转座子介导的膜蛋白组装过程中Asn和Asp介导的跨膜螺旋相互作用

摘要

介绍

在真核细胞中，大多数α-螺旋膜蛋白在内质网膜中共翻译、折叠和低聚(冯·海因，2003). 初始插入步骤由Sec61转座子介导，这是一种异质复合物，形成一个蛋白质传导通道，用于将水溶性蛋白质分泌到内质网腔中，并将整体膜蛋白侧向分流到内质网上(Alder&Johnson，2004年；怀特和冯·海因，2004年)。

最近的一项工作是确定跨膜α螺旋插入内质网膜所需的序列特征(赫萨等2005年a)，我们用大量系统工程疏水模型片段（H片段）挑战Sec61转座子，并能够根据H片段的膜插入效率测量得出膜蛋白的第一个“生物”疏水性尺度。研究赫萨等（2005年a）专注于插入单个跨膜段；对天然但多跨膜蛋白的研究表明，至少一些跨膜螺旋需要与蛋白质中相邻的螺旋相互作用才能正确插入膜中(什考奇等, 1993；Lin&Addison，1995年；佐藤等, 2002；Heinrich&Rapoport，2003年；萨德利什语等, 2005). 可以想象，在转座子内或其附近可能会有一个氨基末端位置更高的跨膜螺旋，而进入的是一个羧基末端位置更大的跨膜螺，这使得这两个跨膜螺旋可能以成对而不是两个独立的螺旋的形式与周围的脂质分离(Heinrich&Rapoport，2003年；萨德利什语等, 2005)。

众所周知，天冬酰胺（Asn，N）或天冬氨酸（Asp，D）等极性残基之间的氢键可以驱动洗涤剂胶束和生物膜中的螺旋-螺旋相互作用(乔马等2000年；周等2000年,2001；格拉特科夫斯基等, 2001)在转座子介导的插入过程中，还可以促进螺旋发夹的形成(Hermansson和von Heijne，2003年). 然而，尚不清楚的是，螺旋间氢键是否以及在多大程度上可以驱动跨膜螺旋插入本身的过程，以及序列中两个螺旋之间的分离是否会影响任何这种相互作用。为了定量地解决这些问题，我们扩展了先前建立的系统方法(赫萨等2005年a)研究螺旋-螺旋相互作用对膜插入效率的影响。我们发现，通过位置特异性Asn-或Asp-介导的与相邻的、稳定插入的跨膜螺旋的相互作用，边缘疏水模型跨膜螺旋膜插入的表观自由能可降低高达1 kcal/mol。

结果

模型蛋白和拓扑分析

与早期关于蛋白质插入内质网膜的研究一样(Hermansson和von Heijne，2003年；赫萨等2005年a)，我们使用了大肠杆菌内膜蛋白先导肽酶（Lep）作为模型蛋白。Lep由两个跨膜片段（H1，H2）组成，这两个跨膜片段由一个短的细胞质环（P1）和一个大的C-末端细胞质结构域（P2；图1A). 表达时在体外在犬胰腺粗糙微粒体存在的情况下，Lep采用与大肠杆菌，N端和C端P2结构域均位于微粒体的腔中(尼尔森和冯·海因，1993年)。

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图1

先导肽酶模型蛋白。(A类)野生型先导肽酶（Lep）有两个跨膜螺旋（H1，H2）和一个大的腔域（P2）。它插入N中的粗糙微粒体_卢姆–C_卢姆方向。在这里报道的研究中，H2段被一般成分L的H2′段取代_19−n个N个_n个或L_19−n个D类_n个(n个=0、1或2），并将含有一个或两个Asn或Asp残基的19个残基长度的H片段（孵化）插入P2结构域。Asn-X-Thr糖基化受体位点（G1，G2）被引入H段两侧，如图所示。H段作为跨膜螺旋整合到内质网（ER）膜中的结构仅在G1位点（左侧）发生糖基化，而H段跨内质网膜转位的结构在G1和G2位点（右侧）发生糖基化。(B类)体外含有2N/17L H2′段和2N/9L/8A（N3N）H段的构建物在没有（−）和（+）狗胰腺粗微粒体（RM）的情况下的翻译（参见表1). 非糖基化、单糖基化和双糖基化形式的蛋白质分别由一个开环、一个填充环和两个填充环表示。对于这个构造，ΔG公司_应用程序=0.1千卡/摩尔(C类)为了测量H2′和H段之间天冬氨酸或天冬酰胺介导的相互作用的效果，对每个H段的两种结构进行了比较：一种结构具有均匀疏水的19-Leu H2′段（I），另一种结构带有H2′片段，其中一个或两个Leu残基被天冬氨酰或天冬氨酰基取代（II）。相互作用自由能表示为差值（ΔΔG公司_应用程序)在两个结构之间插入H段的表观自由能。在所示示例中，H段包含两个Asp残基和适当数量的Leu和Ala残基，以生成ΔG公司^（一）_应用程序≈0 kcal/mol.A、丙氨酸、丙氨酸；D、 天冬氨酸；五十、 亮氨酸；N、 天冬酰胺；T、 苏氨酸。

在我们最近的研究中(赫萨等2005年a)，我们引入了Lep的工程版本，该版本允许定量测量短多肽片段（H片段）的膜插入效率。简单地说，一个H片段被放置在P2结构域，H2跨膜片段下游150个残基(图1A). 此外，N连接糖基化的两个Asn-X-Thr（苏氨酸，T）受体位点被引入P2结构域：一个位于H2和H段之间，另一个位于H段下游。之后在体外犬胰腺粗微粒体存在下的翻译(图1B)，通过比较单糖基化（即整合）分子和双糖基化分子（即非整合）的组分来量化给定H段的膜整合程度，我们将其表示为膜插入的表观自由能（ΔG公司_应用程序; 参见方法）。

单个Asn–Asn和Asp–Asp对

为了测试Asn–Asn或Asp–Asp相互作用对H段膜整合效率的影响，我们比较了一对结构体，其中一个Asn或Asp位于H段的中间，另一个As或Asp位于H2′段的中间。如上所述，由Asn–Asn或Asp–Asp配对介导的H2′和H片段之间的相互作用应反映在Δ的变化中G公司_应用程序（即ΔΔG公司_应用程序根据H2′段中是否存在Asn或Asp残基，H段应与零显著不同。

对于具有均匀疏水性19-Leu H2′片段的构建物，设计的H片段1N/5L/13A和1D/7L/11A的膜插入效率由生物疏水性标度正确估计为50%左右，对应于ΔG公司_应用程序≈0千卡/摩尔(表1). 在H2′中引入一个Asn或Asp并未导致Δ显著降低G公司_应用程序对于1N/5L/13A和1D/7L/11A H段（ΔΔG公司_应用程序≈-0.1千卡/摩尔；表1；图2; 构造N和D；黑色条）。使用较短的55-残留环（白色条）也获得了类似的结果。我们还测试了在H2（CCH2）中引入信号肽酶裂解位点是否会影响1N/5L/13AH片段的插入效率，但发现与19L和1N/18L H2′片段相比只有微小差异(表1)。

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图2

H2′和H段中单个或成对Asn或Asp残基对膜插入的影响。H2′（ΔΔG公司_应用程序)对于不同的H段（参见表1用于序列）。黑条：H2′和H段之间的150个剩余环；白色条：H2′和H段之间的55个剩余环。凝胶显示两个D3D结构（H2′：19L；H:2D/12L/5A）和（H2’：2D/17L；H:2D/12L/5A；凝胶底部可见染料正面）。相应的ΔG公司_应用程序值为0.0和-0.9 kcal/mol(表1)和ΔΔG公司_应用程序=−0.9 kcal/mol（如条形图中D3D对的白色条所示）。A、 Ala，丙氨酸；D、 天冬氨酸；五十、 亮氨酸；N、 天冬酰胺。

讨论

虽然在大多数情况下，膜环境中的螺旋-螺旋结合似乎受紧密堆积界面之间的静电和范德瓦尔斯相互作用的控制(Curran&Engelman，2003年)极性残基如Asn、Asp、Gln（谷氨酰胺，Q）和Glu（谷氨酸，E）已被证明通过形成螺旋间氢键来驱动螺旋-螺旋结合(乔马等2000年；周等2000年,2001；格拉特科夫斯基等, 2001)并在转座子介导的膜插入过程中促进螺旋发夹的形成(Hermansson和von Heijne，2003年)。

通过分析在两个相邻的疏水片段（H2′和H）中放置零个、一个或两个Asn或Asp残基的模型蛋白结构，我们现在发现插入的自由能（ΔG公司_应用程序)只有当H2′和H段都含有两个Asn或两个Asp残基，且残基间距为三，而不是一个或五个时（即当它们在H2′段和H段中间隔一个螺旋匝时），边缘疏水H段的活性才显著降低；图2). 这些结果表明，在Sec61转座子辅助插入过程中可以形成螺旋间氢键，并且即使在插入环长150倍的情况下，H2′仍与转座子保持足够近的距离，为进入的H段提供氢键供体和受体位点(Heinrich&Rapoport，2003年；密特拉等, 2005；萨德利什语等, 2005). 虽然我们不能完全排除对我们的观察结果的其他解释，例如H2′中的Asp和Asn残基专门改变Sec61转座子的行为，仅间接影响H段插入效率，但我们认为H2′-H段直接相互作用更有可能是由于两个原因：（i）H2′段组成不影响纯疏水性3L/16A H段的插入效率，并且（ii）只有当Asp和Asn残基对在H2′和H段的一侧相邻时，才能看到强烈的H2′-H段相互作用效应(我,我+4个间距）。

Δ的最大减少量G公司_应用程序H2′和H段中的Asn–Asn或Asp–Asp对为0.5–1.0 kcal/mol，低于洗涤剂胶束中某些跨膜肽的氢键二聚化测量值1–2 kcal/mol(格拉特科夫斯基等, 2001；周等, 2001；洛米兹等, 2004). 这里测量的值是由较大的Leu残基包围的Asn和Asp残基的值，这可能是因为序列上下文对于侧链之间有效的氢键形成是次优的(道森等, 2003；杜拉等, 2004). 或者，当临界相互作用发展时，H2′和H段螺旋可能仍然部分暴露在易位通道中的水。

生物疏水性尺度最初推导背后的一个隐含假设是，Lep中H1–H2跨膜螺旋与H段之间的相互作用对后者的膜插入效率没有影响，或影响很小(赫萨等2005年a). 我们现在可以明确地研究这个问题。首先，对于非极性3L/16A H段，ΔG公司_应用程序在很大程度上独立于H2′的序列(表1). 其次，已知跨膜螺旋之间最强的氢键相互作用由Asn、Asp、Gln和Glu介导(周等, 2001); 然而，我们最多只能看到Δ的适度影响G公司_应用程序(ΔΔG公司_应用程序≈-1.0 kcal/mol），即使在可能存在两种螺旋间Asn–Asn或Asp–Asp相互作用的结构中。第三，野生型H1和H2跨膜螺旋中唯一潜在的氢键残基是H1中的两个Thr残基和H2中的一个Thr和一个Ser（丝氨酸，S）残基。与Asn和Asp相比，Thr和Ser都是膜中螺旋-螺旋相互作用的不良介质(周等, 2001；道森等, 2002). 我们的结论是，尽管在天然蛋白质中明显不是不重要，但螺旋间的相互作用(什考奇等, 1993；Lin&Addison，1995年；佐藤等, 2002；Heinrich&Rapoport，2003年；萨德利什语等, 2005)，在计算Δ时可作为二阶修正G公司_应用程序基于生物疏水性量表的数值(赫萨等2005年a,2005年b)。

方法

酶和化学品。所有酶、质粒pGEM1和T_N个T型^®快速转录/翻译系统来自新英格兰生物实验室（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）或Promega（美国威斯康星州麦迪逊）。³⁵S-标记的蛋氨酸、脱氧核苷酸和双脱氧核糖核苷酸来自GE Healthcare（瑞典乌普萨拉）。寡核苷酸来自Cybergene（瑞典斯德哥尔摩）和MWG Biotech（德国埃伯斯堡）。

DNA操作。如前所述，克隆了所有构件(Hermansson和von Heijne，2003年；赫萨等2005年a). 使用QuikChange进行定点突变以引入Asn或Asp残基^®定点突变试剂盒（美国加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）。为了缩短H2′和H片段之间的环，用生态RV和Spe公司I.在重新填充Spe公司用DNA聚合酶I Klenow片段定位，重新鉴定载体。通过重新引入缺失的丙氨酸残基，产生的移码被取消Spe公司我使用QuikChange网站^®定点突变试剂盒（Stratagene）。该过程导致Lep的残基131-226被删除。为了在H1–H2区域创建具有可切割信号序列的模型蛋白，在一组结构中，H2区域的C末端被修饰为…LIV₇₆SPSAQA+AY公司₈₁…，其中V₇₆和Y₈₁表示Lep残基，+号表示信号肽酶裂解位点(尼尔森等, 1994)在第二组中，整个H1–H2区域被前催乳素的信号肽取代(萨萨瓦奇等, 1982)，产生N端序列MDSKGSSQKGSRLLLVVSNLLCQGVVS+TPVCPNGPY₈₁…

体外膜插入效率的表达和量化。pGEM1中克隆的结构被转录并使用T_N个T型^®快速耦合转录/翻译系统（Promega）。然后，1μg DNA模板，1μl³⁵在反应开始时添加S-标记的蛋氨酸（5μCi）和1μl狗胰腺粗微粒体（日本兵库大学M.坂口幸一博士赠送的礼物），并在30°C下培养样品90分钟。使用SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳分析翻译产物，并使用Image Reader 8.1j软件在富士FLA-3000磷光成像仪上对凝胶进行定量。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶定量每个H段的膜整合程度(图1B)通过计算膜积分形式和非积分形式之间的表观平衡常数：K_应用程序=（f）_1克/（f）_2克，其中（f）_1克是单糖基化和（f）_2克双糖基化Lep分子的分数(赫萨等2005年a). 未糖基化物质的数量(（f）_0克)在这些实验中小于15%，在计算中被忽略。然后将结果转换为表观自由能ΔG公司_应用程序=−RT公司自然对数K_应用程序这种方法的合理性在于插入概率(=（f）_1克/(（f）_1克+（f）_2克))系统设计的H段遵循玻尔兹曼分布(赫萨等2005年a)，这意味着数据可以被视为两种实验可识别状态之间的简单划分：插入和移位。所有数据点都是至少两个独立实验的平均值。

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