新城疫病毒V蛋白与病毒发病机制相关并作为α-干扰素拮抗剂发挥作用

NDV全长cDNA的突变和突变病毒的恢复。

表达NDV Beaudette C全长抗原组的质粒pNDVfl已在前面描述过(24)并用于构建P基因编辑突变体。这个阿斯克我-萨克将含有来自pNDVf1的P基因编辑位点的II片段亚克隆到pGEM-7Z（+）（Promega，Madison，Wish）中Xba公司我和Hin公司dIII通过使用特定的底漆对Xba公司我和Hin公司dIII现场悬挑。通过PCR将突变引入P基因编辑位点，使用磷酸化引物对扩增含有阿斯克我-萨克II插入如前所述(6). 底漆P1（5′-²²⁹⁶GACCATAGGCTCTTTTAGCATGG公司²²⁷²-3′）和P2（5′-²²⁹⁷tAGCCCCAAGAGGGGACCACC公司²³¹⁹-3′; 小写字母表示突变），在编辑位置后的V阅读框中引入终止密码子，以生成V蛋白的C末端序列。同样，引物对P3（5′-²²⁸²gAAaGGCCTATGGTCGAGCCCCAAG公司²³⁰⁷-3′）和P4（5′-²²⁸¹ttagcattggacgatttattgctgtgagc²²⁵⁵-以同样的方式使用3′）引入两个核苷酸改变来破坏P基因编辑位点。引入的突变相对于P阅读框是沉默的。变异的阿斯克我和萨克切除II片段以替换pNDVfl中的对应片段。通过对各个全长克隆进行测序，确认存在引入的突变。如前所述，从这些全长质粒中回收突变病毒(24). 简而言之，HEp-2细胞在六孔板中80%至90%的汇合处感染MVA-T7，每个细胞有1个病灶形成单位。然后用编码NDV Beaudette C株NP、P和L蛋白的三种表达质粒和含有突变NDV cDNA的第四种质粒转染细胞。转染三天后，收集细胞培养上清液，进行简单澄清，然后用于感染新鲜HEp-2细胞。三天后，收集上清液并传递给DF1细胞，直到出现病毒特异性细胞病变效应（CPE）。回收的病毒在DF1细胞上进行斑块纯化，并在9天龄SPF鸡胚中繁殖，用作病毒库存。

恢复病毒的序列分析。

在序列分析之前，病毒株在DF1细胞中繁殖两次。使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，Calif.）从感染细胞中制备总RNA。通过对引物P5（5′-¹²⁰⁰GGAGACTTGGAGTAGTACGCT公司¹²²²-3′）用于逆转录和正向引物P6（5′-¹⁸⁵⁴全球气候变化框架¹⁸⁷⁵-3′）和反向引物P7（5′-²⁵⁵⁰CTACAGGTGGCTGGATATCC公司²⁵²⁸-3′）用于PCR。使用PCR纯化试剂盒（德国希尔登Qiagen）纯化得到的PCR产物，并使用自动测序器进行测序。

蛋白质印迹分析。

为了检测变异病毒中V蛋白的表达，使用标准方案对纯化病毒进行了Western blot分析。感染性尿囊液中的病毒通过Beckman SW28转子中的20%蔗糖缓冲液以21000 rpm离心90分钟来纯化。将病毒颗粒重新悬浮，与十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶负载缓冲液混合，并在电泳前煮沸3 min。在12%的凝胶上通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的病毒蛋白，并将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，Mass.）。将膜与抗血凝素-神经氨酸酶（HN）单克隆抗体或V蛋白羧基末端18氨基酸特异性兔抗肽血清混合培养，清洗，然后与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠或山羊抗兔免疫球蛋白G抗体（IgG；马里兰州盖瑟斯堡Kirkegaard&Perry实验室（KPL）。蛋白质与四甲基联苯胺过氧化物酶底物（KPL）孵育后可见。

为了检测STAT蛋白降解情况，细胞以3倍感染率（MOI）感染各自的病毒或转染3μg表达质粒。20小时后收集细胞进行分析。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并用裂解缓冲液（6.25 mM Tris[pH6.8]，2%SDS，10%甘油，6 M尿素，0.01%溴酚蓝，0.01%酚红）进行裂解。用SDS-PAGE在7.5%凝胶上分离等量的细胞提取物，转移到硝化纤维素膜上，并与针对STAT1α-p91（C24）、STAT2（C20）的商业抗血清（加州圣克鲁斯生物技术公司）孵育。使用山羊抗兔IgG缀合物（KPL）检测蛋白质-抗体相互作用。

病毒在细胞和胚胎卵中生长。

DF1或Vero细胞以0.01的MOI感染病毒，并在37°C的DMEM中与5%胎牛血清孵育。在多周期生长条件下，每隔8小时采集上清液。通过DF1细胞上的斑块试验测定病毒滴度。简单地说，在无血清培养基中对病毒样本进行10倍的连续稀释，并在12孔板的每个孔中添加100μl的每个连续稀释液。吸附60分钟后，用含有5%胎牛血清、0.9%甲基纤维素的DMEM覆盖细胞，并在37°C下培养。感染后第三天，用甲醇固定细胞并用结晶紫染色以检查斑块。为了比较SPF鸡胚中病毒的生长，10^三将100μl体积的病毒PFU接种到不同胎龄卵子的尿囊腔中。收集尿囊液，并在接种60 h后混合，以通过菌斑试验进行病毒滴定。

干扰素敏感性分析。

在DF1细胞上测定了亲本和突变病毒对外源性添加的重组鸡IFN-α（chIFN-α）的相对敏感性。简单地说，在70%至80%汇合处的六孔培养皿中的细胞与不同浓度的chIFN-α（由康涅狄格大学斯托斯分校的Philip I.Marcus善意提供）一起培养。在37°C下培养24小时后，细胞被感染rBC、rBC/V-Stop或rBC/Edit，MOI为0.01，体积为100μl。水泡性口炎病毒（VSV）印第安纳株是一种已知的IFN敏感性病毒，作为阳性对照。用病毒吸附细胞2小时，去除接种物中残留的病毒，然后在含有5%胎牛血清的培养基中培养细胞48小时。通过DF1细胞中的斑块试验测定培养上清液中的病毒产量。

补体分析。

构建了两个编码V和W蛋白羧基末端的表达质粒用于互补分析。用正向引物P8（5′-atc）构建表达质粒pV通用标签gtaccatgGGGCCTATGGTCGACCAAGA-3′[大写字母表示NDV特异序列，粗体表示克隆位点，下划线部分表示翻译起始或终止密码子）和反向引物P9（5′-cgtctgcag公司TTACTTACTCTCTGTGATATATTGCC-3′），在编辑位点后扩增V蛋白的羧基末端部分。插入物包含一个Kozak序列（CGTACC）和一个用于优化翻译的起始密码子（ATG）(22). PCR产物被消化并克隆到pVAX1（Invitrogen）中Nhe公司我和Pst（磅/平方英尺）I.类似地，使用正向引物P10（5′-atc）通过PCR产生表达质粒pWgctagc公司gtaccatgGGGCCTATGGTCGACCAA-3′）和反向引物P11（5′-cgtctgcag公司CTACAGGTGCTGGACATGATCCG-3′）。结果克隆通过DNA测序证实。补体分析如前所述进行，略有修改(5). 根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）对DF1细胞进行瞬时转染。简单地说，用无血清Opti-MEM I冲洗80-90%融合处的DF1细胞两次，并用于转染。将表达质粒pV（3μg）和pW（1μg）单独或联合添加到含有250μl Opti-MEM I无血清培养基（Invitrogen）的试管中。质粒pVAX1主干用作阴性对照。将在250μl Opti-MEM中稀释的4微升Lipofectamine 2000试剂添加到含有DNA的试管中，并轻轻搅拌试管。在室温下培养15分钟后，向试管中添加600μl无血清培养基，并轻轻摇动试管进行混合。将DNA-Lipofectamine混合物覆盖在清洗过的DF1细胞上。在37°C下孵育6小时后，用Opti-MEM清洗细胞，并用补充有5%胎牛血清的DMEM进行再培养。转染24小时后，细胞以0.01的MOI感染亲本或突变病毒。感染细胞在37°C下培养48小时。通过菌斑试验测定培养上清液中的病毒滴度。

突变病毒在培养细胞中的生长。

利用鸡胚成纤维细胞衍生的DF1细胞系或猴肾衍生的Vero细胞系，比较了rBC、rBC/V-Stop和rBC/Edit病毒在多步生长条件下的生长特性。在DF1细胞中，我们发现缺乏V蛋白的病毒（rBC/V-Stop或rBC/Edit）的生长速度显著低于亲本病毒（图。​（图3A）。3A级). 感染2天后，rBC病毒的滴度增长到8×10⁷PFU/ml，而rBC/V-Stop和rBC/Edit的滴度仅达到8×10⁵PFU/ml（图。​（图3A）。3A级). 突变病毒在DF1细胞上产生的斑块较小（直径1-2 mm），边缘模糊，而rBC产生的斑块较大（直径3-5mm），边缘锐利（图。​（图3C）。3C公司). 相反，在Vero细胞中，缺乏完整的IFN-α/β系统的细胞系(9)，突变体病毒的生长速度与rBC病毒相当（图。​（图3B）。3B公司). 突变病毒和亲本病毒的滴度均达到10⁷Vero细胞感染2天后的PFU/ml。进一步检测了突变病毒和亲本病毒在原代鸡胚成纤维细胞和BHK21细胞中的生长速度。在这些细胞中，与亲本病毒相关的突变病毒的产生也被延迟，并且达到了比亲本病毒低100倍以上的最大滴度（数据未显示）。这些结果表明，缺乏V蛋白对携带完整干扰素系统的细胞中病毒的复制有害。

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图3。

组织培养中的生长动力学和斑块形成。图中显示了亲本rBC和突变病毒在DF1（A）或Vero（B）细胞上的多步生长曲线。数值来自两个独立的实验，每个实验一式三份。条形图显示标准偏差。（C） 感染后3天，亲本rBC和突变病毒在DF1细胞上的斑块形态。

不同胎龄SPF鸡胚中的病毒生长。

在不同孕龄的SPF鸡蛋中检测了rBC、rBC/V-Stop和rBC/Edit病毒的生长特性。简言之，孕龄6至14天的鸡胚通过尿囊途径接种，剂量为10^三PFU/鸡蛋，每种病毒每胎龄五个鸡蛋。接种后60小时，收集尿囊液，澄清，并在DF1细胞上滴定。我们的结果表明，亲本病毒能够在所有胎龄的胚胎中生长到高滴度，而突变病毒的滴度随着胚胎的胎龄而降低（图。​（图4）。4). 突变病毒在6日龄鸡蛋中的产量与rBC相当，但约为10⁵-14日龄鸡蛋的折叠倍数较低，表明鸡胚对突变病毒具有依赖于年龄的抗性。

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图4。

SPF鸡胚卵中rBC、rBC/V-Stop和rBC/Edit病毒的生长特性。2×10等份^三将亲代rBC或突变病毒的PFU以100μl的体积注入不同胎龄的胚胎卵子的尿囊腔。37°C孵育60小时后，收集尿囊液，通过菌斑试验对DF1细胞进行病毒滴定。从三个独立的实验中测定滴定度，每个实验用六个接种鸡蛋的尿囊液混合，条形图表示标准偏差。

编辑位点突变的病毒对外源性IFN-α/β更敏感。

突变病毒在干扰素活性细胞和先天免疫系统更发达的鸡胚中的复制严重受损。这些结果表明，突变病毒生长特性的改变可能部分是由于对干扰素-α/β抗病毒作用的敏感性增加。为了检验这种可能性，用更多的重组chIFN-α对DF1细胞进行预处理，以刺激宿主细胞抗病毒途径。在IFN启动24小时后，细胞感染rBC、rBC/V-Stop或rBC/Edit病毒，MOI为0.01。以已知的干扰素敏感病毒VSV作为阳性对照。感染后48小时，收集上清液，并通过菌斑试验测定病毒产量。

添加chIFN-α可显著抑制rBC/V-Stop和rBC/Edit病毒的产生。两种突变病毒对chIFN-α都表现出剂量依赖性的敏感性，只有100U的chIFN-α/ml导致10⁴-病毒产量减少了一倍，500 U的chIFN-α/ml导致10⁶-病毒产量减少了倍（图。​（图5）。5). 当用浓度为5000 U/ml的chIFN-α预处理细胞时，未检测到病毒复制。相比之下，亲本病毒rBC相对不受类似剂量的chIFN-α的影响，5000 U的chIFN-α/ml可抑制病毒复制，其滴度约为未处理对照样品的10倍。正如预期的那样，添加chIFN-α显著抑制了VSV的产量。这些结果表明，这两种突变病毒对外源性chIFN-α的抗病毒作用比亲本病毒更敏感。

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图5：。

编辑位点突变的病毒对IFN-α更敏感。用增加浓度的chIFN-α预处理DF1细胞24小时，并以0.01的MOI感染rBC、rBC/V-Stop或rBC/Edit。VSV作为对照纳入。感染后48小时，收集上清液并用于病毒滴定。结果是三个独立实验的平均值，条形图显示标准偏差。

V蛋白的羧基末端促进了变异病毒的体外生长。

除Vero细胞外，这两种突变病毒在细胞培养中均表现出生长受损的特性，这表明生长受损是由于V蛋白羧基末端部分的消除所致。因此，我们进行了互补分析，以检查V和/或W蛋白羧基末端部分的瞬时表达是否会促进突变病毒在细胞培养中的生长。用表达质粒pV和pW单独或联合转染DF1细胞。未插入的矢量主干用作对照。在转染后24小时用相应的病毒感染细胞。采集上清液进行菌斑试验，以确定感染48小时后的病毒滴度。结果表明，V蛋白羧基末端部分的单独表达可以促进突变病毒的生长，而质粒pW的表达对病毒的生长没有影响。pV和pW的表达与单独表达pV的效果相似（图。​（图6）。6). 互补分析清楚地表明，V蛋白的羧基末端在体外促进了突变病毒的生长，而W蛋白可能对NDV的生长作用很小或没有作用。

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图6。

NDV V蛋白羧基末端部分的瞬时表达增强了编辑突变病毒的生长。用表达质粒和3μg pV、1μg pW或pV与pW联合转染DF1细胞。空白质粒pVAX1用作阴性对照。转染后20小时，细胞感染了rBC、rBC/V-Stop或rBC/Edit，MOI为0.01。感染48小时后收集上清液，通过菌斑试验评估病毒滴度。标题反映了两个独立的实验，条形图表示标准偏差。

感染亲本而非突变病毒以及NDV蛋白C末端的表达优先降解STAT1。

已经证明SV5和腮腺炎病毒的V蛋白通过降解STAT1蛋白来阻断IFN信号传导，而hPIV2的V蛋白降解STAT2而不是STAT1(三,36). NDV在人2fTGH细胞中生长到高滴度并诱导典型的CPE。此外，与亲本病毒相比，该细胞系中突变病毒的生长受到严重损害（数据未显示）。因此，确定NDV对2fTGH细胞中STAT1和STAT2水平的影响很有意义。简单地说，细胞在高MOI下感染了亲本和突变病毒。细胞裂解物通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素膜上，并用STAT1或STAT2特异性抗血清进行检测。从感染SV5和hPIV2的2fTGH细胞制备的裂解物作为对照，分别显示STAT1和STAT2的降解。我们的结果表明，NDV感染导致STAT1蛋白的优先降解，而不是STAT2蛋白的优先降解（图。​（图7A）。第7章). 这两种缺乏V蛋白表达的突变病毒都未能降解STAT1蛋白。

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图7。

NDV感染优先降解STAT1蛋白。2fTGH细胞（A）或Vero细胞（B）被模拟感染或感染rBC、rBC/V-stop、rBC/Edit、SV5或hPIV2。感染后20 h，对全细胞提取物进行电泳，并通过免疫印迹法检测STAT1和STAT2以及病毒蛋白HN。肌动蛋白被用作加载控制。

突变病毒在2fTGH细胞中生长到较低水平，并且表达的病毒蛋白少于亲本病毒（图。​（图7A）。第7章). 然而，亲本病毒和突变病毒在Vero细胞中的生长水平相当（图。​（图3B）。3B公司). 为了排除其他病毒蛋白可能介导STAT1降解的可能性，我们比较了病毒感染后Vero细胞中STAT1和STAT2的降解模式。结果与2fTGH细胞的结果一致，表明NDV V蛋白在降解STAT1蛋白中的作用（图。​（图7B）。7亿). 已知Vero细胞在IFN合成中有缺陷；因此，我们的数据表明，NDV V蛋白的C末端部分通过降解STAT1蛋白发挥干扰素-α拮抗剂的作用。

为了测试V蛋白的表达是否直接降解STAT1蛋白，我们进行了转染实验。pW和空表达质粒pVAX1的转染并未导致STAT1或STAT2蛋白的减少，而pV表达NDV V蛋白的C末端降解了2fTGH和Vero细胞中的STAT1蛋白（图。​（图8）。8). 这些结果清楚地表明，NDV V蛋白的C末端通过降低STAT1蛋白的浓度来抑制IFN信号。

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图8。

NDV病毒蛋白C末端的表达降解了STAT1蛋白。将2fTGH细胞（A）或Vero细胞（B）模拟转染或用3μg空质粒pVAX1、pV或pW转染。转染后20小时裂解细胞。用SDS-PAGE分离裂解产物，将多肽转移到硝化纤维素膜上，并使用V、STAT1或STAT2蛋白特异性抗体进行免疫印迹。肌动蛋白被用作加载控制。

我们感谢彼得·柯林斯（Peter L.Collins）对这项工作提出的宝贵建议，感谢彼得·萨维奇（Peter Savage）和丹尼尔·洛克曼（Daniel Rockemann）提供的出色技术援助。

这项工作得到了美国农业部2002-35204-1601号拨款的部分支持。