,即振荡不会显著减弱,峰间时间恒定(补充图S6). 注意,这种有效的单个细胞动力学不同于种群平均动力学,后者是一种阻尼振荡(补充图S2E).
模型I不能产生与实验观察到的类似的多重振荡。模型II和III中的振荡对参数非常敏感。表II中列出的一些参数的微小变化导致这些模型显示出强阻尼振荡(补充图S8). 这种敏感(非鲁棒)电路可能无法在嘈杂的蜂窝环境中正常工作(萨瓦乔,1976年;Barkai和Leibler,1997年;阿龙等, 1999;神灵族等, 2002;北野,2004).
相比之下,模型IV–VI可能产生持续或弱阻尼振荡(和补充图S6)在广泛的参数范围内(补充图S8). 重要的是,所有三个模型共享的大多数参数显示出非常相似的最佳拟合值。因此,这些模型可以提供有效生化参数的估计值,例如p53和Mdm2的产生速率和降解时间。参数的“共识”值如表II所示。在所有三个模型中,Mdm2降解率约为α年≈1小时−1,Mdm2成熟的时间约为1/α0≈τ≈1h,与Mdm2无关的p53,α降解率x个,可以忽略不计。模型还就β值达成一致x个和β年p53和Mdm2的生成率。
根据模型,增加Mdm2寿命或其成熟时间会导致较低的自然频率和较长时间周期的脉冲(补充图S8). 这可能有助于解释在没有伽马辐射的情况下观察到的低频波动()因为Mdm2在没有DNA损伤的情况下的寿命比其存在的情况下更长(Stommel和Wahl,2004年).
观察到的振荡幅度中的噪声被蛋白质产生速率中的低频波动捕获
确定性模拟无法捕捉细胞中观察到的振荡幅度的变化(,,以及). 因此,我们在方程中加入了内部随机性。我们发现,在我们的实验中观察到的振幅变化比频率变化更大的特征变异性,最好通过改变蛋白质产生速率来捕捉。生产率变化会改变振幅,但不会显著影响振荡周期(补充图S8). 相反,我们发现其他参数的变化,例如降解率,通常会导致振幅和周期的变化。
为了描述蛋白质生产速率的随机性,我们在蛋白质生产术语中使用了乘法噪声。以前对噪声的大多数理论分析都采用了快速波动的白噪声(麦克亚当斯和阿金,1997年;Thattai和van Oudenaarden,2001年;保尔森,2004;凯恩等, 2005;拉马纳森和斯温,2005年). 除了白噪声外,我们还使用了具有不同特征相关时间的噪声,包括在慢时间尺度上变化的噪声。这是受到最近观察到的启发,即单个细菌细胞之间的蛋白质生成速率存在显著差异,并且这种差异在细胞生成的顺序上具有很长的自相关时间(罗森菲尔德等, 2005).
我们首先使用了高频噪声(类似于白噪声),其中生产率随相关时间变化,从分钟到小时不等(). 这可能是由于随机转录和翻译导致的固有噪声(麦克亚当斯和阿金,1997年;Thattai和van Oudenaarden,2001年;埃罗威兹等, 2002;乌兹巴达克等, 2002;布莱克等2003年;艾萨克斯等2003年;保尔森,2004;拜奇凯伊等, 2005;科尔曼-勒纳等, 2005;戈尔丁等, 2005;凯恩等, 2005;沃尔夫森等, 2006). 生产率中的噪音越强,动态中产生的波动就越大。然而,即使是非常强的高频噪声(生产率为50%的STD),在所有六个模型中也只会导致振荡幅度的轻微变化。这些变化明显低于当前实验中单个细胞测量中观察到的变化。
接下来,我们引入了低频噪声,时间尺度为几个小时(例如12.5小时;). 我们发现在这种噪声下,振幅的变化比在高频噪声下大得多。变化程度与实验观察到的相似,振幅变化强烈,振荡周期变化较小。
最后,我们发现极低频噪声(例如50小时;)不会在振荡中产生强烈的可变性。看来振荡器只能放大接近其自然共振频率(约6小时)的噪声频率分量。我们发现,当噪声频率约为振荡器固有频率的两倍时,变化最大(),使得连续的峰值受到噪声的相反影响。
在生产率中带有低频噪声的模型显示出与实验中发现的动力学性质类似的动力学,包括偶尔的峰值损失。只有模型VI能够重现我们的观察结果,即p53和Mdm2峰值振幅只有微弱的相关性。其他模型在这两种蛋白质峰值的变化中具有强耦合性。
讨论
本研究检测了来自克隆的单个细胞中的p53和Mdm2动力学。我们发现无阻尼振荡有超过10个连续峰值,在DNA损伤后持续至少三天。动力学显示出显著的细胞-细胞变异性。一部分细胞要么没有反应,要么信号缓慢波动。进行振荡的细胞在峰值振幅上表现出较大的变化,而在振荡周期上表现出较小的变化。模型指出了振荡中的噪声来源:蛋白质生产速率的低频波动。
DNA损伤γ射线照射后的振荡周期约为5.5h,与γ射线照射脉冲同步。振荡细胞的数量随着伽马剂量的增加而增加,在10 Gy后达到约60%的细胞。一些细胞在电影中分裂。分区允许用户在细胞分裂事件中跟踪信息的传递。我们发现,分裂后振荡仍在同一阶段继续,这表明系统中的信息被传递到子细胞。然而,子细胞之间的相关性在大约11小时后消失。这种相关性的消失表明,可以根据过去的细胞状态来预测此系统中的细胞状态。
DNA损伤后的振荡具有明显的噪声特征。它们的振幅在峰值之间变化约70%。与振幅变化较大相比,振荡周期噪声较小,且变化率仅为20%。其他生物振荡器也有类似的特征。例如,在实验和模型中,蓝藻和成纤维细胞的细胞自主昼夜节律时钟显示出比时间变化更大的振幅变化(Barkai和Leibler,2000年;维拉尔等, 2002;米哈尔塞斯库等, 2004;长治等, 2004). 精确的周期和可变的振幅可能是其他生物振荡器的特征。
尽管定时相对精确,并且振荡最初与伽马辐射信号同步,但定时的变化导致峰值最终异相。因此,p53和Mdm2动力学在平均细胞群体的分析中表现为阻尼振荡,如免疫印迹。通过对当前单个细胞动力学进行平均,也可以看出这种平均效应,它显示出阻尼振荡,有2-3个可辨别的峰值(补充图S2E).
有趣的是,将目前的结果与我们之前仅跟踪细胞16小时的研究进行比较(拉哈夫等, 2004). 在该研究中,细胞在16小时内出现了零、一或两个p53峰值。随着γ射线照射,双峰细胞比例增加。因此数峰值的多少取决于γ剂量。本研究对细胞进行了更长时间的跟踪研究,结果表明,大多数细胞的振荡实际上持续时间较长,并且大多数振荡细胞在损伤后会出现许多峰值。我们发现分数振荡细胞的数量(Mdm2-YFP水平的周期为4-7小时)随γ剂量增加而增加。之前的16小时电影记录了一些具有一个脉冲的细胞,而目前的研究表明,这些细胞在延迟后通常会显示额外的脉冲(补充图S4). 这强调了扩展测量对于时间尺度较慢的动态系统的重要性。
振荡是如何产生的?与分析单个模型不同,系统当前知识的有限状态使得研究多个模型族,以了解动力学的一般特性是合适的。我们对几个模型族进行了理论分析。大多数模型都能产生振荡。模型表明,振荡中的噪声是由于蛋白质生产速率的随机性,而不是降解速率等其他参数的随机性。此外,观察到的振荡表明,蛋白质生产速率中的噪声具有缓慢变化的成分,相关时间为10–20小时。过快或过慢的内部噪声无法解释观察到的变化。负反馈回路是一个自然振荡器,在其自然频率附近放大噪声的频率分量,从而导致观察到的可变性。
本结果是在人MCF7细胞系的克隆群体中获得的,该细胞系稳定表达p53和Mdm2的荧光融合。在不表达异位融合蛋白的MCF7细胞的平均细胞中也发现了内源性p53和Mdm2振荡(Lev Bar-O或等, 2000). 这些癌细胞可能在p53调节的某些方面存在缺陷(沃伊特斯克和莱恩,1993年)和下游凋亡反应(乾尼克等, 1998). 因此,研究其他细胞类型很重要。例如,DNA损伤后数小时进行的Western blot显示,p53、Mdm2和p21在包括WS1人类原代皮肤成纤维细胞在内的多个细胞系中的表达达到峰值(Stommel和Wahl,2004年),人胶质母细胞瘤细胞(奥尼西等, 1999)和HCT116人结肠癌细胞(陈等, 2005). 这增加了这些细胞系中也可能发生振荡的可能性。重要的是将目前的单个细胞实验扩展到其他细胞类型,并尝试在监测p53系统动力学的同时监测DNA损伤。
这些观察提出的最有趣的问题可能是无阻尼振荡的生物学功能,假设它们也发生在具有内源性p53和Mdm2的正常细胞中。一个线索是,在其他应力响应系统中也发现了无阻尼振荡。最近在SOS DNA损伤响应中观察到具有可变振幅和精确定时的严格调节振荡大肠杆菌(弗里德曼等, 2005). 在NF-κB系统中发现高度可变的核-细胞质振荡(霍夫曼等, 2002;纳尔逊等, 2004). NF-κB和SOS调节因子LexA都参与了一个类似于p53–Mdm2的负反馈环基序。与p53系统一样,这些环嵌入了许多额外的相互作用中。上述系统中存在的振荡可能表明,振荡在应力或损伤响应中起着普遍作用。
本研究表明,γ射线照射后,p53–Mdm2系统中出现长时间无阻尼振荡。在振幅而非振荡周期中观察到显著的细胞-细胞变异性。一些细胞有缓慢的波动,与振荡不相似;振荡细胞的比例随着辐照剂量的增加而增加,但振荡幅度没有增加。建模表明,振荡中的噪声反映了蛋白质生产速率中缓慢的内部噪声。目前的方法结合了单个细胞的长期动态实验和模型家族的理论分析,可能有助于理解其他调节系统中的振荡和细胞-细胞变异性。
材料和方法
细胞系和构造
我们使用MCF7,即稳定转染pU265和pU293的人乳腺癌上皮细胞U280(拉哈夫等, 2004). 在pU265中,来自pECFP-C1(Clontech)的ECFP在p53 cDNA的最后一个密码子之后,在小鼠金属硫蛋白-1启动子(MTΔ156)下亚克隆(布林斯特等, 1982). 该启动子提供p53-CFP的基本恒定转录水平。选择p53-CFP的基本启动子是因为p53被认为主要在蛋白质水平而不是转录水平上调节(Michael和Oren,2003年). 用该启动子表达的CFP进行的对照实验显示,CFP的表达是恒定的,没有振荡。在pU293中,以基因组DNA为模板,通过PCR克隆hMDM2启动子,在第3外显子ATG位点上游产生3.5 kb片段,包括P1和P2(奥里纳等, 1992). 该启动子亚克隆到pEYFP-1(Clontech)(拉哈夫,2004).
定时显微镜
细胞在96周板或2 mm光学板(Nunc)的含10%胎牛血清(Sigma)的RPMI 1640培养基中保持在37°C。在显微镜下观察前1–2小时,将培养基更换为含有3%胎牛血清、HEPES和2 mM的RPMI 1640培养基L(左)-谷氨酰胺,缺乏核黄素和酚红(Beit Haemek,生物工业),以降低背景荧光。然后将细胞暴露于适当剂量的γ射线照射下(60钴,最小1.8 Gy−1). 发现DSB的数量与伽马剂量呈线性关系,每个细胞的平均DSB约为每Gy 30 DSB(邦纳,2003年). 在37°C的培养箱中,使用三种类型的倒置荧光显微镜系统观察细胞,分别表示为MS.I、MS.II和MS.III.MS.I:Olympus IX70和Photometrics Quantix 57冷却背光CCD相机,每20分钟用汞灯进行一次亮场、CFP和YFP曝光。MS.II:徕卡DMIRE2,配备哈马松ORCA-ER冷却背光CCD相机,置于37°C湿度和一氧化碳培养箱中2对照,仅使用相位对比度和YFP曝光,每10分钟用汞灯曝光一次。MS.III:尼康TE2000E2,配备哈马松ORCA-ER冷却背光CCD相机,置于37°C湿度和一氧化碳培养箱中2用氙灯每20分钟用相位控制仪、YFP和CFP曝光进行控制。
CFP滤波器组:激发436/20 nm,二向色分束器455 nm,发射480/40 nm。YFP滤波器组:激发500/20 nm,二向色分束器515 nm,发射535/30 nm。
在CO中平均细胞生成时间约为20小时2在没有伽马射线照射的情况下孵育的显微镜。我们发现,使用CFP和YFP照明超过3天的电影不会明显影响细胞形态或生成时间。
细胞追踪和荧光定量
MS.I中拍摄的细胞图像(和补充图S4):使用定制的Matlab软件(Mathworks Inc.)进行相对荧光分析和背景减影。使用Matlab中自定义的图形用户界面,在每个帧中手动标记每个细胞核的位置。四名不同研究人员的独立跟踪显示,这一手动步骤的误差小于5%。在没有细胞的手动标记位置测量背景荧光,并从核荧光中减去。测量细胞核内像素的平均荧光强度。不含CFP或YFP基因的野生型MCF7细胞的细胞自体荧光给出了一致且低的值,平均每像素25个CFP荧光单位,每像素1个YFP荧光单位,变异系数为~30%。在这些单位中,平均峰值振幅(从最小到最大的范围)为~45 CFP荧光单位(对于p53-CFP)和~8 YFP荧光单位(针对Mdm2-YFP)。
用MS.II拍摄的细胞图像(和,以及补充图S2)和MS.III:使用定制的Matlab软件(Mathworks Inc.)进行相对荧光分析和背景减影。使用MetaMorph™软件进行Nuclei识别和跟踪,并手动控制准确性。对细胞分裂前帧上的姊妹细胞(分别跟踪的细胞)进行比较,结果表明识别和跟踪误差约为2%。背景被自动删除。测量细胞核内像素的平均荧光强度。自动荧光(在YFP通道中)可以忽略不计。使用纯化的GFP溶液(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)在每部电影前后测量照明的不均匀性,并使用定制的Matlab软件(Mathworks Inc.)自动纠正。使用平均核荧光水平与衰减指数的经验拟合来校正漂白效果。独立对照组中,H1299细胞的组成核YFP表达被成像,表明该系统的测量误差和波动约为百分之几。
脉冲特性的统计分析
对MS.I的p53-CFP和Mdm2-YFP数据进行时域分析。在每个细胞的动态曲线中,使用定制的软件(Matlab)手动标记单独的表达脉冲。使用基于脉冲幅度和信噪比的标准识别单独的脉冲。分别减去每个脉冲的基线,以校正荧光定量中的缓慢变化噪声,该噪声可能来自细胞的缓慢变化的自体荧光。为了比较脉冲特性,将时域划分为长度为300–400 min的段,每个脉冲根据发生时的时间段独立分配一个序号。然后计算给定时间间隔内发生的所有脉冲的平均特性(和标准误差)(和补充图S5).
俯仰检测
分析从显微镜获得的每个细胞的强度信号,以检测振荡周期(1/频率)。我们使用了一种标准的方法来检测音高,用于语音和音乐处理(Rabiner和Schafer,1978年). 俯仰可以看作是振荡的基本频率。每个信号被分成128个样本的片段,带有一个滑动窗口,该窗口以8个样本为增量移动。对于每个窗口,计算加窗段的自相关,并将其归一化,以便零滞后时的自相关等于1。如果自相关值大于0.2,则检测自相关函数的第一个峰值,并将其识别为该窗口的基音周期。滑动窗口方法可以跟踪振荡周期中的时间变化。为了检测每个单元最显著的基音周期,我们将单独的分段周期分为10个仓,并选择最常见的周期。
姐妹间的相似性
在每个时间点,我们将电影中所有细胞的核Mdm2-YFP荧光水平从最低到最高进行排序,并将排序标准化为范围0-1。对于一对随机单元格,排名的绝对差异等于D类第页=平均1/3。对于每对姊妹细胞(分裂后),我们测量了两个姊妹细胞之间等级的绝对差异。我们计算了所有姐妹细胞对的平均值,作为分裂后时间的函数,在0.3、5和10 Gy的γ射线照射后,共有112对姐妹细胞对。这个平均差值,D类(t吨)发现随着时间的推移D类(t吨=0)~0.05(相当于20个单元格的电影中的最小等级差异)到D类(t吨>30 h)~0.3,接近非相关细胞之间的群体平均值。在,我们绘制了归一化姐妹对差异,D类′(t吨)=(D类第页−D类(t吨))/(D类第页−D类(0)). 在不同的姐妹细胞平均秩差测量值(如根平方差)和不同的细胞亚群(如仅暴露于0.3或5Gy的细胞)中,也发现了类似的结果(半相关时间为6–16h)。
致谢
我们感谢Michael B Elowitz的协助和贡献,感谢Arnold J Levine和Moshe Oren的鼓励讨论和建议,感谢Gareth L Bond、Gustavo A Stolovitzky、Lan Ma、John M Wagner和我们实验室的所有成员的评论和讨论。我们感谢欧洲委员会(COMBIO:LSHGCT-2004-503568)和魏茨曼科学研究所卡恩系统生物学基金的支持。
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