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基因组研究。2006年12月；16(12): 1566–1574.
数字对象标识：10.1101/gr.5630906
预防性维修识别码：项目经理1665640
PMID：17122085

准确可靠的高通量检测人类基因组拷贝数变异

海克·菲格勒,1,6 理查德·雷登,1,6 丹·安德鲁斯,1,6 卡罗尔·斯科特,1,6 罗伯特·安德鲁斯,1 卡罗尔·卡德,1 理查德·克拉克,1 奥利弗·多维,1 彼得·埃利斯,1 拉尔斯·费克,2,三 丽莎·弗伦奇,1 保罗亨特,1 迪米特里奥斯·卡拉伊佐普洛斯,1 詹姆斯·拉金,1 林达尔·蒙哥马利,1 乔治·H·佩里,4 鲍勃·普拉姆,1 基斯·波特,1 雷切尔·里格比,1 黛安·里格勒,1 阿尔曼·瓦尔塞西亚,1 科迪利亚·朗福德,1 肖恩·亨弗莱,1 斯蒂芬·舍勒,2,三 查尔斯·李,4,5 马修·E·赫尔斯,1和奈杰尔·卡特1,7
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

这项研究描述了一种新的工具，用于准确可靠地高通量检测人类基因组中拷贝数的变化。我们构建了一个覆盖整个人类基因组的大插入克隆DNA微阵列，用于确定人类种群中拷贝数的变异。本研究的关键是开发一个稳健的阵列平台和分析过程，用于自动识别拷贝数变体（CNV）。该阵列由26574个克隆组成，覆盖93.7%的常染色区。克隆主要从已发表的“Golden Path”中选择，并通过指纹图谱和BAC-end测序确认映射。阵列性能通过一系列验证分析进行了广泛测试。这包括通过染色体特异性附加实验确定阵列上每个克隆的杂交特性。使用自-自杂交、重复实验和CNV的独立验证来评估数据再现性和假阳性/阴性率。基于这些研究，我们开发了一个基于方差的自动拷贝数检测分析过程（CNVfinder），并通过与SW-ARRAY方法的比较证明了其鲁棒性。

直到最近，人类和其他脊椎动物基因组中大规模拷贝数变化的重要性还没有得到足够的重视。2004年的两份报告使用DNA微阵列（array-CGH）进行比较基因组杂交，强调了这种正常拷贝数变异的普遍性(Iafrate等人，2004年;Sebat等人，2004年). 其他研究现已证实并进一步详细说明了人类和灵长类基因组中拷贝数变异（CNV）的程度(Newman等人，2005年;Sharp等人，2005年;Tuzun等人，2005年;Conrad等人，2006年;Perry等人，2006年). 确定CNV范围的关键是使用阵列CGH。在最初的研究中，使用的微阵列分辨率有限。Iafrate等人（2004年）使用商业BAC阵列，在基因组中大约每1Mb有一个克隆，而Sebat等人（2004年）使用有效分辨率>90kb的长寡核苷酸阵列。阵列技术的最新进展继续提高阵列CGH微阵列的分辨率。例如，使用DNA指纹重叠开发了一个大插入克隆集，从而可以生产分辨率为～60 kb的阵列(Ishkanian等人，2004年). 此外，现在可以获得具有多达385000个元件的长寡核苷酸阵列（例如，Agilent，Inc.，Nimblegen，Inc.），但使用这种类型的平台的阵列CGH通常是有噪声的，并且必须对多个探针进行平均才能调用CNVs(Ylstra等人，2006年). 尽管大插入克隆阵列优越的信噪比允许从单个克隆中调用CNV，但迄今为止，尚未对使用这种阵列的假阳性和假阴性调用率进行详细分析。

在这篇论文中，我们描述了用于在人类基因组中检测CNV的全基因组平铺路径分辨率阵列的构建(Redon等人，2006年). 克隆人主要是从用于生成参考人类序列的“黄金之路”中选择的(Lander等人，2001年)并经过了高水平的验证。此外，我们还开发了一种算法（CNVfinder），用于根据每次杂交中变异的估计值调用显著拷贝数变化，并针对Smith-Waterman方法测试了该算法的性能(Price等人，2005年). 为了对算法进行准确测试，我们使用不同的统计定义阈值对CNV调用进行了采样，并使用独立的方法对两个公开可用的正常DNA样本的单个比较进行了验证。这些数据允许估计CNV的假阳性率和假阴性率，这不仅需要本研究中测试的算法，也需要其他阵列CGH平台。

结果

克隆选择、验证和阵列构造

我们最初的一组26678个大插入克隆主要是从用于人类基因组测序的“黄金之路”中选择的(Lander等人，2001年). 与之前发布的32K克隆集（通过指纹重叠识别）相比，该集的优点是大多数克隆已经完全测序(Ishkanian等人，2004年). 在将克隆排列到玻片上之前，使用三种不同的DOP-PCR引物进行扩增。这种方法已被证明可以提高阵列CGH数据的可靠性和再现性(Fiegler等人，2003年). 所有克隆最初通过指纹图谱进行验证，随后通过末端测序进行验证。对于大多数克隆，映射位置得到了确认。然而，对于15.6%的克隆，末端测序失败或无法在参考序列上放置末端读取。由于这些克隆仅通过指纹验证，因此它们是通过原始序列映射的。通过末端测序发现7.3%的克隆存在差异映射位置，并重新分配这些克隆的位置。可以使用Ensembl基因组浏览器访问和下载克隆集和映射信息(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html) (Kent等人，2002年)通过激活图形概览中的“30K TPA克隆”装饰。

为了进一步验证芯片，使用染色体特异性附加实验评估所有克隆的杂交特性。这种方法使用自-自杂交，在“测试”探针中插入来自特定染色体的额外DNA副本。映射到特定杂交中的染色体的克隆将以线性方式响应额外的染色体拷贝数。大多数克隆对增加的拷贝数做出了预期的响应。在考虑染色体附加结果和选定的荧光原位杂交实验后，从分析中排除了104个没有反应或反应不当的克隆（0.34%）。

最终克隆选择和阵列性能

最终验证的26574个克隆覆盖了人类基因组中93.7%的常染色质，留下2237个缺口。从无法访问的文库中获得测序克隆的困难降低了19号和21号染色体的覆盖率（分别为68.4%的覆盖率和83.6%的覆盖率，其中有112个缺口和50个缺口）。

该阵列经过了一系列初始验证实验，包括使用来自正常个体的DNA进行自我和男女杂交。自杂交的所有比率的估计标准偏差在0.019和0.028之间(n个=4）、0.033和0.053，用于男女杂交(n个= 5).

对于每个克隆，我们计算了日志的标准偏差2来自四个自我实验的比率。这些标准偏差的分布是单峰的，中值为0.020（补充图1A). 此外，标准化日志的分布2比值方差（克隆方差/全局克隆方差×自由度）遵循χ2分布，正如从比率的基本正态分布中预期的那样（补充图1B). 这一分析表明，不存在固有噪音更大的克隆亚群。

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全基因组平铺路径阵列-CGH图谱。(A类)肾癌细胞系769P的阵列CGH谱。全基因组拼接路径阵列确定了3号染色体上先前未检测到的纯合子缺失（60.84-60.91 Mb，黑色箭头）。(B类)NA15510与NA10851的阵列CGH配置文件（复制A）。(C类)第14号染色体附加图谱。根据染色体位置绘制每个克隆的响应斜率。（灰色连续线）阈值为标准偏差的10倍，（灰色虚线）阈值是标准偏差的5倍（详见方法）。

我们还将一个广泛研究的肾癌细胞系（769P）的DNA杂交，该细胞系在其基因组中显示多个单拷贝增益和丢失。与之前使用分辨率为每1Mb一个克隆的阵列对该细胞系进行的分析相比(Fiegler等人，2003年)，平铺路径数组检测到所有先前识别的拷贝数更改，并对拷贝数更改断点进行了精细解析。此外，还发现了以前未检测到的变化，例如3号染色体上的一个小纯合子缺失（60.72-60.92Mb；图1A).

呼叫副本号变化

为了实现CNV的稳健自动分类，我们开发了一种基于每个阵列实验的比率方差的算法（CNVfinder）。该算法基于两个工作假设。首先，在表面上正常个体的全基因组图谱中，大多数观察结果都是围绕对数正态分布的2零比率（代表测试和参考基因组中的正常二倍体拷贝数）。这种中心分布可以用来很好地估计实验变异性（称为SDe）。其次，DNA拷贝数变化的结果是比率值超出了中心分布。

SDe的倍数可用于定义正负阈值，超过该阈值后，在没有拷贝数变化的情况下，比率不太可能偶然出现。我们使用这种方法开发了一种调用CNV的算法，这在方法中有详细描述。该算法的起点是通过计算基于染色体的染色单体-染色体绝对染色结合比的68.2百分位值来测量SDe。在正态分布中，68.2%的数值包含在平均值的±1标准偏差内。因此，68.2百分位值（SDe）提供了对标准偏差的估计，该标准偏差对外围值相对不敏感。作为对总体杂交质量的描述，我们将全球SDe定义为这些值的中位数。为了设置显著性阈值，我们使用技术复制经验确定SDe乘数的值，并使用复制自-自杂交和一组独立验证的CNV验证这些值。

在三个不同的日期，使用三个不同批次的阵列，对NA15510细胞系和参考细胞系NA10851进行了五次重复实验（A–E）。杂交示例如所示图1B按全局SDe排序，实验A和B显示出最佳的杂交质量（SDe=0.033），其次是实验C（SDe=0.036）、D（SDe=0.039）和E（SDe=0.053）。

我们调用显著拷贝数变化的目的是实现低误报率（<5%），同时最大化超出阈值的调用数。为了估计假阳性率，我们计算了针对不同阈值的变量较少的实验（A和B）中没有调用的变量较多的实验（C、D和E）中调用的次数。由于当多个相邻克隆报告这些变化时，较小的比率变化可以带来更大的信心，因此我们还研究了双阈值的使用，一个用于孤立的克隆调用，另一个用于连续的克隆调用。对于单个阈值，SDe乘数的最佳设置值为6(表1). 但是，为连续克隆调用增加了第二个较低的阈值，从而增加了调用数量，而没有额外的误报。单个克隆SDe乘数为6和连续克隆乘数为3的组合是最佳的。

表1。

使用不同SDe乘数阈值的重复实验中的呼叫数量和估计的假阳性率（NA15510与NA10851）

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一“调用数”定义为在实验C、D和E中以不同阈值检测到的区域的平均数。

b条“未复制百分比”报告了在C、D和E中调用但不在A和B中调用的区域的平均比例。

为了验证最佳阈值，我们将同一组阈值应用于一组独立的四个自-自实验。根据定义，CNV不能存在于自-自杂交中，我们不希望使用针对CNV检测优化的阈值进行调用。然而，在实践中，由于标记偏差和杂交伪影的差异，将进行少量调用。我们发现，使用6×/3×SDe的最佳双阈值，平均发出7.75次呼叫(图2A). 将连续克隆阈值增加到4 SDe将调用次数减少到4.5，相当于单个阈值为6 SDe。为了避免出现小的连续变化，我们决定对孤立克隆使用保守的双阈值设置，即6×SDe，对连续克隆使用保守设置，即4×SDe。

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在WGTP阵列验证实验中使用不同SDe乘法器阈值的CNVfinder性能。(A类)自我实验中与SDe乘数阈值相关的假阳性调用数。将不同的单/双SDe乘数阈值应用于四个重复自我实验，并计算平均呼叫次数。（黑钻石）表示单个SDe乘数阈值所调用的区域数，（灰色方块）表示双SDe乘法阈值所调用区域数。(B类)针对CNV数量的假阳性率和假阴性率要求在NA15510和NA10851实验中改变单/双SDe乘数阈值。假阴性和假阳性率基于154个样本克隆的定量PCR结果。

我们对6×/4×SDe双阈值的最终测试涉及通过短荧光片段定量多重PCR（QMPSF）或SYBR Green实时PCR对一组区域进行独立验证。这些区域是通过从两个重复实验（NA15510与NA10851）中随机抽取克隆子集来选择的，其中一个具有高SDe，另一个具有低SDe。我们根据SDe的倍数从4×到大于6×从五个间隔中选择克隆，每个重复间隔20个克隆。这种选择确保了克隆子集将包括高比例的CNV，但也包括不含CNV的克隆，以便估计假阴性率和假阳性率。共有154个克隆使用定量PCR检测CNV的存在（在两个重复中选择了46个克隆）。在123个选定地区发现了CNV（见补充表1详细信息）。

然后，在五个重复实验（NA15510与NA10851）中以不同的单阈值或双阈值对这组154个独立验证的克隆进行调用。计算了CNV呼叫的数量，并确定了假阳性和假阴性率(图2B). 正如预期的那样，更多的允许阈值会导致更多的CNV呼叫，更低的假阴性率和更高的假阳性率。假阳性率<1%（阈值为7×SDe）时，只能调用42个CNV，导致假阴性率为62%。相反，使用6×/3×SDe的双阈值，检测到86个CNV，假阴性率为33%，假阳性率为3.2%。我们的最终双阈值，6×/4×SDe，能够平均检测64个CNV，假阳性率为2.2%，假阴性率为38%(表3A，参见下文）。低的假阳性率表明，使用这些阈值进行的绝大多数呼叫将代表真实的CNV。较高的假阴性率可以在一定程度上解释，因为定量PCR具有由扩增子大小定义的分辨率，而阵列具有由克隆插入定义的较低检测限。因此，定量PCR将检测到太小而无法在大插入克隆中产生可检测到的比率变化的CNV，特别是对于可变杂交。由于阈值的绝对值与SDe成正比，因此随着实验可变性的增加，调用小比率变化（较小CNV）的能力降低。

表3。

CNVfinder算法与SW-ARRAY分析的性能比较

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使用具有6×/4×SDe双阈值、SW-ARRAY-permissive和SW-ARRA-stringent的CNVfinder进行的五个重复实验（A–E，按SDe排序）中调用的区域数分别在A、B和C中报告。

一假阳性率=调用但未验证区域的数量/测试区域的总数。

b条假阴性率=未调用但已验证的区域数/测试区域总数。

CNV呼叫的最终合并

应用双6×/4×SDe阈值来复制实验，突出了定义CNV的另一个问题。我们发现，在低SDe的实验中调用的CNV在高SDe复制中经常变得支离破碎。由于重复内容、序列同源性和实验变异的不同，一些克隆对特定拷贝数的变化反应不足，可能无法在更高的SDe实验中调用，从而使CNV片段化。最终调用算法（CNVfinder）允许对比率大于3×SDe的被调用区域进行限制扩展，并允许在该区域内合并单个非连续的未调用克隆(图3; 有关详细信息，请参见方法）。

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CNVfinder定义CNV边界。在三种不同的杂交中检测到3号染色体上的一个CNV，证明了CNV边界的一致检测。首先，高于双6×/4×SDe阈值的克隆称为（红色条）。其次，CNVfinder允许使用3×/1×SDe（蓝色条，请参阅图5详细信息）。6×/4×SDe阈值显示为虚线（6×SDe）和虚线（4×SDe）。

假阴性率估计

使用最终版本的CNVfinder，我们通过对10个不同细胞系DNA进行三个独立的重复染色实验来估计假阴性率。实验在不同的日期和使用不同批次的阵列进行。每个细胞系的三个重复实验是根据被调用区域的总数进行排序的。生成了三个数据集，集合X包含调用次数最多的10个重复，集合Z包含调用次数最少的10个复制，集合Y包含剩余的10个副本。

正如所料，集合X中的全局SDe最低（平均0.035），集合Z中的SDe最高（0.045）。此外，三个重复实验中只有一个区域在集合X中被调用的比例（29.9%）高于集合Y（17.3%）和集合Z（13.1%）。对于每个细胞系，我们计算了在复制X和Y中调用的区域的比例，但在复制Z中没有(表2). 在最坏的实验中，估计的假阴性率平均为31%（范围：16%-51%）。

表2。

用10个选定细胞系的三个重复实验估计假阴性率

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这个假阴性率代表了实验中未被调用但可能被WGTP平台检测到的CNV的比例。为了研究WGTP阵列无法检测到的CNV的数量和性质，我们将270个HapMap样本的结果与使用Affymetrix基因芯片人类映射500K早期访问（500K EA）阵列获得的结果进行了比较(Redon等人，2006年). 我们发现，WGTP平台仅检测到500K EA平台上识别的大小小于80 kb的CNV的18%，但检测到大小在80到150 kb之间的CNV中的51%，以及大小大于150 kb的CDV中的90%。此外，WGTP阵列能更有效地在基因组的复杂区域（如片段复制区域）识别较大的CNV（参见Redon等人，2006年用于更详细的比较）。

CNVfinder与SW-ARRAY的比较

为了衡量CNVfinder相对于其他算法的有效性，我们首先测试了SW-ARRAY(Price等人，2005年)和DNA副本(Olshen等人，2004年). 我们发现这两种方法都给出了非常相似的结果，但DNAcopy的计算代价更大。因此，我们使用同一组实验将SW-ARRAY与CNVfinder进行了比较。

SW-ARRAY方法应用了Smith-Waterman算法(史密斯和沃特曼1981)在一组有序数组对数比值中标识段。在这种方法中，可以调整两个参数来调整其灵敏度。首先，应用数据转换通过减法（中值+）调整输入数据(常数×中位绝对偏差））。这分离出阳性比率的CNV。反转比率符号以分离负比率CNV后，在数据集上重复该过程。常数的不同值，常量，允许调整呼叫灵敏度。其次，一个分数与每个CNV相关联，即CNV内比率的总和。通过该得分值进行筛选，可以从每组输入数据中对最明显的CNV进行排序和选择。我们将此分数修改为每条染色体的中位数绝对偏差的倍数，因此允许在不同方差的染色体之间使用单个阈值。

不同参数对的相对灵敏度通过生成接收算子（ROC）曲线与定量PCR-验证克隆数据确定。ROC曲线由常数范围为0到5的值和范围为0至100的分数筛选值。利用ROC曲线，选择最佳参数集作为调用CNV数量最大化的点，同时保持假阳性率<5%。最后选择了两个参数集：允许集(常数=3，分数过滤器≥3）和严格集(常数=3，分数过滤器≥5）。总的来说，该方法对这些参数的微小变化（未显示数据）是稳健的，尽管值得注意的是常数值几乎比最初使用的值大一个数量级Price等人（2005）对于独立验证实验中包括的克隆（NA15510对NA10851），使用两个SW-ARRAY设置（允许SW ARRAY和严格SW ARRAY）和CNVfinder的CNV调用的摘要如表3.

使用SW-ARRAY-允许算法发现的克隆数量最多（87.4/154），尽管假阳性率最高为4.9%，但假阴性率较低为28.0%。性能最差的算法是SW-ARRAY-stringent（58.2/154次调用，误报率2.2%，漏报率44.3%）。

然后，我们将三种算法应用于NA15510细胞系与参考细胞系NA10851的五个复制实验，以测试不同SDe对CNV调用的影响。对于每个复制，我们计算了在三个或四个其他复制中、在一个或两个复制中或在任何其他实验中未调用的调用次数，并将这些值与复制的SDe进行了比较(图4A、B、C).

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CNVfinder与SW-ARRAY的比较。使用CNVfinder调用CNV(A类)，SW-ARRAY-允许(B类)和SW-ARRAY-stringent(C类)在五个重复实验中。根据全局SDe值绘制三个或四个副本（黑色菱形）、一个或两个副本（灰色三角形）或其他副本中无副本（白色圆圈）中调用的区域数。(D、 E、F)使用CNVfinder调用CNV(D类)，SW-ARRAY-允许(E类)和SW-ARRAY-stringent(F类)在10种不同细胞系DNA的三次重复实验中。复制实验被合并到三个不同的集合X、Y和Z中（参见表3). 然后，根据每个集合的全局SDe值的平均值绘制两个其他复制（黑色菱形）、一个其他复制中（灰色三角形）或无复制中（白色圆圈）调用的区域数。

对于最低的SDe杂交，允许SW-ARRAY的克隆抗体数量最多，但最少的克隆抗体出现在至少四个重复中（176个克隆抗体和35%的克隆抗体发生在五个重复中的四个重复）。SW-ARRAY-stringent的相应值为100个CNV和42.5%在五个重复中的四个重复中调用，而CNVfinder的相应值则为82.5个CNV，58.2%在五个复制中调用。不出所料，随着SDe的增加，呼叫数量减少。在较高的SDe下，CNVfinder继续调用的CNVs少于SW-ARRAY，但在五个重复中有四个重复（88.6%）调用了CNVs，而SW-ARRA-strengent为69.8%，SW-ARRA为44.4%。我们的结论是，虽然CNVfinder调用的CNV较少，但在不同SDe的实验中，其性能更加一致。

对来自HapMap收集的10个不同细胞系DNA的三个独立复制染色实验进行了类似的分析(图4D、E、F; 见补充条款表2详细信息）。在该分析中，根据调用次数对重复进行排序，并将其组合生成前面描述的三组X、Y和Z。虽然值得注意的是，SW-ARRAY-permissive算法的最高调用次数仅在一次实验中发现，但也获得了类似的结果。同样，CNVfinder在不同SDe的实验中给出了一致的结果，特别是当SDe较高时，倾向于只调用高度复制的CNV。

我们认为，避免CNV的虚假调用非常重要，因为这些验证将耗时且昂贵。因此，以较低的误报率生成重复性高的呼叫，要比调用数量较多的CNV并伴随着误报绝对数的增加要好。总的来说，我们认为CNVfinder在这方面比SW-ARRAY表现更好。

结论

从大插入克隆阵列中识别CNV需要一个经过验证的克隆集和一种客观准确的方法来检测显著的拷贝数变化。我们的全基因组瓦片路径克隆集不仅通过指纹图谱和末端测序进行了验证，而且还通过使用控制“附加”杂交进行验证，该杂交允许直接评估克隆杂交特性。这些阵列的混合质量各不相同，因此用于检测CNV的方法对测量变化的差异具有鲁棒性很重要，特别是对于假阳性呼叫。我们的CNVfinder算法是使用一系列不同质量的重复杂交进行训练的，并使用独立验证的CNV来最大限度地增加呼叫数量，同时将假阳性保持在<5%。重要的是，与SWarray相比，CNVfinder在具有不同比率方差的阵列之间进行了更一致的调用。我们发现，使用CNVfinder，SDe较高的实验倾向于产生更多的假阴性，但假阳性没有增加。

总之，CNVfinder是一种准确可靠的高通量检测人类基因组拷贝数变异的新工具。我们使用CNVfinder检测人类人群中的CNV，使用HapMap项目中广泛基因分型的270个细胞系的DNA。CNVfinder应该在与人类综合征相关的体质染色体失衡的研究中找到同等的效用。

方法

克隆选择和验证

共有26678个大插入克隆主要从已发表的“黄金路径”中选择，以在平铺路径分辨率中覆盖人类基因组。由于只有RPCI-11 BAC文库的前两个片段可用于克隆选择，因此将不可用的“Golden Path”克隆替换为由相应DNA指纹或末端序列匹配确定的等效克隆。然后从RPCI-1、RPCI-3、RPCI-4、RPCI-5、RPCI-6、RPCI-13中挑选这些克隆（总共5344个克隆）(http://bacpac.chori.org/) (Kent等人，2002年)库，CalTech BAC库(网址：http://informa.bio.caltech.edu/Bac_info.htlm)和劳伦斯·利弗莫尔国家实验室图书馆(http://www.llnl.gov/图书馆/)在Wellcome Trust Sanger Institute举行。对于6号和22号染色体，BAC、磷酰胺和粘粒克隆由各研究所私下提供，以填补空白。对克隆进行T1噬菌体和假单胞菌属污染和指纹验证(Marra等人，1997年;Soderlund等人，2000年)和结束排序(Adams等人，2005年). 克隆信息可以从http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/cytoview.

使用已知的材料和末端序列将克隆位置映射到参考序列（Build NCBI35）上。末端测序验证了20967个克隆的定位。5611个克隆未能提供可映射到参考序列上的末端序列，但被提前用于阵列构建和进一步验证。最终验证集由26574个克隆组成。克隆集可以从BACPAC资源中获得(http://bacpac.chori.org/).

斑点克隆的制备

如前所述分离大插入克隆DNA(Marra等人，1997年;Humphray等人，2001年)并稀释至最终浓度1 ng/μL。对于阵列构建，使用引物DOP1、DOP2和DOP3在三个单独的DOP-PCR反应中扩增克隆DNA(Fiegler等人，2003年). 结合适当的DOP-PCR扩增产物后，使用5′-胺修饰引物进行二次PCR反应，该引物设计用于匹配每个DOP-PCR引物5′-末端的10个碱基。然后将20微升的4×微阵列斑点缓冲液（1 M磷酸钠缓冲液，pH 8.5，0.001%沙克糖）添加到88μL PCR产物中，并通过0.22μM Millipore Multiscreen GV滤板（Millipore）以2000 rpm离心10分钟进行过滤。

阵列定位

使用配备钨10K开口销（Genomic Solutions）的MicroGrid 610机器人，在HEPA过滤和湿度控制环境（40%-45%RH）下将阵列打印到CodeLink激活的载玻片上（GE Healthcare UK Limited），并在室温下干燥储存，直至使用。

用于杂交的基因组DNA

源自单染色体杂交细胞系的基因组DNA（杂交图谱#2；http://locus.umdnj.edu/nigms/maps/map02.html)亲本中国仓鼠（RJK88；NA10658）和小鼠品系（3T6；NA05862）的DNA和细胞系NA 15510的基因组DNA；NA 10851；NA 12144；NA 12239；NA 12892；18500纳；NA 18576；NA 18621；NA 18860；NA 18971；NA 18980；NA 19099来自DNA多态性发现资源库（Coriell Cell Repositories；http://ccr.coriell.org).

原代肾细胞腺癌细胞系（769P，ATCC编号CRL-1933）取自美国组织培养库（弗吉尼亚州马纳萨斯）。

阵列杂交

使用生物素标记试剂盒（Invitrogen）对试验和参考DNA样品进行差异标记，并修改核苷酸混合物。简单地说，建立了一个260μL反应，其中包含300 ng DNA和120μL 2.5×随机引物溶液。在100°C下变性DNA 10分钟后，将30μL 10×dNTP混合物（TE缓冲液中的1 mM dCTP、2 mM dATP、2 mM dGTP和2 mM d TTP）、3μL 1 mM Cy5-dCTP或Cy3-dCTP（NEN生命科学产品）和6μL Klenow片段添加到冰上，最终反应体积为300μL。将反应在37°C下培养过夜，并通过添加试剂盒中提供的30μL停止缓冲液来停止反应。根据供应商的说明，使用Microcon YM-30过滤装置（Millipore）去除未结合核苷酸。

在帝肯HS杂交站（帝肯集团有限公司）上使用63×20-mm的培养箱进行杂交。结合Cy3-和Cy5-标记的DNA，用270μg人类Cot1 DNA沉淀（Roche Diagnostics Ltd.），并重新悬浮在165μL杂交缓冲液中（50%甲酰胺，5%硫酸葡聚糖，0.1%吐温20，2×SSCl，10 mM Tris/HCl，pH 7.4，10 m M半胱胺）。通过沉淀100μL鲱鱼精子DNA（10 mg/mL，Sigma-Aldrich）并在165μL杂交缓冲液中重新悬浮，同时制备预杂交溶液。

然后在72°C下将预混合和杂交溶液变性10分钟。按照工作站上显示的说明，将预混合溶液注入帝肯室。预杂交期间（37°C下45分钟），杂交溶液在37°C培养。在37°C下以中等搅拌频率进行21小时的杂交。用PBS/Tween 20/2mM半胱胺（洗涤时间0.5 min，浸泡时间0.5 min、37°C下15个周期）、0.1×SSC（洗涤时间1.0 min，浸泡温度2.0 min、54°C下5个周期），PBS/Tween 20/2mM半胱氨酸（洗涤时间0.5min，浸泡时间0.5min、23°C下10个周期）和HPLC水（洗涤时间0.5,浸泡时间0.0,23°C时1个周期）清洗载玻片然后用氮气干燥2.5分钟。所有实验均采用DNA标记颜色反转（染料交换）重复进行。

染色体特异性添加实验

如前所述，对每一条染色体进行染色体特异性附加实验，并进行轻微修改(Fiegler等人，2003年;Rickman等人，2006年). 简言之，在标记匿名男性血液DNA（测试）以与相同DNA进行杂交之前，先将来自单倍体杂交细胞系或亲代啮齿动物菌株的DNA加标。对每条染色体进行了相当于一个和两个额外拷贝的染色水杂交。在计算组合的染料交换比率后，通过减去亲本对照杂交的染料交换比率来减少来自亲本细胞系DNA的物种特异性背景。然后计算所有克隆体对每条染色体额外拷贝的响应曲线斜率（参见图1C). 定义克隆反应类型的阈值是使用所有斜率的标准偏差的倍数确定的，不包括与尖峰染色体对应的克隆。将斜率低于标准偏差五倍阈值的克隆分配给加标染色体，则被定义为无应答。斜率大于标准偏差10倍的未分配到加标染色体的克隆被定义为应答者。如果克隆没有被分配到带穗染色体上，且斜率在阈值5到10倍标准偏差之间，则将其定义为交叉响应克隆。这些结果与末端序列和指纹信息相结合，以建立每个克隆的最终映射信息。有关更详细的描述，请参见补充文件1。

原始数据分析：基因组分析

阵列图像是使用安捷伦激光扫描仪（安捷伦科技）采集的。荧光强度和对数2使用Bluefuse软件（Bluegnome Ltd）提取比值。在标准化所有对数之前，排除低信号强度（两个通道中的“振幅”均<100）或荧光模式不一致（“置信度”<0.5或“质量”=0）的斑点2按块的比率值（子阵列）。

使用自定义Perl脚本将染色结果与后续分析进行融合。对于每个杂交个体，所有比率值的中位数是通过染色体计算的。然后用相应的染色体中位数对每个比率进行标准化。如果复制比率差异小于50%（即，小于对数上0.585的差异），则对两个染色-水洗杂交中每个克隆的比率进行平均2比例）。

然后逐条染色体计算所有组合比率绝对值的68.2百分位，作为标准偏差（SDe）的估计值。报告重复数差异超过SDe八倍的克隆被排除在进一步分析之外。

只有满足以下标准，CNV呼叫才接受染色实验：（1）全局SDe<0.06；（2） 全球克隆排除率<10%；（3） 单个染色体的克隆排除率<20%。标记包含在相应染色体中位数>0.1或<-0.1的染色体中的克隆，并将其排除在CNV呼叫之外。因此，女性和男性结果中的X染色体和Y染色体，以及染色体伪影（无染色体或非常大的不平衡）都自动排除在呼叫之外。

阵列图像、原始强度和标准化日志2比率可以从下载http://www.sanger.ac.uk/humgen/cnv/data/。所有验证结果也可以通过ArrayExpress获得(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)通过登录号E-TABM-123（自我和验证复制实验）和E-TABM124（附加实验）。

CNV调用算法

最初，为每个克隆分配一个分数（Si），反映其组合比率（cR）偏离中心分布：

  • 如果cR≥6×SDe或cR≤−6×SDe，则分别为Si=1或Si=−1。
  • 如果cR≥4×SDe或cR≤-4×SDe，则分别为Si=0.5或Si=0.5。
  • 如果cR≥3×SDe或cR≤−3×SDe，则分别为Si=0.25或Si=0.25。
  • 如果cR≥1×SDe或cR≤-1×SDe，则分别为Si=0.1或Si=0.1。

对每个染色体独立地进行所有随后的分析步骤，如图5.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1566fig5.jpg

CNVfinder算法。（#）如果基因组覆盖率出现缺口，只有当两个克隆最近的末端相隔<1.3 Mb的序列时，才认为这两个克隆是连续的。

定量聚合酶链反应

如前所述，使用短荧光片段定量多重PCR（QMPSF）进行定量PCR(Charbonnier等人，2000年)和SYBR Green方法。对于QMPSF，PCR产物的长度设计为120–210 bp。每个引物对中的一个引物在5′-末端标记有FAM部分，而另一引物的5′-端添加稳定的GTTTCTT尾部。以CFTR基因中的一个区域作为内部对照，使用正向引物5′-GGCC TGTGCAAGGAAGTGTA-3′和反向引物5’-gttttAGTC ACCAAGCTACC-3′。使用POP7聚合物在ABI3730×L基因分析仪（Applied Biosystems）上运行扩增的样品。使用软件GeneMapper v3.5分析结果。从NA15510和参考细胞系NA10851的DNA中扩增出每个候选CNV的一到三个区域。所有分析均一式三份。使用Student’st吨-测试以确定显著性。结果与P（P）<0.05被视为验证两个样本之间的拷贝数差异。如果在假定的CNV区域内设计了多个分析，则认为一个显著结果足以确认CNV的存在。

对于SYBR Green方法，PCR产物的长度设计为100–150 bp。以TP53基因的一个片段作为内对照，使用正向引物5′-CCCTTCC CAGAAACCTACC-3′和反向引物5’-CAGGCATTGA AGTCATGG-3′。样品使用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）在96 well板上的Bio-Rad-iCycler热循环上进行25μL反应，初始变性在93°C下2分钟，然后在93°C下进行40个周期，15秒，60°C下30秒。对于每个测试样品（NA15510）复制，使用2 ng基因组DNA。使用参考个体（NA10851）的基因组DNA稀释液创建标准曲线。试验碎片和TP53内对照碎片的试验样品一式三份，标准品一式两份。根据制造商的说明，根据测试片段和TP53内部控制片段的标准偏差计算出最终标准偏差，结果被认为足以确认NA15510相对拷贝号（至NA10851）时存在CNV与1显著不同，并基于95%置信区间（±2个标准偏差）与阵列CGH结果一致。

引物序列和定量PCR结果详见Redon等人，2006年.

致谢

我们感谢A.V.Cox、J.W.Stalker和J.Smith通过Ensembl、Wellcome Trust Sanger Institute的Shotgun测序团队42进行末端测序、Fengtang Yang和FISH核心小组进行额外的克隆验证，并感谢Chris Barnes在统计分析方面的帮助。这项工作由Wellcome信托基金资助。R.R.得到桑格研究所博士后奖学金的支持。

脚注

[补充材料可在线获取，网址：网址：www.genome.org.]

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.5630906

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文章来自基因组研究由以下人员提供冷泉港实验室出版社