组织蛋白酶B失活减轻胆汁淤积时的肝损伤和纤维化

药理学Ctsb抑制。

在选定的实验中，用Ctsb抑制剂R-3032（4.9 mg/ml，30:70聚乙二醇400/H）处理小鼠₂O，pH值7.5），每天腹腔注射两次。该试剂来自赛莱拉基因组公司。该剂量基于药代动力学数据，表明半衰期为4.2小时，初步数据表明，R-3032细胞外浓度为10μM，才能最大限度地抑制分离培养小鼠肝细胞（未显示）中TNF-α/放线菌素D介导的凋亡。R-3032是一种可逆的Ctsb抑制剂。这个K（K）_我Ctsb为0.02μM，而K（K）_我组织蛋白酶K为89μM，组织蛋白酶L为12μM，而组织蛋白酶S为3μM。这个K（K）_我Ctsb比其他溶酶体组织蛋白酶至少低2 log，且该药物不抑制caspases。因此，该药物是一种选择性Ctsb抑制剂。

组织学和TUNEL分析。

将肝脏切成5×5 mm的切片，在4%多聚甲醛中固定48小时，然后嵌入石蜡中（美国德克萨斯州休斯顿市科廷-马西森科学公司）。用切片机（Reichert Scientific Instruments，Buffalo，New York，USA）制备组织切片（4μm）并放置在玻璃载玻片上。苏木精和伊红染色根据标准技术进行。根据制造商的说明（原位细胞死亡检测试剂盒；美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏诊断公司），使用市售试剂盒进行TUNEL分析。通过计算30个随机显微镜低功率场（×630）中TUNEL阳性细胞的数量来定量肝切片中的肝细胞凋亡。

测定血清总胆红素、胆汁酸和丙氨酸转氨酶。

根据制造商的说明，使用商用分析试剂盒（Sigma-Aldrich诊断试剂盒编号505、550和450；美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich）测定血清总胆红素、血清总胆汁酸和血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）。

亚细胞组分的制备。

采用上述方法从小鼠肝脏制备细胞溶胶提取物（S-100）(10). 用Bradford测定法（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）测量蛋白质浓度。

免疫印迹分析。

将含有50μg蛋白质的S-100细胞溶质提取物等分样品进行15%SDS-PAGE，并转移到硝化纤维素膜上。首先在4°C下用小鼠抗细胞色素过夜探测膜c（c）抗体（PharMinen，San Diego，California，USA），稀释1:1000，然后与HRP结合的山羊抗鼠IgG二级抗体（BioSource International，Camarillo，Califorania，US）在室温下孵育45分钟。根据制造商的说明，印迹由增强化学发光系统（美国伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham Life Sciences Inc.）开发。

实时PCR。

使用Trizol试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen公司）从整个肝脏中获取总RNA。对于每个RNA样本，使用寡核苷酸-dT随机引物和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶将10μg等分样品逆转录成cDNA。如前所述，使用Taq聚合酶（Invitrogen Corp.）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原α1（I）（COL1A1）、TGF-β1和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的引物进行实时PCR(18). 使用炎症的实验引物如下：CXC趋化因子配体1（KC），正向5′-TGGATTCACCTCAAGAACA-3′，反向5′-TGGGACACCTTAGCATC-3′（产生167bp的产物）；巨噬细胞炎性蛋白-2（MIP-2），正向5′-CACACAACCAGGCTAC-3′，反向5′-GCTTCAGGCAAA-3′（221-bp）；GAPDH，正向5′-ACCAGAAGACTGTGGATGG-3′，反向5′-CATCGAAGGTGAGAGTGG-3′（340-bp）。GAPDH和18S引物（Ambion Inc.，Austin Texas，USA）均被用作RNA完整性的对照。所有PCR产物均经凝胶电泳证实。

实时PCR以LightCycler（德国曼海姆罗氏诊断公司）和SYBR绿色作为荧光团（美国俄勒冈州尤金市分子探针公司）进行。结果表示为来自相同RNA（各自cDNA）样本和PCR运行的看家基因18S和GAPDH的每毫升产品拷贝数与每毫升拷贝数的比率。

肝纤维化的测定。

肝纤维化用天狼星红定量。Sigma-Aldrich提供直接红80和快速绿FCF（颜色指数42053）。将肝脏切成5×5mm的切片，在4°C下浸泡在含4%多聚甲醛的PBS中固定24小时，并包埋在石蜡中。肌腱测微计部分安装在玻璃载玻片上。切片脱蜡，载玻片再水化，每5分钟清洗一次：二甲苯（两次）、100%乙醇（EtOH）、95%乙醇、70%乙醇、30%乙醇、1×PBS和蒸馏水（两次。将切片在室温下与含有0.1%固绿FCF和0.1%直接红80的饱和苦味酸水溶液孵育2小时。培养期间，用铝箔覆盖切片。将染色的载玻片在流动的蒸馏水下缓慢清洗6分钟，脱水（每一步3分钟），装上载玻片，并用光学显微镜检查。通过数字图像分析对红色胶原纤维进行定量，如下所述。

Bacus Laboratories Inc.Slide Scanner（BLISS）系统（美国伊利诺伊州伦巴第市）可将组织学图像作为图像块进行采集和量化。使用预先选择的放大镜（×40）自动扫描载玻片上的组织切片，并将捕获的亮场图像数字化为一系列像素，每个像素具有特定的光学密度。通过使用仪器软件对像素进行数学处理，对捕获的图像进行量化。对于天狼星红，定量是基于测定色原的光密度。在6μm染色切片上进行定量组织形态计量学。该方法与前面描述的方法类似(21,22). 对每只动物的两个肺叶的两个横截面进行扫描。扫描区域被捕获为×40块瓷砖，BLISS在不了解样本的情况下进行评估。所有图像都是用一个40倍的镜头拍摄的，这是可用的最高放大倍数，分辨率为480×752像素。计算机自动测量每个瓷砖的组织学特征。使用仪器上的组织学等级软件分析每个捕获的瓷砖，并分离绿色和红绿色（RGB）过滤器。红色区域以数学方式除以RGB区域并乘以100%。这确定了胶原纤维阳性染色的百分比区域，提供了连续尺度上的定量值。使用BLISS系统捕获扫描区域。如前所述，在单个图像（像素分辨率480×752）上评估天狼星红染色质的定量组织形态计量学(18).

免疫组织化学。

使用兔多克隆抗体（NeoMarkers，Fremont，California，USA）对切片（5μm厚）进行髓过氧化物酶（MPO）染色，该抗体由制造商预先稀释，用于对福尔马林固定石蜡包埋组织进行染色。将切片与抗体在4°C下孵育过夜。阴性对照玻片在相同条件下与非免疫性免疫球蛋白孵育。二级试剂从DAKO LSAB2试剂盒（DAKO Corp.，Carpintia，California，USA）获得，3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物（Sigma-Aldrich）用于可视化。最后，用苏木精对组织进行复染。

BDL小鼠的肝脏炎症依赖于Ctsb。

肝细胞凋亡是肝脏中促进趋化因子生成和中性粒细胞浸润的促炎过程(6–8). 为了检测Ctsb在介导肝脏炎症中的作用，我们使用BDLCtsb公司^–/–和Ctsb公司^+/+并通过药物抑制BDL WT室友中的Ctsb来验证观察结果。小鼠接受BDL治疗3天。肝脏标本MPO（中性粒细胞标志物）的免疫组织化学检查显示BDL中有中性粒细胞浸润Ctsb公司^+/+，但不在BDL中Ctsb公司^–/–或R-3032处理过的BDLCtsb公司^+/+动物（图​（图3a）。三a） ●●●●。为了研究Ctsb介导的肝脏趋化因子表达的作用，从Ctsb公司^–/–，R-3032–处理Ctsb公司^+/+、和Ctsb公司^+/+接受BDL治疗3天的小鼠。使用实时PCR技术定量中性粒细胞趋化因子KC和MIP-2 mRNA转录物(4,24,25). 在Ctsb公司^+/+动物BDL治疗3天后，这两种转录物的mRNA增加了24倍或更多（图​（图3，三、b和c）。更重要的是，KC和MIP-2的转录本在Ctsb公司^–/–和R-3032–经过处理Ctsb公司^+/+BDL动物与Ctsb公司^+/+BDL小鼠（图​（图3，三、b和c）。这些数据表明，中性粒细胞相关炎症发生在胆汁淤积症中，并与Ctsb相关的肝损伤相耦合。

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图3

中性粒细胞浸润和趋化因子表达增加Ctsb公司^+/+与…相比Ctsb公司^–/–和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠。小鼠固定肝脏标本进行MPO染色，这是一种中性粒细胞标记物。中性粒细胞浸润仅见于Ctsb公司^+/+BDL小鼠(一)（原始放大倍数×20）。手术后三天，取肝组织，按方法中所述分离肝总RNA。(b条和c（c）)通过实时PCR定量MIP-2和KC的表达。使用GAPDH mRNA作为看家基因，将表达标准化为比率。将该比率的值1任意分配给从假手术获得的数据Ctsb公司^+/+老鼠。KC mRNA表达Ctsb公司^+/+BDL高于Ctsb公司^–/–(P（P）<0.0001）和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠(P（P）< 0.0001,n个=每组4个）。MIP-2 mRNA的表达在Ctsb公司^+/+比英寸Ctsb公司^–/–(P（P）<0.0001）和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠(P（P）< 0.0001,n个=每组4个）。

BDL小鼠的肝纤维化是Ctsb依赖性的。

为了研究Ctsb介导的肝损伤在肝纤维化形成中的作用，从小鼠肝脏中提取mRNACtsb公司^–/–，R-3032–处理Ctsb公司^+/+、和Ctsb公司^+/+接受BDL治疗3天的小鼠。用实时PCR技术定量反映HSC激活的α-SMA mRNA转录物。在Ctsb公司^+/+动物BDL治疗3天后，该转录物的mRNA与假手术对照组相比增加，表明胆汁淤积模型中的星状细胞激活（图​（图4a）。4a） ●●●●。α-SMA的转录本在Ctsb公司^–/–和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL动物与Ctsb公司^+/+BDL小鼠（图​（图4a）。4a） ●●●●。这些数据表明，胆汁淤积症中HSC的激活部分依赖于Ctsb。

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图4

HSC激活标记增加Ctsb公司^+/+与…相比Ctsb公司^–/–和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠。手术后三天，取肝组织，按方法中所述分离肝总RNA。通过实时PCR定量α-SMA、TGF-β1、COL1A1和TIMP。使用18S和GAPDH mRNA作为看家基因，将表达标准化为比率。该比率的值1被任意指定给从sham-operatedCtsb公司^+/+老鼠。(一)α-SMA mRNA表达Ctsb公司^+/+BDL高于Ctsb公司^–/–(P（P）<0.0001）和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠(P（P）< 0.0003,n个=每组4个）。(b条)TGF-β1 mRNA的表达在Ctsb公司^+/+比中的Ctsb公司^–/–(P（P）<0.0001）和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠(P（P）< 0.0001,n个=每组4个）。(c（c）)COL1A1 mRNA的表达在Ctsb公司^+/+BDL小鼠，在Ctsb公司^–/–(P（P）<0.0001）和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠(P（P）< 0.0001,n个=每组4个）。(d日)TIMP mRNA的表达在Ctsb公司^+/+,Ctsb公司^–/–和R-3032–处理Ctsb公司^+/+BDL小鼠(P（P）=NS，n个=每组4个）。

确定观察到的HSC活化指标是否也与纤维化有关(17)，定量了与纤维生成有关的分子的转录本。TGF-βmRNA，一种在肝纤维化中起重要作用的细胞因子(26)，在BDL中更大Ctsb公司^+/+与BDL相比Ctsb公司^–/–和R-3032–处理过的BDLCtsb公司^+/+鼠标（图​（图4b）。4b） ●●●●。BDL中COL1A1 mRNA表达也显著增加Ctsb公司^+/+与Ctsb公司^–/–和R-3032–处理过的BDLCtsb公司^+/+鼠标（图​（图4c）。4c） ●●●●。在慢性肝损伤中，活化的星状细胞是金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的主要来源，该抑制剂通过MMPs抑制胶原降解并保护HSC免受凋亡(27–29). 然而，与α-SMA、TGF-β和COL1A1的增加相比，TIMP mRNA的改变是适度的，实验组之间没有显著差异（图​（图4d）。4d） ●●●●。总之，这些数据表明Ctsb介导的肝损伤与HSC激活和肝纤维化有关。

这项工作得到了德国学术交流服务博士后项目向a.Canbay提供的奖学金、NIH向G.J.Gores提供的DK063947以及梅奥基金会的支持。感谢艾琳·邦古姆的秘书协助。我们感谢Darren L.Riehle和James Tarara在数字图像分析方面提供的卓越技术援助。