肝X受体α（LXRα）和LXRβ是配体活化转录因子核受体超家族的成员，受胆固醇氧化衍生物（称为氧甾醇）的调节(13,20). 与细胞胆固醇水平低时诱导胆固醇生物合成的固醇反应元件结合蛋白（SREBPs）不同(2)当细胞胆固醇水平较高时，LXR的氧甾醇依赖性激活会诱导胆固醇分解代谢和/或流出。在啮齿动物肝脏中，LXRs积极调节胆固醇7α-羟化酶（Cyp7a）的表达，Cyp7a是胆固醇转化为胆汁酸的速率限制酶(25). LXR还通过诱导ATP结合盒（ABC）转运体ABCA1、ABCG1、ABGCG5、ABCG8和载脂蛋白E（ApoE）的表达来调节胆固醇的动员(6,17,27,29,40). ABC转运蛋白促进游离胆固醇跨细胞膜的转运，并在调节细胞胆固醇稳态中发挥重要作用(16,19,23). ABCA1、ABCG5和ABCG8被认为通过降低肠道吸收的胆固醇水平和增加从肝脏分泌到胆汁中用于排泄的胆固醇水平来减少饮食中胆固醇的吸收(29,42).
除了影响净胆固醇吸收外，ABCA1被认为在胆固醇反向转运中发挥重要作用，这是一种细胞将过量胆固醇转移到高密度脂蛋白受体的机制。ABCA1缺失会导致丹吉尔病，患者的循环高密度脂蛋白水平极低，巨噬细胞内胆固醇大量积聚，动脉粥样硬化风险增加(11,18). 在培养的巨噬细胞和骨骼肌C2C12细胞中，LXR的激活诱导ABCA1表达和胆固醇流出(5,24,34,39). 因此，LXR激动剂增加血清HDL水平的能力可能至少部分来自胆固醇逆向转运的增加。LXR对外周细胞、肝脏和肠道中胆固醇升高的反应共同导致胆固醇动员和分解代谢的总体净增加，从而使LXR成为治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化的药物靶点。为了支持这一发现，LXR激动剂最近被证明可以减少高胆固醇血症小鼠动脉粥样硬化病变的发展(15).
除了调节胆固醇稳态外，LXR的激活还可以调节脂肪酸代谢，从而导致血清和肝脏甘油三酯水平升高(28,33). SREBP1c是一种转录因子，调节许多编码脂肪酸合成酶基因的表达，是LXR的直接靶点(28). 除SREBP1c外，LXR激动剂还增加乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD-1）在肝脏的表达(28,33). 在缺乏LXR的情况下，与野生型小鼠相比，肝脏中某些基因的mRNA表达水平降低，表明LXR需要维持其基本表达水平(28).
LXRs以配体依赖的方式调节基因表达程序的机制仍相对未被探索。核受体通过向靶基因启动子招募辅活化蛋白来激活基因转录对配体的反应(8,22,30). 这些辅激活子通过组蛋白尾部的酶修饰（例如乙酰化）和招募基础转录机制来改变局部染色质结构。在缺乏配体的情况下，许多核受体通过招募辅抑制蛋白来抑制基因转录，例如核受体辅抑制蛋白（NCoR）(12)以及维甲酸和甲状腺激素受体（SMRT）的沉默介质(4). 辅阻遏物被认为通过拮抗辅激活物的作用（例如，通过相关的组蛋白去乙酰化酶活性）和招募建立染色质结构更具抑制性状态的因子来发挥作用。
在这里，我们报告了LXR的损失对甘油三酯和高密度脂蛋白代谢有不同的影响。与LXR相比+/+小鼠，LXR−/−小鼠血清中甘油三酯水平降低，高密度脂蛋白水平升高。对胆固醇流出和胆固醇逆向转运相关基因的分析表明，LXR可以以基因和组织特异的方式作为胆固醇逆向转运的激活剂和阻遏剂。一些证据表明，LXR靶基因的活性抑制至少部分是通过与辅抑制因子NCoR和SMRT的相互作用介导的，以抑制靶启动子的基础表达。在LXR中观察到LXR靶基因的选择性去表达−/−小鼠被提议反映LXR作为配体依赖性激活剂的不同启动子需求。我们的观察结果表明，转录抑制在胆固醇逆向转运和高密度脂蛋白代谢的调节中起作用。
材料和方法
动物和脂蛋白分析。
LXRαβ+/+（LXR+/+)和LXRαβ−/−（LXR−/−)小鼠（混合背景菌株A129-C57BL/6）(28)它们被安置在一个受控的环境中，可以随意获得饲料（Purina 5001）和水。在12小时光周期的中间，从8周龄雄性动物身上采集血液。血浆中的甘油三酯采用酶比色法测定（密苏里州圣路易斯市西格玛）。通过肝素锰沉淀剂沉淀非HDL胆固醇后，通过总胆固醇酶法（Sigma）测量血浆HDL水平（瓦科诊断公司，弗吉尼亚州里士满）。14个野生型和11个LXR−/−这些研究使用了小鼠。这个P（P）值为10−6甘油三酯和高密度脂蛋白测试的显著性分别为0.0003。
巨噬细胞分离。
如上所述获得骨髓来源的巨噬细胞(三,38). 腹腔注射巯基乙酸肉汤培养基4天后，从小鼠腹腔分离出巨噬细胞。
RNA分离、RT-PCR分析和Northern印迹分析。
使用RNeasy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen Inc.）分离总RNA。实时（RT）PCR分析是在ABI PRISM 7700序列检测系统上进行的，该系统使用由Primer Express（PE Biosystems，Foster City，Calif.）设计的目标特异性探针和引物。按照前面所述对样品进行分析(24). 对于Northern blot研究，使用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，Calif.）分离总RNA。在含有甲醛的1.2%琼脂糖凝胶中分离总RNA样品（每道10μg），并转移至GeneScreen尼龙膜（NEN，波士顿，马萨诸塞州）。探针标有[α-32P] dCTP（ICN，加州Costa Mesa），与Quikhyb（Stratagene，La Jolla，加州）进行杂交。将膜暴露于X-AR胶片（Kodak，Rochester，NY）。
胆固醇流出。
按照马斯喀特等人的描述进行流出分析(24). 简单地说，细胞与14C标记胆固醇48小时。然后用无血清培养基替换培养基，添加或不添加10μg ApoA1/ml以及配体或载体。24小时孵育后14测定培养基和细胞裂解物中的C。
瞬时转染。
根据制造商的说明，使用FuGene6（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）转染CV-1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。转染后5小时，将含有配体的培养基直接添加到细胞中。18小时后收获细胞，分析荧光素酶和β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性。荧光素酶活性归一化为β-Gal活性。这些分析中使用的GAL4-LXR基因结构编码全长人类LXRα和LXRβ。在双杂交分析中，人LXRα（氨基酸[aa]164至447）和人LXRβ（aa 155至461）的配体结合域融合到VP16激活域，人SMRT（ID1和ID2；aa 2131至2352）和人NCoR（ID1与ID2；AA794至1397）的受体相互作用域融合到GAL4 DNA结合域。
ChIP分析。
如前所述进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析(14,35). 简单地说，骨髓源性巨噬细胞用1%甲醛固定，并按上述方法处理(10). 将交联加合物重新悬浮并进行超声处理，得到200至1200 bp的DNA片段。使用以下抗体进行免疫沉淀：抗RXRα（加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）、抗NCoR（科罗拉多州Golden亲和生物试剂公司）、反SMRT（亲和生物反应公司）、抗乙酰化组蛋白H3（抗acH3；赖氨酸9和14乙酰化）（纽约州普莱西德湖Upstate生物技术公司，抗acH4（赖氨酸4、7、11和15的乙酰化）（Upstate Biotechnology）、抗上游刺激因子1（抗USF1；H-86）（Santa Cruz Biotechnology）和抗USF2（N-18）（Sanda Cruz biotechnoology）。兔免疫前血清（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）用作非特异性结合的对照。对于每次治疗和免疫沉淀试验，我们使用20×106巨噬细胞和1μg特异性抗体。蛋白质结合的免疫沉淀DNA在65°C下反向交联过夜，然后使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。从50μl DNA提取体积中提取4微升用于PCR扩增（25至30个周期）。表中所示的一组引物用于扩增作为本研究对象的基因启动子上的区域。
表1。
| 发起人 | 区域放大 | 底漆（5′至3′） |
|---|
| 澳大利亚广播公司1 | LXRE公司 | GCTTTCTGCTGAGTGACTGAACTAC公司 |
| | GAATTATGCTTTTTGCCGCG公司 |
| 固醇调节元件结合蛋白-1c | LXRE公司 | GAACCAGCGGTGGACACAGAGC公司 |
| | GACGGCGGCGCTCTCCGGGTTCTC公司 |
| RARβ2 | 罕见 | GTGAGAATCCTGGGAGTGTGGT公司 |
| | CAAAGAATAGACCCTCTGGC公司 |
| hsf2（高速f2） | | TCTGCCAGCCAGCGTGG公司 |
| | 全球气候变化大会 |
蛋白质印迹分析。
在含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂的溶液中，通过裂解细胞分离膜蛋白。对细胞进行三次冷冻和解冻循环，然后进行5分钟的微离心以去除细胞核，从而对细胞进行溶解。将提取物在含有5%β-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠凝胶加载缓冲液中在室温下培养10分钟，然后加载到凝胶上。斑点与特定抗体在4°C下孵育过夜。抗-ABCA1抗体购自Novus Biologicals（科罗拉多州利特尔顿），抗USF1（C-20和H-86）和抗USF2（C-20与N-18）抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
EMSA。
如前所述获得核提取物(32). 电泳迁移率变化分析（EMSA）如前所述进行(41). 简单地说，核提取物（2μg）与EMSA缓冲液[20 mM Tris（pH 7.9）、60 mM KCl、0.2 mM EDTA、0.5 mM二硫苏糖醇、1.3 mM MgCl孵育2，10%甘油，3%Ficoll，2μg聚（dI-dC）]，在4°C下保持15分钟。对于超位移实验，将0.6μg特异性抗体（圣克鲁斯生物技术）与混合物在冰上孵育30分钟。在[γ-32P] 数字CTP。使用的寡核苷酸序列如下：5′GGCGGCCATGTCCACGTGTCCT3′。然后将核提取物与放射性标记探针（2×10）孵育5在室温下保持20分钟。培养过程结束后，样品在0.25×三硼酸盐-EDTA缓冲液中用6%延迟凝胶（Invitrogen）进行电泳分离。凝胶干燥并进行放射自显影。
结果
在LXR中ABCA1表达以组织特异性方式上调−/−老鼠。
LXR血清脂蛋白分析+/+小鼠和LXR−/−小鼠（缺乏LXRα和LXRβ）维持在含有0.02%胆固醇的正常饮食中，证实LXR−/−小鼠的血清甘油三酯水平显著低于LXR+/+鼠标（图。) (33). 先前的研究表明，在缺乏LXR的情况下，肝脏SREBP1c、FAS和SCD-1的表达水平降低，这表明LXR是脂肪酸合成途径中基因基础表达所必需的(25,28). 因此，血清中甘油三酯的减少很可能是脂肪酸合成减少的结果。相反，在缺乏LXR的情况下，血清HDL水平升高（图。). LXR激动剂已被证明能增加血清HDL水平(33). 因此，在缺乏LXR活性的情况下观察到的高密度脂蛋白水平升高是矛盾的，这表明在缺乏激动剂的情况下，LXR可能会负向调节HDL水平。
LXRs作为ABCA1表达和胆固醇流出的激活剂和抑制剂发挥作用。（a） LXR表达对血脂的影响。LXR血浆样本+/+和LXR−/−对小鼠进行高密度脂蛋白和甘油三酯含量分析。星号表示LXR−/−值有显著差异(P（P）<0.001）与LXR相比+/+.血浆浓度。，血浆浓度；TG、甘油三酯。（b和c）LXR是腹腔巨噬细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达的激活剂和抑制剂。从LXR中分离出腹腔巨噬细胞+/+和LXR−/−如文中所示的鼠标。在用1μM T1317或载体培养细胞18 h后，用RT-PCR（b）和Western blotting（c）分析ABCA1 mRNA和ABCA1蛋白。通过RT-PCR测定的b组ABCA1 mRNA水平归一化为亲环素水平。（d） 在骨髓源性巨噬细胞中，无连锁LXR作为ABCA1和ABCG1表达的抑制剂发挥作用。在分离总RNA和使用所示探针进行Northern印迹分析之前，按照面板b所述处理细胞。（e） 未激活的LXR抑制腹腔巨噬细胞胆固醇流出。在测量ApoAI依赖性胆固醇流出量之前，按照b组所述对细胞进行处理。
新生HDL颗粒的成熟涉及游离胆固醇的摄取及其通过卵磷脂-胆固醇酰基转移酶酯化以构建胆固醇酯核心(36). 这种机制被认为是胆固醇逆向转运的主要途径，即外周细胞中多余的胆固醇被输送到肝脏进行胆汁排泄的过程。已知的LXR靶点ABCA1和ABCG1基因已被证明可以介导胆固醇从细胞流出到新生的HDL颗粒(16,18). 由于ABCA1的丢失显著降低了胆固醇流出量和HDL水平，我们检测了从LXR分离的巨噬细胞中ABCA1和ABCG1的水平+/+和LXR−/−老鼠。分离腹腔巨噬细胞，并用载体或LXR激动剂T0901117（T1317）进行培养处理(29)持续18小时，并检测ABCA1 mRNA和蛋白质水平。正如预期的那样，T1317治疗增加了LXR中ABCA1 mRNA和蛋白水平+/+巨噬细胞，但对LXR没有影响−/−巨噬细胞（图。). 载体处理的LXR中ABCA1 mRNA和蛋白水平也增加−/−巨噬细胞与LXR中的巨噬细胞的比较+/+巨噬细胞，表明在缺乏配体的情况下，LXRs可以抑制ABCA1的表达。对骨髓来源的巨噬细胞进行的类似分析显示，在缺乏LXR的情况下，ABCA1和ABCG1都会增加（图。).
由于ABCA1具有逆向胆固醇转运功能，我们研究了LXR对胆固醇流出的影响。与ABCA1 mRNA和蛋白水平相关，LXR激动剂治疗可增加LXR患者的胆固醇流出+/+巨噬细胞（图。). LXR基础外排水平的比较+/+和LXR−/−巨噬细胞显示，随着ABCA1和ABCG1的表达，LXR的基底外排增加−/−巨噬细胞。这些结果与以前的研究结果一致(5,29,40)提示在有配体的情况下，LXR可增加ABCA1的表达和胆固醇流出，而在无配体的条件下，LX可抑制ABCA1表达和胆固醇排出。
为了确定LXR是否在缺乏配体的情况下抑制其他靶基因，我们检测了SREBP1c、SCD的mRNA水平-1、脂蛋白脂肪酶（LPL）和载脂蛋白E在用于检测ABCA1表达的相同巨噬细胞中。正如ABCA1基因所观察到的，LXR中的所有靶基因都增加了+/+T1317处理的巨噬细胞（图。). 然而，LXR的缺失并没有降低SREBP1c、SCD-1、LPL和ApoE mRNA水平，这表明LXR介导的抑制是基因特异性的。
LXR介导的抑制具有基因和组织特异性。（a） LXR靶基因在LXR中的表达+/+和LXR−/−腹腔巨噬细胞经溶媒或1μM T091317处理。通过RT-PCR分析SREBP1c、SCD-1、LPL和ApoE水平，并将其归一化为亲环素水平。（b） LXR以组织特异性方式抑制ABCA1。LXR公司+/+和LXR−/−每天给小鼠灌胃给予赋形剂或10mg T1317/kg体重，持续7天。在本研究中，每组使用四只小鼠。分离MEF并用载体或1μM T1317培养处理。RT-PCR分析用于测定肠粘膜、肝脏、股四头肌和MEF中ABCA1 mRNA相对于亲环素的水平。
虽然巨噬细胞高度依赖胆固醇逆向转运来维持适当水平的胆固醇，但最近的报告表明，巨噬细胞仅占总HDL生成量的一小部分(9). 重要的是，ABCA1在许多其他组织中表达，包括肝脏、肠道和骨骼肌。因此，为了确定LXR是否激活或抑制其他组织中ABCA1的表达，在LXR中测量mRNA水平+/+和LXR−/−用载体或T1317治疗的小鼠。如图所示。LXR激动剂治疗以LXR依赖的方式增加肠、肝、肌肉和MEF中ABCA1 mRNA的表达。LXR载体处理组织中ABCA1 mRNA水平的比较+/+和LXR−/−然而，小鼠表明，肠粘膜是唯一一个检测到LXR缺失增加ABCA1基础表达的其他组织，这一发现与之前的研究一致(29). 对棕色和白色脂肪组织的类似分析表明，LXR的基础ABCA1 mRNA水平相同+/+和LXR−/−小鼠（数据未显示）。这些结果表明，LXR以组织特异性的方式抑制ABCA1的基础表达，出现在巨噬细胞和肠粘膜中，但在其他组织中没有。
LXR具有配体不可逆的抑制功能。
为了进一步探讨LXR的转录抑制作用，我们检测了GAL4-LXR融合子抑制合成GAL4报告子的能力。如图所示。在CV-1细胞中，将LXR招募到含有四个GAL4反应元件拷贝的合成胸苷激酶启动子中，导致在缺乏配体的情况下抑制基础转录。在添加LXR激动剂后，LXRα和LXRβ如预期一样激活转录（图。). 核受体已被证明通过招募共抑制蛋白如NCoR和SMRT来抑制基础转录(4,12). 因此，我们通过哺乳动物双杂交分析，使用来自NCoR和SMRT的受体ID以及LXRα和LXRβ配体结合结构域的VP-16融合，分析了LXR与辅助加压因子NCoR和SMRT相互作用的能力。在没有配体的情况下，LXRα和LXRβ都与辅加压体ID相互作用（图。). 正如预期的那样，在LXR激动剂的存在下，这种相互作用被抑制。为了进一步分析共抑制因子在LXR依赖性转录抑制中的作用，我们测量了从NCoR分离的MEF中GAL4-LXR融合子的抑制活性+/+和NCoR−/−胚胎(14). 正如在CV-1细胞中观察到的那样，未连接的GAL4-LXRα和GAL4-L XRβ抑制了NCoR中GAL4-荧光素酶报告子的基础表达+/+MEF（图。). 相反，LXR依赖性抑制在NCoR中显著降低−/−MEF，提示LXR介导的阻遏需要与共升压因子结合。激动剂的添加通过GAL4-LXRα和GAL4-L XRβ系统诱导荧光素酶报告子的转录激活（图。). 有趣的是，NCoR−/−与NCoR相比，MEF在用配体处理后显示出更高水平的报告活性+/+MEF做到了，这一发现与NCoR作为核受体介导转录的阻遏物的作用一致。此外，我们通过重建NCoR中NCoR的表达来进行救援实验−/−MEF公司。如图所示。，全长NCoR的过度表达恢复了GAL4-LXR抑制NCoR基底转录的能力−/−细胞。
LXR抑制基础转录并与辅抑制因子相互作用。（a） 在GAL4反应元件（4×UAS）的四个拷贝和空pCMX载体、单独含有GAL4 DNA结合域（DBD）的质粒或GAL4 DBD与全长LXRα或LXRβ融合的构建物的控制下，用荧光素酶报告子瞬时共转染CV-1细胞。然后用载体或1μM T1317处理细胞过夜。TK，胸苷激酶最小启动子；Luc，荧光素酶。（b） LXRα和LXRβ与NCoR和SMRT的核受体ID相互作用。通过将LXRα或LXRβ配体结合域的VP16融合物与NCoR和SMRT的受体ID1和ID2的GAL4融合物以及荧光素酶报告子在GAL4反应元件的四个拷贝的控制下瞬时共转染CV-1细胞，建立了哺乳动物双杂交系统。在测定报告活性之前，用激动剂处理细胞过夜。L.U.，荧光素酶单位。（c） LXR抑制需要NCoR表达。与NCoR隔离的MEF+/+和NCoR−/−将胚胎与GAL4反应元件-脱落酶报告子和面板a所述的全长LXRα-或LXRβ-GAL4融合构建物瞬时共转染。在无配体的情况下培养过夜后，对细胞进行裂解并分析启动子活性。（d） 用GAL4单杂交系统转染的MEF分析配体的作用。不符合项报告+/+和NCoR−/−MEF转染了与c组相同的结构，然后添加载体或T1317（1μM）。（e） 外源性NCoR的过度表达拯救了NCoR中基础转录的抑制−/−MEF公司。将细胞与面板c所述的构建物以及空载体（pCMX）或全长NCoR（pCMX-NCoR）共同转染。对于面板a至面板e，所有细胞均与巨细胞病毒-β-Gal表达载体共转染，荧光素酶值归一化为β-Gal活性值。在面板e中，每个对照样品（GAL4-DBD转染的细胞）的荧光素酶活性被指定为100%。GAL4-LXRs转染细胞的荧光素酶活性表示为相应对照活性的百分比。
LXR介导NCoR和SMRT向靶基因启动子的募集。
GAL4-LXR融合分析和双杂交实验表明，LXR可以与共抑制因子NCoR和SMRT相互作用，并抑制基础转录。因此，为了确定LXR是否招募NCoR和SMRT作为靶基因启动子，我们对LXR分离的提取物进行了ChIP分析+/+和LXR−/−巨噬细胞。在先前被证明含有LXR反应元件（LXRE）的ABCA1和SREBP1c启动子区域进行ChIP分析(26,28,31). 目前还没有适合在ChIP分析中检测LXRα或LXRβ的抗体。因此，我们使用抗视黄醇X受体α（RXRα）的抗体，即LXR的异二聚体伴侣，作为RXR/LXR异二聚物的标记物。如图所示。，RXRα占据LXR中的ABCA1和SREBP1c启动子+/+巨噬细胞中有无配体。在LXR中−/−巨噬细胞，我们没有检测到高于背景水平的RXRα，证实LXR/RXR异二聚体与本试验中扩增的ABCA1和SREBP1c启动子区域结合。作为对照，我们还分析了RXRα在RARβ2启动子处向维甲酸受体（RAR。). 此外，在其他实验中，我们没有观察到RXRα募集到LXR中的ABCA1或SREBP1c启动子−/−T1317刺激的细胞（数据未显示），这表明该化合物不会促进不同RXR异二聚体伴侣向这些位点的招募。
RXR以LXR依赖的方式被招募到ABCA1和SREBP1c启动子。骨髓源性巨噬细胞取自LXR+/+和LXR−/−老鼠。每个基因型的对照巨噬细胞均用载体处理。在LXR中评估LXR配体的作用+/+用T1317（1μM）刺激细胞90分钟。用RXRα特异性抗体和对照兔免疫前血清进行ChIP分析。使用ABCA1和SREBP1c启动子的LXRE区和RARβ2启动子的控制RAR反应元件区的特异性引物进行PCR分析。通过密度测定法对条带进行定量。首先将获得的免疫沉淀产物的强度值归一化为其各自的输入控制。所示比率表示从每个标准化值得出的商以及从未刺激野生型细胞获得的值。
为了确定LXR/RXR异二聚体是否向ABCA1启动子招募共抑制因子，使用NCoR特异性抗体进行ChIP分析。如图所示。，与LXR中ABCA1启动子相关的NCoR+/+缺乏配体的巨噬细胞（第1通道）。添加激动剂显著降低了NCoR与启动子的关联。相反，在LXR的ABCA1启动子上检测到的NCoR水平明显较低−/−基础条件下的巨噬细胞，表明非连锁LXR/RXR异二聚体是其有效招募NCoR到启动子这一区域所必需的。配体的添加对LXR缺陷细胞中NCoR向ABCA1启动子的募集没有影响。SMRT也获得了类似的结果，尽管观察到的信号比NCoR的信号弱（数据未显示）。重要的是，LXR表达缺失或使用LXR配体治疗不会影响NCoR或SMRT向RARβ2启动子的募集（图。)支持ABCA1启动子观察到的结果的特异性和LXR依赖性。
ABCA1和SREBP1c启动子的ChIP分析。来自LXR的骨髓源巨噬细胞+/+和LXR−/−在ChIP分析之前，用载体或1μM T1317对小鼠进行不同时间长度的治疗（0至240分钟）。如本文所示，使用兔免疫前血清或对NCoR（a和c）或acH3和acH4（b和d）特异的抗体来免疫沉淀ABCA1、SREBP1c、hsf2和RARβ2启动子。通过密度测定法对条带进行定量。首先将获得的免疫沉淀产物的强度值归一化为其各自输入控制的强度值。所示比率表示从每个标准化值得出的商以及从未刺激野生型细胞获得的值。
由于NCoR和SMRT被认为通过向目标启动子招募组蛋白去乙酰化酶来抑制转录，因此我们通过ChIP分析扩展了ABCA1启动子的特征，以检查组蛋白H3和H4的乙酰化。来自LXR的巨噬细胞+/+小鼠，在缺乏配体的情况下，ABCA1启动子处的组蛋白乙酰化程度最低（图。). 在配体添加后30分钟内观察到H3和H4乙酰化增加，乙酰化增加的状态持续长达4小时。LXR的类似分析−/−巨噬细胞显示，在缺乏LXR的情况下，ABCA1启动子处的组蛋白H3发生了高乙酰化（图。). 在ABCA1启动子处观察到的乙酰化增加与LXR激动剂治疗或LXR表达缺失是特定的，因为在hsf2启动子处没有观察到组蛋白乙酰化的影响（图。). 对ABCA1启动子的ChIP分析表明，共抑制因子的招募主要由LXR介导，LXR的激动剂结合或基因缺失诱导共抑制因子从启动子分离，导致组蛋白乙酰化并缓解转录抑制。
NCoR/SMRT的分离不能解释LXR靶基因的差异调节。
接下来我们研究了NCoR和SMRT的差异招募是否可以解释巨噬细胞中SREBP1c基因缺乏去表达。ChIP实验表明，在LXR的基础条件下，NCoR与SREBP1c启动子相关+/+巨噬细胞，在LXR中观察到较低水平的相互作用−/−巨噬细胞（图。). LXR配体激活后，NCoR与SREBP1c启动子的相互作用减弱。SMRT也获得了类似的结果，尽管信号强度低于NCoR，ABCA1启动子也是如此（数据未显示）。LXR激动剂治疗+/+巨噬细胞还导致SREBP1c启动子组蛋白乙酰化增加，其时间过程与ABCA1相似（图。). 有趣的是，与ABCA1启动子的情况一样，组蛋白3在SREBP1c启动子处的乙酰化在LXR中显著增加−/−巨噬细胞与LXR中巨噬细胞的比较+/+巨噬细胞（图。). 因此，在SREBP1c启动子上，NCoR的LXR依赖性招募、其配体依赖性分离以及缺乏LXR时的超乙酰化都以与ABCA1启动子中无法区分的方式发生。
事实上，在LXR中SREBP1c表达没有上调−/−细胞表明SREBP1c的转录激活需要活性LXR的存在，而ABCA1的激活可以在缺乏LXR的情况下通过额外的组织特异性因子来实现。在扩展的ChIP分析中，我们没有检测到两个启动子上组蛋白3、赖氨酸9或精氨酸17的甲基化（数据未显示），这一发现反驳了沉默机制与SREBP1c基因的永久抑制有关。最近的研究已确定螺旋-环-螺旋转录因子家族的两个成员USF1和USF2是人类ABCA1启动子的阳性调节因子(41). Western blot研究表明，USF1和USF2在骨髓源性巨噬细胞中表达（数据未显示）。因此，使用与小鼠近端ABCA1启动子中的E-box相对应的放射性标记寡核苷酸进行EMSA。该探针通过骨髓源性巨噬细胞核提取物中的DNA结合活性被识别，该核提取物几乎被针对USF1或USF2的抗体完全转移，而不是针对LXRα的抗体（图。)，这一发现与USF1/USF2异二聚体的结合一致。在LXR缺乏的巨噬细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。ChIP分析表明这些因子与小鼠ABCA1启动子结合（图。). 重要的是，尽管近端SREBP1c启动子中存在几个E-box元件，但在该启动子上未检测到USF1或USF2的结合。
LXR中ABCA1和SREBP1c基因差异去表达模型−/−巨噬细胞。（a） EMSA检测从骨髓源巨噬细胞制备的核提取物中的DNA结合活性，该核提取物识别ABCA1启动子中的E-box。这种活性被针对USF1或USF2的抗体超转移，而不是针对LXRα的抗体。（b） 使用针对USF1或USF2的抗体对ABCA1和SREBP1c启动子进行ChIP分析。这两种抗体免疫沉淀ABCA1启动子，但不沉淀SREBP1c启动子。（c） LXR中ABCA1基因的去抑制作用−/−巨噬细胞被认为是由于其他序列特异性激活物的结合，如USF1和USF2，能够招募含HAT的复合物。这些因子在缺乏LXR/NCoR复合物的情况下被释放，足以驱动ABCA1表达。相反，含有HAT的辅激活子似乎也被招募到SREBP1c基因中，但在缺乏激动剂结合的LXR的情况下，这些因子无法刺激转录。辅酶A，辅活化因子。
讨论
最近的研究发现，LXR是高密度脂蛋白代谢的重要调节因子，因为它们能够控制胆固醇逆向转运相关基因的表达。在这项研究中，我们证明LXR不仅在胆固醇水平较高时诱导胆固醇逆向转运，而且在未连接状态下介导活性抑制。因此，这些研究将转录抑制与胆固醇稳态调节联系起来。LXR调节胆固醇反向转运的能力至少部分归因于ABCA1的调节。ABCA1基因缺陷导致丹吉尔病，患者的高密度脂蛋白水平大大降低(11,18). 动脉粥样硬化的起始步骤是巨噬细胞泡沫细胞的形成，当动脉壁中的巨噬细胞因过量胆固醇而超载时，就会发生这种情况。与其他细胞不同，巨噬细胞通过清道夫受体吸收胆固醇，因此高度依赖于胆固醇逆向转运来降低细胞胆固醇水平。ABCA1基因敲除小鼠也证明了ABCA1在胆固醇逆向转运中的重要性。这些小鼠几乎没有循环中的高密度脂蛋白（HDL），并且在巨噬细胞中显示出胆固醇积聚的迹象，与丹吉尔病患者类似(23). 此外，过度表达人ABCA1的细胞显示胆固醇流出活性增加(18). 这些数据共同强调了ABCA1在介导胆固醇逆向转运中的重要性，并表明增加这一过程的药物可能有助于预防或治疗动脉粥样硬化。
在我们对LXR活性的分析中，我们证实了早期的研究表明，LXR的基础ABCA1水平和胆固醇流出量较高−/−巨噬细胞多于LXR+/+巨噬细胞。我们还观察到LXR中HDL胆固醇水平升高−/−老鼠。这些结果表明，LXR能够激活和抑制控制胆固醇流出和HDL生物生成的靶基因，如ABCA1基因。进一步分析表明，LXR介导的ABCA1阻遏是基因和组织特异性的。在分析的六个LXR靶基因中，只有两个ABC转运体ABCA1和在较小程度上ABCG1在LXR中被释放−/−巨噬细胞。有趣的是，LXR介导的ABCA1抑制仅发生在巨噬细胞和肠粘膜中，这两种细胞经常暴露于细胞胆固醇水平突然升高的环境中。这种抑制和激活的结合创造了一个环境，在这个环境中，配体介导的LXR激活对ABCA1表达的诱导作用在肠粘膜和巨噬细胞中比在其他组织中更大。因此，抑制和激活ABCA1表达的综合能力使一个严密调节和反应的系统能够处理细胞胆固醇水平的突然显著变化。
ChIP实验表明，NCoR以LXR依赖的方式被招募到ABCA1启动子，并且无论是配体的添加还是LXR表达的缺失都会导致招募到启动子的减少。NCoR的双杂交分析与研究−/−细胞进一步支持辅抑制因子在LXR转录抑制中的作用。有趣的是，SREBP1c基因和其他几个LXR靶基因的mRNA水平并没有因LXR缺失而增加。然而，LXR的基因缺失降低了SREBP1c启动子处的辅抑制因子结合，表明辅抑制因子募集的缺失不足以诱导转录激活。因此，虽然核受体抑制基础转录可能需要辅压因子募集，但辅压因子的释放显然不足以激活转录。结果表明，额外的步骤或机制必须解释在LXR中观察到的ABCA1和SREBP1c的差异表达水平−/−巨噬细胞。对ABCA1启动子组蛋白乙酰化状态的检查显示，LXR表达缺失后组蛋白H3乙酰化显著增加。这一结果对应于辅抑制因子招募的丧失和基因转录的增加。然而，SREBP1c启动子也获得了类似的结果，表明组蛋白乙酰化的变化，至少在核受体反应元件附近，并不总是与活性基因转录同义。
ABCA1和SREBP1c基因的调控模型说明了LXR缺失的不同后果的基础，如图所示。本研究表明，SREBP1c基因的转录激活需要激动剂结合的LXR，而ABCA1基因的激活则不需要。这些观察结果表明，ABCA1启动子被额外的激活子占据，例如USF1和USF2，它们招募具有组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性的辅激活子，并且也足以驱动启动子活性。在缺乏LXR激动剂的情况下，需要招募NCoR来维持ABCA1基因处于抑制状态。NCoR不被募集到LXR中的ABCA1启动子−/−巨噬细胞，ABCA1基因被去表达。相反，虽然SREBP1c基因也可能被其他招募含HAT辅活化子的活化子占据，但在缺乏激动剂结合LXR的情况下，这些因子不足以激活转录。因此，LXR中SREBP1c启动子的NCoR招募失败−/−巨噬细胞使其变得过乙酰化，但这种过乙酰化不足以促进转录激活（图。).
骨髓移植研究表明，巨噬细胞LXR表达缺失是致动脉粥样硬化的原因(37). 自LXR以来−/−巨噬细胞增加了ABCA1水平和胆固醇外排活性，这些结果可能相互矛盾。LXR中ABCA1的表达水平−/−然而，巨噬细胞并不像LXR中的那样强大+/+经配体处理的巨噬细胞，表明巨噬细胞抗动脉粥样硬化活性所需的ABCA1水平可能不是仅通过去抑制来实现的。此外，除了ABCA1基因外，LXR靶基因可能还需要调节巨噬细胞中LXR的抗动脉粥样硬化活性。一个可能有助于LXR表达抗动脉粥样硬化作用的LXR靶基因是ApoE基因。巨噬细胞ApoE的表达可以显著减少病变的发展，正如ApoE表达时观察到的病变面积减少所揭示的那样−/−小鼠接受ApoE骨髓移植+/+捐助者(1,21).
在LXR中观察到血清HDL水平升高和血清甘油三酯水平降低−/−小鼠有望防止动脉粥样硬化的发展。由于LXR表达缺失导致靶基因启动子的LXRE包含区域中的辅抑制因子招募减少，组蛋白乙酰化增加，因此释放辅抑制因子而不招募辅激活因子的配体可能会模拟LXR中观察到的对HDL的影响−/−老鼠。与第一代LXR激动剂（如T1317）相比，具有这些特性的合成配体可提供更高的治疗指数，T1317可增加HDL和甘油三酯。最近，在RAR中发现了介导辅升压因子释放而不招募辅活化因子的配体，这表明可能为LXR识别类似配体(7).
