肌卡蛋白是平滑肌基因表达的主要调节因子

摘要

心肌、骨骼肌和平滑肌细胞的发育伴随着重叠但不同的肌特异性基因组的转录激活。骨骼肌细胞的分化由基本螺旋-环-螺旋转录因子的MyoD家族成员控制，当在非肌肉细胞类型中表达时，这些转录因子具有显著的激活骨骼肌基因表达的能力（参考文献综述）。1和2). 尚未发现任何单一因素足以激活心肌或平滑肌基因程序。骨骼肌在由单个转录因子诱导方面是否是独特的，或者as-y经鉴定的主调节器是否控制心肌和平滑肌的发育，尚待确定。

平滑肌基因具有受血清反应因子（SRF）调节的特性，血清反应因子是一种普遍存在的MADS（MCM1，Agaous，Deficiens，SRF）盒转录因子，以同二聚体的形式与DNA一致序列CC（a/T）结合₆GG，称为CArG盒(三,4). 事实上，迄今为止所分析的每一个平滑肌基因在其控制区域中都包含至少两个CArG盒，它们协同控制平滑肌特异性转录(5–11). 用显性阴性SRF突变体阻断SRF活性也被证明可以阻止心外膜前移植物中平滑肌基因的表达(12). 然而，SRF依赖性激活平滑肌基因的机制尚未完全解决，并且由于SRF并非平滑肌特异性的事实而变得复杂。

最近，我们发现了一种称为心肌蛋白的SRF转录辅激活子，它在平滑肌和心肌细胞系中特异表达(13,14). Myocardin属于转录因子SAP域家族(15)并通过与SRF的相互作用激活平滑肌和心肌报告基因(13,14). 与野生型肌节蛋白竞争与SRF相互作用的显性阴性肌节蛋白突变体阻断注射后心脏基因表达爪蟾胚胎(13)这表明心肌蛋白在心脏发育中具有重要的早期作用。

在这里，我们表明心肌蛋白足以激活平滑肌分化程序。心肌蛋白的促肌力活性需要与SRF结合，并通过同二聚体增强，这为平滑肌基因激活所需的CArG盒之间的协同性提供了分子基础。

方法

细胞培养和转染。10T1/2细胞在含有10%FBS的DMEM中保持低密度（≈30%汇合）。根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。转染两天后，将细胞转移到分化培养基（含2%马血清的DMEM）。五天后，进行进一步的分析，包括免疫细胞化学、Western blot和RT-PCR。通常，在12孔板中每个孔使用0.5μg质粒。

为了获得心脏成纤维细胞，对新生大鼠心脏进行消化，如下所述(16)将成纤维细胞组分在组织培养塑料上进行差速电镀2h后纯化。将此板上粘附的成纤维细胞传代两次，以低密度（5×10⁴每厘米细胞数²)，并在DMEM中在10%FBS中生长到次通量。这些培养物被广泛清洗以去除血清并感染编码腺病毒lacZ公司或肌钙蛋白在无血清培养基中的128–935残基，在37°C下以100倍感染2小时。细胞培养14-21天，在PBS中的4%甲醛中固定30分钟，并按如下所述对平滑肌（SM）-α-肌动蛋白进行染色。

PAC1(17)和A10(18)平滑肌细胞系保存在含有10%FBS的DMEM中，并感染编码腺病毒lacZ公司或缺乏转录激活域（TAD）的心肌蛋白显性阴性突变体(13).

如前所述进行COS细胞转染和荧光素酶分析(13). 除非另有说明，否则使用100 ng报告质粒和100 ng每个激活质粒。通过添加相应数量的表达载体而不插入cDNA，每个孔的DNA总量保持不变。

已经描述了Myocardin和SRF表达载体(13,14). 使用Stratagene的QuikChange试剂盒，通过基于PCR的诱变产生肌球蛋白突变体。所有突变均经DNA测序证实。心肌蛋白突变体NLS-Δbasic在氨基末端含有一个SV40核定位序列（NLS）和一个基本区域的内部缺失。SV40 NLS是该突变蛋白定位于细胞核所必需的。使用pcDNA3.1表达质粒（Invitrogen）表达MyoD。SM22-荧光素酶报告子包含1434-bp启动子(6,13,14). 3xc-fos-SRE-荧光素酶报告子是通过连接c-福斯胸腺嘧啶激酶启动子驱动荧光素酶报告子的血清反应元件。CMV公司-lacZ公司作为转染效率变化的内部控制。

免疫细胞化学和Western Blot。按照说明进行免疫染色(19). 按照所述进行肌原转化分析(20)除使用兔抗SM-肌球蛋白重链抗体外。从来自发育研究杂交瘤银行（爱荷华大学，爱荷华市）的培养的杂交瘤细胞的上清液中收集MF20抗肉瘤肌球蛋白抗体。小鼠抗骨骼肌肌球蛋白（MY32）、小鼠抗SM-α-肌动蛋白（1A4）、鼠抗SM钙调素、鼠抗h钙调素和鼠抗SM肌球蛋白轻链激酶（K36）购自Sigma。兔抗SM22抗体由Michael Parmacek博士（费城宾夕法尼亚大学）和Lucia Schuger博士（底特律韦恩州立大学）提供。兔抗SM-MHC抗体购自生物医学技术公司（马萨诸塞州斯托顿）。小鼠抗SM-γ-肌动蛋白购自ICN。除抗SM-γ-肌动蛋白外，所有一级抗体均以1:200的稀释度使用，抗SM-α-肌动素的稀释度为1:1000，以避免与SM-α-actin发生交叉反应。FITC或德克萨斯红结合抗鼠或抗兔二级抗体（Vector Laboratories）以1:200稀释度使用。

细胞提取物上的蛋白质印迹按所述进行(19)除抗α-微管蛋白抗体（Sigma）外，还使用上述抗体。用辣根过氧化物酶偶联驴抗体作为二级抗体。

凝胶流动性变化分析。凝胶迁移率变化分析如所述进行(13).体外翻译蛋白和³²对应于c的P标记探针-福斯使用CArG盒。

逆转录聚合酶链反应。用TRIzol试剂（Invitrogen）分离总RNA。用DNaseI处理后，用1μg RNA作为模板，用随机六聚体引物进行反转录。PCR引物序列可根据要求提供。所有PCR产物都跨越基因的内含子区域。RT-PCR是在与输入RNA呈线性关系的条件下进行的。

结果

肌球蛋白激活平滑肌基因表达。因为肌钙蛋白在心肌和平滑肌细胞中特异性表达，并能激活心肌和平滑肌报告基因(13,14)，我们测试是否足以激活转染10T1/2成纤维细胞中的内源性肌肉基因。同时，我们用MyoD转染细胞(21)比较两种蛋白的潜在成肌活性。

表达心肌蛋白的细胞采用类似于分化心肌细胞的细长形态(图1A类). 用MF20抗体染色的MyoD转染细胞可识别心肌和骨骼肌肌球蛋白，但肌钙蛋白没有诱导这些肌肉标记物。相反，转染心肌蛋白的细胞对α-SM肌动蛋白的表达进行了强烈染色。肌动蛋白亚型也在心肌细胞和骨骼肌细胞中表达，正如MyoD上调肌动蛋白表达所示(图1A类). 肌球蛋白还诱导SM22、SM-calponin、h-caldesmon、SM肌球蛋白轻链激酶、SMγ-actin和SM-MHC蛋白的表达，这些蛋白是平滑肌的标志物(图1A类). Western blot分析进一步证实了肌球蛋白诱导的平滑肌蛋白表达(图1B类). 肌钙蛋白激活平滑肌基因表达依赖于将培养基中FBS的浓度从10%降低到2%马血清，这表明细胞增殖不利于其促肌肉生成活性。

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图1。

肌钙蛋白激活平滑肌细胞分化。(A类)肌钙蛋白转染10T1/2细胞(a、 b、e、f、和我–n个)或MyoD(c、 天，克、和小时)免疫组化检测表达载体和肌肉标志物。亮场和暗场图像如所示a、 c、e、和克和b、 d、f、和小时分别是。在转染细胞的细胞核中也检测到标记有FLAG的心肌蛋白我–n个. (B类)用编码lacZ公司（作为阴性对照）、心肌蛋白、心肌蛋白NLSΔbasic和MyoD。蛋白质提取物用抗SM22、SM-γ-肌动蛋白和SM肌球蛋白轻链激酶抗体进行Western blot分析。α-管蛋白被检测为负荷对照。(C类和D类)10T1/2电池(C类)和NIH 3T3或3T3-L1细胞(D类)用每个通道上方所示的表达载体进行转染。分离RNA并通过RT-PCR检测肌肉基因表达。L7作为负荷控制进行测量。(E类)原代大鼠心脏成纤维细胞感染编码腺病毒lacZ公司或心肌肌钙蛋白染色，观察SM-α-肌动蛋白的表达。Ad仅出现背景染色-lacZ公司而Ad-myocardin可观察到染色强烈的细胞。这些细胞的组织也可以在低倍镜下看到(赖特). (右上)相位对比图像。（棒材，200μm）

我们还通过RT-PCR测量了平滑肌、心肌和骨骼肌标记物的表达(图1C类). 心肌素特异性激活10T1/2细胞中平滑肌标志物的表达，而MyoD上调骨骼肌标志物的表达，如乙酰胆碱受体δ亚基和胚胎MHC。心肌蛋白和MyoD均未激活心脏标志物心脏α-MHC或心钠素的表达(图1C类).

Myocardin还诱导NIH 3T3细胞和3T3-L1细胞中平滑肌基因的表达(图1D类). 相反，HeLa细胞和COS细胞对肌球蛋白的完全促肌生成活性是不耐受的（数据未显示）。

因为c-福斯也由CArG盒（称为血清反应元件）控制，我们检测了其在心肌转染NIH 3T3细胞中的表达。与之前的研究一致，研究表明心肌蛋白不能激活与c基因相关的报告基因-福斯发起人(13)，c没有变化-福斯转染细胞中的表达(图1D类).

我们还在大鼠原代心脏成纤维细胞中表达了心肌蛋白。如所示图1E类，这些细胞在感染编码肌球蛋白的腺病毒时表现出α-SM肌动蛋白的强烈表达，而感染lacZ公司腺病毒对这种和其他平滑肌标志物呈阴性（数据未显示）。有趣的是，表达异位心肌蛋白的心脏成纤维细胞组织成类似原始血管的三维结构(图1E类). 我们从未在表达心肌蛋白的10T1/2细胞中观察到这种结构。这种形态反应的潜在意义尚待研究。

结构-功能研究。心肌蛋白的保守N末端结构域是可有可无的，而TAD是产生平滑肌表型所必需的，如缺乏该区域的C末端缺失突变体（突变体128–713和128–513；图2A类). 用病毒辅活化因子VP16替换心肌蛋白TAD恢复了全部肌生成活性，表明TAD在转录激活中起着一般作用，但并不赋予该过程靶基因特异性。删除SRF交互所需的基本区域(13)，还消除了心肌蛋白的成肌活性（突变的NLS-Δbasic；图。​图1B类1B类和2A类)SAP结构域的突变降低了肌生成活性(图2A类).

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图2。

心肌蛋白突变体分析。(A类)平滑肌基因表达所需的心肌蛋白结构域。用编码所示心肌结构的表达载体转染10T1/2细胞。值表示为具有每个突变体的SM MHC阳性细胞的数量相对于用野生型肌球蛋白表达质粒转染的培养物中的数量，其被赋予值100。(B类)肌钙蛋白和MRTF-A激活平滑肌基因表达。10T1/2细胞转染编码肌钙蛋白、MRTF-A或MRTF-B的表达载体，并对SM-MHC阳性细胞进行评分，如A类.(C类)显性负性心肌炎抑制平滑肌基因表达。PAC1和A10细胞感染编码腺病毒lacZ公司或心肌蛋白显性阴性突变体128–513。RT-PCR检测平滑肌基因表达。测量GAPDH作为负荷控制。

肌卡蛋白与两种心肌相关转录因子（MRTFs）A和B具有高度同源性(14). MRTF-A在激活10T1/2细胞中平滑肌基因表达方面与心肌蛋白一样有效，而MRTF-B在该试验中不起作用(图2B类).

为了确定心肌蛋白是否是平滑肌分化所必需的，我们用一种编码心肌蛋白128–513残基的腺病毒感染表达心肌蛋白的PAC1和A10平滑肌细胞系，该残基是一种显性阴性突变(13,14). 显性负性心肌病突变体在两种细胞系中特异性抑制平滑肌基因表达至少5倍(图2C类). 我们的结论是，肌钙蛋白足以促进平滑肌分化，显性负性肌钙蛋白突变可以干扰平滑肌程序。

Myocardin的最大活性需要二聚体。平滑肌基因通常需要成对的CArG盒来进行转录激活(6–11)，而c-福斯由增殖信号激活的启动子只包含一个CArG盒。虽然心肌蛋白可以在单个CArG盒上与SRF形成三元复合物，但它优先激活包含多个CArG盒子的肌肉基因(13). 因此，必须有一种机制使心肌蛋白能够根据SRF结合位点的数量区分靶基因。

为了确定多个CArG盒对心肌蛋白的选择性反应是否反映了心肌蛋白协同作用的需求，我们测试了其自我关联能力。事实上，免疫沉淀实验表明肌球蛋白同源二聚体(图3A类). 缺失映射将二聚结构域定位到残基513–713，残基包含类似亮氨酸拉链的卷曲线圈基序(图3B类). 用苏氨酸替换假定亮氨酸拉链中每个七肽重复序列中第7位的脂肪族残基，从而破坏其他亮氨酸拉链蛋白的同二聚体化(22)，阻止心肌二聚化(图3B类)但没有改变其与结合到CArG盒的SRF形成三元复合物的能力(图4A类). 野生型蛋白和亮氨酸拉链突变体产生了具有相同迁移率的SRF三元复合物，表明心肌蛋白将SRF作为单体结合，并且结合到不同CArG盒的心肌蛋白分子之间可能发生二聚反应。尽管该亮氨酸拉链突变体与SRF相关，但其激活10T1/2细胞中CArG盒依赖性启动子和内源性平滑肌基因的能力受到损害(图4B类–D类)这表明二聚体对心肌蛋白的最大活性至关重要。

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图3。

由线圈-线圈结构域介导的心肌蛋白均聚。(A类)心肌蛋白和心肌蛋白缺失突变体示意图。在转染COS细胞中表达带有FLAG标签和Myc-tagged心肌蛋白的缺失突变体。细胞提取物用抗FLAG抗体免疫沉淀（IP），用抗Myc抗体免疫印迹（IB）分析。显示斑点(赖特). LZ，亮氨酸拉链。(B类)显示了心肌蛋白亮氨酸拉链区的序列和亮氨酸拉链突变体（LZ-mut）中氨基酸的变化。如图所示，野生型和LZ突变型心肌细胞在COS细胞中表达，蛋白质-蛋白质相互作用通过免疫沉淀和免疫印迹检测。

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图4。

心肌二聚体突变体的功能分析。(A类)凝胶迁移率变化测定用在体外翻译的SRF、心肌蛋白（WT）和心肌蛋白LZ突变体以及对应于c-福斯血清反应元件。仅显示含有移位探针的凝胶区域。(B类)将心肌蛋白表达载体、心肌蛋白LZ突变体和荧光素酶报告子瞬时转染COS细胞，并将其与SM22启动子或三个拷贝的c-福斯CArG盒，并测定荧光素酶活性。(C类)用心肌蛋白或心肌蛋白LZ突变体的表达载体转染10T1/2细胞，SM-MHC阳性细胞按图2A类.(D类)用编码心肌蛋白或LZ突变体的表达载体转染10T1/2细胞。提取RNA并通过RT-PCR分析转录物。

讨论

平滑肌细胞对心血管、肺、消化和泌尿生殖系统的收缩性、结构和功能至关重要，并表达一系列独特的肌肉特异性基因。然而，控制平滑肌基因表达的分子机制尚不清楚。在这项研究中，我们证明心肌蛋白足以激活非肌肉细胞中的平滑肌基因。

肌卡蛋白是SM分化的主要调节因子。肌钙蛋白的主要平滑肌成肌活性与MyoD的活性相似，MyoD可以将非肌肉细胞转化为骨骼肌(1,2,21). 考虑到大多数（如果不是全部）平滑肌基因在其控制区域中包含必需的CArG盒(5–11)很可能是心肌蛋白通过与SRF的专性相互作用直接激活这些基因。与这一结论一致，肌钙蛋白SRF结合区的突变取消了其肌生成活性，并且肌钙蛋白无法激活SRF缺乏的胚胎干细胞中依赖SRF的报告基因(13,14).

肌钙蛋白的胚胎表达模式与它参与平滑肌基因激活一致(13,14). 有趣的是，MRTF-A也是平滑肌基因表达的有效激活剂，但其胚胎表达模式并不局限于平滑肌和心肌细胞(14). 尚不清楚为什么平滑肌基因在许多表达MRTF-A的细胞类型中不表达体内可能其在这些组织中的表达水平不足以激活平滑肌程序，或者可能其他因素或信号影响其转录活性。MRTF-B在SRF结合区与心肌蛋白和MRTF-A具有高度同源性，但在激活平滑肌基因表达方面无效。类似地，MRTF-B是一个弱SRF辅激活子(14).

Myocardin和MRTF-A是唯一有潜力激活平滑肌分化程序的转录因子。如果除了SRF外，还需要辅因子参与这种活动，那么它们必须在10T1/2细胞中表达，或者心肌蛋白和MRTF-A必须诱导它们的表达。研究表明，CRP家族SRF、GATA6和LIM域蛋白的过度表达可以刺激平滑肌基因的表达，明显是通过增强SRF DNA结合活性(23). 然而，这些因素中没有一个单独显示成肌活性。据报道，两种富含AT-的DNA结合因子，即Mrf2α和Mrf2β，可激活肌成纤维细胞早期平滑肌谱系标记物的表达(24)但不是用肌钙蛋白观察到的完整的平滑肌程序。这些因素是下游作用还是与心肌蛋白平行作用尚待确定。

最近的一项研究报道，如RT-PCR检测到的那样，骨骼肌和平滑肌细胞中肌钙蛋白的过度表达可以提高α-SM肌动蛋白和钙蛋白转录物的表达(25). 由于骨骼肌细胞表达一些低水平的平滑肌基因，从这些发现中尚不清楚心肌蛋白是否能诱导非肌肉细胞中的完整平滑肌表型。随着这项工作的完成，另外两项研究也报告了心肌蛋白激活小鼠胚胎干细胞和10T1/2细胞中平滑肌基因表达的能力(26,27).

显性负性心肌炎突变体抑制PAC1和A10细胞系平滑肌基因表达表明，心肌炎是平滑肌分化所必需的。虽然我们支持这样的解释，即该突变通过阻止转录活性SRF-心肌复合物的形成而起作用，但也可能是通过另一种机制起作用。

Myocardin通过多个CArG盒优先激活。SRF结合位点和辅因子关联的数量和位置赋予了SRF靶基因表达模式的特异性。平滑肌基因的转录激活通常需要至少两个通常位于远处的CArG盒(5–11). 相反，c-福斯基因由靠近转录起始位点的一个CArG盒控制(28). 由于肌球蛋白不能通过单个CArG盒有效激活转录(13)，这些基因有望免于心肌蛋白的活性。

我们的研究结果表明，心肌蛋白中的亮氨酸拉链样结构介导同二聚体化，是有效激活平滑肌基因所必需的。我们认为，与不同CArG盒上的SRF同源二聚体结合的心肌蛋白之间发生二聚体，这将解释平滑肌基因对多个CArG盒子的依赖性。我们赞成二聚体暴露心肌蛋白TAD的可能性，否则它是隐蔽的(13)或通过在转录机制附近并置遥远的CArG盒来促进肌肉靶基因上转录复合体的组装(图5). 心肌蛋白与其他启动子特异性辅因子的选择性相互作用可能为靶基因激活提供进一步的特异性。

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图5。

SRF调控平滑肌基因的模型。肌卡蛋白优先激活由成对CArG盒控制的平滑肌基因。c-福斯启动子包含单个CArG盒，不能被心肌蛋白有效激活。肌球蛋白通过亮氨酸拉链（LZ）二聚可能暴露TAD，从而激活肌肉基因表达。其他启动子特异性因子（X）与SRF和心肌蛋白协同作用。

心肌素在平滑肌与心脏基因表达中的作用。值得注意的是，CArG盒还控制许多心肌和骨骼肌基因的表达，这些基因不能被转染成纤维细胞的心肌激活(29). 然而，显性负性心肌病突变体可以抑制心肌细胞中心脏基因的表达爪蟾胚胎(13)这表明，尽管肌钙蛋白不能激活10T1/2细胞中的心脏基因表达，但它在胚胎发育过程中是心脏基因表达所必需的。也许心肌病与其他因素协同控制心脏基因表达体内而在转染的成纤维细胞中，由于缺乏必要的心肌辅因子或心肌蛋白无法覆盖的心肌基因负调控因子，它只能激活平滑肌基因。

通过对小鼠功能丧失表型的分析，将进一步了解肌钙蛋白和MRTF在平滑肌和心肌发育中的作用。研究这些转录辅激活物在平滑肌和心肌疾病中的潜在作用也将是特别有趣的。

致谢

笔记

缩写：SRF，血清反应因子；SM，平滑肌；NLS，核定位序列；MHC，肌球蛋白重链；转录激活域；MRTF，心肌相关转录因子。

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