驻波照明实现的真正光学分辨率超过瑞利极限

摘要

对生物样品的研究需要结合高分辨率和足够的材料对比度的显微镜。荧光显微镜能够选择性地成像样品的单个成分，因为染料可以与特定分子结合。远场仪器的分辨率基本上受到光的波动性质的限制。分辨率的一个实际定义是众所周知的瑞利准则。它指出，如果两个点的横向间距等于艾里图案第一个暗环的半径，那么这两个点就可以被解析。对于绿光（波长540 nm）和数值孔径（NA）为1.4的物镜，该标准规定了240 nm的限制(1). 在荧光显微镜的情况下，可以通过包含高空间频率分量的非均匀激发模式来实现超过普通瑞利极限的分辨率。在扫描共焦荧光显微镜（CFM）中，这种模式是在样本上扫描的一个小光点，理论上与标准荧光显微镜相比，分辨率提高了1.4倍(2–4).

在我们的谐波激发光学显微镜（HELM）中，具有高空间频率分量的非均匀激发图案由一个扩展的二维干涉场组成，该干涉场具有密集的节点和波腹。这种模式覆盖了整个视野，可以通过压电执行器在二维上移动。图案不同位置的五幅图像由电荷耦合器件（CCD）相机记录并进行电子后处理。频域分析表明，由于谐波激励，试样光谱中额外的高空间频率分量有助于在CCD芯片上产生图像。从五幅采集的图像中，通过代数方法在扩展的通带内重建样本光谱。使用我们的方法，我们甚至比CFM的横向分辨率高出1.5倍，并且避免了扫描方法的缺点。

材料

仪器。

在我们的装置中，氩离子激光器（加利福尼亚州奇诺Omnichrome，543-AP-A01；波长488 nm）用作相干光源。激光器与干扰产生装置耦合（图。​（图1）1)通过单模保偏光纤。通过可旋转的半波片和偏振器可以调整激光功率。在干涉产生装置中，四束激光（可视为平面波）以与光轴成α=55°的共同角在显微镜的物面上相交。电极化平行于像平面；因此，只有反平行光束（而非正交定向光束）才会干涉。两束激光的路径长度可以通过压电驱动镜来改变，以调整干涉图样的相位偏移。

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图1

干扰发生器(A类和B类)和测量的强度分布(C类). (A类)俯视图。直径为1.5 mm的准直激光束（λ=488 nm）由弱透镜（L；焦距300 mm）略微聚焦，然后被分束器（BS）分为四束等强度的光束，这些光束在显微镜的光轴（OA）处交叉。L的位置是针对物平面中约120μm的光束直径进行调整的。在这种配置下，波前的曲率在小视场（约25μm×25μm）中可以忽略不计。压电致动反射镜（P）用于改变两束光的路径长度。E、 电极化。(B类)通过光轴剪切视图。四束激光（只显示了两束）通过一块玻璃块（GB）与物体耦合，玻璃块浸入滑片中。标准荧光滤光片立方体（未显示；发射，带通515–565 nm；分束器，二向色长通510 nm）结果证明，这种方法具有足够的选择性，可以避免与CCD芯片上残留激光有关的问题，即使捕获的激光强度比荧光强度高几个数量级。(C类)将荧光滤光片从显微镜的成像路径上移开，记录干涉图样。一个衰减率为10的附加中性密度滤波器⁻³用于保护眼睛和相机免受高强度直接激光的伤害。节点间距约为200 nm。

倒置显微镜（Zeiss Axiover 100）配有一个非制冷工业级CCD摄像机（LV-8500，Leutron Vision，Glattbrugg，Switzerland）获取样品图像。带有帧抓取器（Pic-Port，Leutron Vision）的标准个人计算机读取图像数据，控制测量顺序，并执行图像计算。对于1024×1024像素的图像，计算最终HELM图像的算法只需要几秒钟。

结果

图。​图22显示了直径为100nm的荧光珠，其远低于标准荧光显微镜的瑞利极限，也低于共焦装置的瑞利极限。为了比较不同技术的分辨率，使用HELM对水珠的相同区域进行成像（图。​（图22A类)，标准照明（图。​（图22B类)和共焦扫描（图。​（图22C类). 作为单个珠子实际位置的参考，还提供了原子力显微镜图像（图。​（图22D类)这是在空中获得的。光学显微镜图像的物镜NA为1.4。对于共焦图像，针孔直径设置为内部Airy盘直径的67%；这种有限的针孔尺寸导致的分辨率下降约为15%(5). HELM图像的分辨率明显优于标准图像的分辨率，也优于共焦图像的分辨率。在后一种情况下无法区分单个珠子，但在HELM中可以区分，尽管对于HELM，100-mm珠子的分辨率接近极限。

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图2

用不同技术对直径为100-nm的荧光聚苯乙烯珠样品的相同区域进行成像。（Bar=1μm）（A）使用HELM在带有Plan Apo×63 1.4 NA物镜的蔡司Axiover显微镜上对该面板进行成像。(B类)该面板通过标准照明的相同透镜成像。共焦图像(C类)使用徕卡计划Apo×100 1.4 NA物镜在徕卡（伊利诺伊州迪尔菲尔德）NTSP上记录。(D类)该面板是用原子力显微镜（TopoMetrix Accurex II MS，加州圣克拉拉）记录的。共聚焦图像的全视场（25μm×25μm）的时间积分激光功率约为30 mW，HELM所需的五幅图像的总功率约为0.16 mW；采集时间分别为6.5s和1.6s。为了稳定结构，我们用聚赖氨酸（polylysine，Polysciences）将微球的羧酸修饰表面（氟硅酸盐YG羧酸盐微球，Polysciences）连接到盖玻片上-我-氢溴酸赖氨酸；分子量=36kDa；西格玛）。CCD芯片的像素距离符合香农准则；本文提出的准连续图像是由带限插值生成的。这种插值过程平滑了原始图像的像素噪声，是图像颗粒结构的原因(C类).

图。​图3三显示了直径为200 nm的珠子，约等于标准荧光显微镜的瑞利极限。图中的HELM图像。​图3三A类证明了这种珠子可以用我们的方法清楚地分辨出来，即使它们是紧密堆积的。在标准荧光显微镜图像中（图。​（图3三B类)相反，单个珠子仍然模糊。

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图3

用HELM成像的直径为200 nm的荧光珠(A类)和标准荧光显微镜(B类). （Bar=1μm）显微镜系统和试样制备与图。​图2。2紧密堆积珠的中心距离接近240 nm的瑞利极限。几乎看不见的单个珠子之间的对比度下降B类是珠子不是点源这一事实的结果。此外，必须考虑到，对于浸水珠，目标的有效NA（标称值：1.4）变得更小(28).

理论

使用z（z）表示沿光轴的空间坐标x个和年作为平行于图像平面的坐标，传播方向(x个,年,z（z）)四束干涉激光中(秒,0,c（c）), (−秒,0,c（c）) (0,秒,c（c）)、和（0，−秒,c（c）)，其中秒=sin（α），c（c）=cos（α），α是光束与光轴的角度。忽略比例因子，生成的强度模式我电场的大小可以写为

1

哪里u个= (4πn个)sin（α）/λ是谐波激励的空间频率，n个=1.52是玻璃的折射率，λ是激发的真空波长，Δ_x个和Δ_年描述模式相对于样本的移动x个和年方向。

对于照明样品，荧光φ与激发强度成正比我乘以染料分子密度ψ；后者在以下文本中被称为原始图像：

2

通过表示变量的二维傅里叶变换，我们得出照明样品的光谱：

三

具有A类=$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\psi ">\psi </trans>}}$(k个_x个,k个_年),B类^±=$\widetilde{\mathrm{<trans\; data-src="\psi ">\psi </trans>}}$(k个_x个±u个,k个_年)，以及C类^±=$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\psi ">\psi </trans>}}$(k个_x个,k个_年±u个).

$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\phi ">\phi </trans>}}$是原始光谱的叠加A类加上四个光谱B类^±,C类^±被空间频率改变的u个沿倒易空间k个_x个和k个_年正负方向的轴。在频域中，显微镜的成像特性可以用一个具有特定仪器功能的乘法来描述T型称为光学传递函数（OTF；参考文献。6–8):

4

其中θ是CCD芯片上的结果图像。

在OTF非零的区域（称为OTF或通带的支持），原则上可以重建样本的频率分量；然而，在该区域之外，信息将无法恢复地丢失。在荧光显微镜的情况下，通带是一个以原点为中心的圆形区域，具有截止半径第页= 4π不适用/λ、 其中λ是真空发射波长（对于类荧光染料，约为540 nm），以及不适用是目标的NA。插入公式。三到等式。4，我们得到了谐波激励下图像光谱的表达式：

5

四移位谱的出现B类^±和C类^±在等式中。5由于驻波激励是我们方法的基础。通过这种偏移，光谱的额外高频区域被带入显微镜的通带。组件B类⁺例如，已被u个在显微镜成像过程之前，在左边切下一个以倒易空间原点为中心的圆形区域。因此，组件B类⁺传输源于以正片上某点为中心的圆形区域的对象信息k个_x个一定距离处的轴u个从原点开始。图。​图44显示了我们当前设置对OTF的增强支持。

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图4

通过驻波激励增强OTF的支持。(A类)具有截止频率的标准荧光显微镜的圆形通带第页. (B类)HELM的三叶草形OTF。四个圆形区域1、2、3和4是圆形通带的重定位副本A类并与组件相对应B类⁺,B类⁻,C类⁺、和C类⁻根据方程式。5分别是。位移u个等于谐波激励的空间频率。比率u个到第页图中所示与实际情况相符，因为整个系统的截止频率比我们目标的标称NA预期的频率低≈20%。

然而，为HELM采集的五幅图像必须进行电子后处理，以提取单个组件A类,B类^±、和C类^±并重新排列这些图像以获得最终的高分辨率图像。本研究中使用的提取方法是参考文献中描述的代数方法的二维扩展。9对于我们的二维情况，一个需要五个图像，其中激发模式的节点和波腹位于不同的位置。在我们的设置中x个和年相位偏移（Δ_x个和Δ_年)通过压电致动器依次调整到值（0,0）（π/2,0）、（π，0）、和（0，π/2）。对于五幅采集图像的傅里叶变换，公式。5保持适当的系数和因此，我们得到了一组5×5的线性方程组，可以求解五个光谱分量A类,B类^±、和C类^±在实验上，我们对测量的图像进行快速傅里叶变换，并求解每个像素的线性方程组。通过这样做，我们获得了光谱分量A类,B类^±、和C类^±此外，显微镜的OTF也减弱了这些光。剩下的计算任务是将组件移回其原始位置，并最终叠加它们，同时考虑显微镜的OTF衰减。

从更一般的理论角度来看，空间分辨率的增强只能以时间分辨率为代价（HELM中的图像速率降低，因为计算一幅高分辨率图像需要五幅图像）。光信息自由度的基本不变性原理是在30多年前建立的(10).^†

讨论

HELM中的一个重要参数是光束与光轴的夹角α，它决定了激励的空间频率美国。在图中。​图4，4可以看出u个需要权衡沿k个_x个和k个_年轴与产生通带的各向异性。

所选值（55°）是一个很好的折衷值，此外，允许直接观察浸入式物镜的干涉图样。

由于通带非各向同性，珠子的图像显示出一些各向异性和珠子边缘附近的过冲；最明显的是图中对角线方向的暗区。​图22A类使用6束或8束分别以60°或45°的倍数定向的激光束，可以在很大程度上避免这种影响。^‡

与CFM相比，HELM图像的信噪比更高，即使图中CFM图像的时间积分激光功率高出100多倍。​图22C类这种改进的一个基本原因是，与标准荧光显微镜相比，CFM的分辨率提高只能通过在发射光路径中使用一个小针孔来实现(5,13,14). 这种安排需要权衡噪音水平和分辨率。相反，在HELM中，相机可以收集进入透镜的所有光子。

对于动态物体的研究来说，成像速度至关重要。荧光显微镜成像速度的基本限制由激发态有限寿命引起的荧光团的最大发射速率给出（“染料饱和”；参考文献。15). 在HELM中，大约一半的荧光团一次被干涉图案照亮，而在普通的单点CFM中，一次只有很小一部分荧光团被照亮（对于1024×1024像素图像，≈百万分之一）。因此，来自样本的总光子通量被限制为CFM的顺序操作比HELM的并行操作小几个数量级的值。因为在一定的信噪比水平下，每张图像需要最少的光子数，所以HELM有可能比CFM更快地获取图像数据。除了这一基本考虑因素外，HELM还减少了与机械扫描机制相关的速度问题，因为与CFM相比，每幅图像只执行五次扫描，而CFM要求每行扫描一次。然而，新型多点扫描仪可以减少CFM的染料饱和问题和机械扫描困难。

在成像速度方面的优势也可以从我们的实验数据中看出。HELM所需的五幅图像的总采集时间（图。​（图22A类)共焦图像为1.6秒，而共焦图像则为6.5秒（图。​（图22C类). 考虑到使用非制冷工业级CCD相机获得的HELM图像的较高信噪比，差异很明显。

实际关注点是测量过程中所需的干涉图样稳定性。我们发现，节点间距（20nm）的1/10的相位偏移误差是可以接受的，但较大的误差会导致图像严重恶化。我们设置的热漂移（在非温度控制室中通常为20 nm/min）将采集时间限制为几十秒。然而，通过在长期测量期间重新校准相位偏移，可以很容易地克服这一限制。样品折射率的不均匀性也会导致干涉图样的不需要的相位误差，在这种情况下，相位误差与空间有关。和以前一样，为了将这些误差限制在可容忍的值内，折射率异质性引入的波前失真不应超过几十纳米。我们预计，适用于HELM的要求与保证在标准显微镜中使用校正良好的高NA物镜进行高分辨率成像的要求差别不大。需要进一步的实验数据来研究HELM对实际折射率不均匀性的敏感性。

在许多应用中，研究样品的三维结构是一个重要的兴趣所在。通过将焦点逐步穿过标记的(16)或未标记样本(17,18). 不幸的是，对于点状物体，标准荧光显微镜的轴向分辨率被严格限制在0.9μm左右，更糟糕的是，对任意物体，其轴向分辨率可能完全失效(19). 这个问题与三维OTF在k个_z（z）轴位于原点，因此，生成的三维图像显示出潜在的伪影。相比之下，CFM没有缺失的锥体，能够采集轴向分辨率约为0.8μm的三维图像(20)然而，它仍然不如外侧的。

描述了进一步提高轴向分辨率的不同方法。所谓的4π显微镜(21)是CFM的衍生物，其第二个目标是收集向样品室背面传播的光子。理论上，轴向分辨率可达100 nm，而横向分辨率等于CFM。4π显微镜也是扫描显微镜。

参考文献中描述了一种非扫描方法。22和23通过使其节点平面和反节点平面平行于成像平面的干涉场，可实现大幅增强的轴向分离能力。这种方法非常适合于小于一个激励模式周期的物体。较厚样品的成像可能会导致伪影，因为产生的通带在原点仍有一个缺失的圆锥体(9).

最近证实了后一种方法和4π显微镜在某些方面的进一步发展（I⁵M显微镜；裁判。24). 我⁵M显微镜使用由非相干光源产生的更复杂的干涉场来选择性地照射物平面，并且是一种非扫描方法。轴向分辨率等于4π显微镜（100 nm）的分辨率，但横向分辨率根本没有增加。

也可以通过用产生的条纹图案照亮试样来提高轴向分辨率，例如通过将光栅成像到物体上(25)或者通过两个激光束的干涉(26). 对于这些方法，应用的重建算法与我们的算法有很大不同，因为图中的中心传输圆。​图44省略，因为对象信息仅在两个边带中传输(27). 在这种情况下，可以显示出离焦模糊减少了。

理想的显微镜是在所有空间方向上都具有100 nm的均匀高分辨率，无需扫描方法。与标准荧光显微镜相比，HELM在我们当前的设置中没有增加轴向分辨率。然而，关键的思想是，谐波激励以及类似于本文所述的重建算法，也可以在与目标平面不平行的空间方向上工作。通过使用在适当空间方向上具有节点和波腹平面的谐波强度模式，可以在任何所需方向上获得三维OTF的额外副本。这种额外的通带区域可以覆盖到一个在倒数空间中具有高截止频率的扩展通带。

我们对未来设置的想法是使用连续光束偏转装置（如检流计或声光器件），以在空间中选定的方向和不同的节点间距轻松产生干涉图案。这样的配置将实现三维成像，同时解决由三叶草形二维OTF引起的各向异性问题。

结论

已经描述了一种允许分辨率为100 nm的二维成像的方法，据我们所知，这是任何其他远场方法都无法实现的。与广泛使用的共焦显微镜相比，基本考虑因素在成像速度和分辨率方面显示出优势，实验数据证实了这一点。电子后处理的时间消耗长达几秒钟，并且随着计算机技术的进步，时间消耗将进一步减少。然而，在我们当前的设置中，轴向分辨率等于标准荧光显微镜的轴向分辨率。未来的设置将产生不限于固定方向的不同干涉图案，这将使我们能够同时提高横向分辨率和轴向分辨率。由于基于谐波激励原理的显微镜的系统要求与共焦器件的系统要求相似，因此我们预计此类系统将成为共焦装置的商业替代品。

致谢

缩写

脚注

参考文献