美国国家科学院院刊。2006年10月31日；103(44): 16296–16300.
PI3K的p110α亚型对适当的生长因子信号转导和致癌转化至关重要
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让·J·赵
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院外科02115
Hailing Cheng公司
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
†外科，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞州02115
贾世东
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
以下部门§病理学和
李旺
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
Ole V.Gjoerup公司
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
以下部门§病理学和
阿基·米卡米
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
托马斯·罗伯茨
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
以下部门§病理学和
*Dana–Farber癌症研究所癌症生物学系
以下部门§病理学和
†马萨诸塞州波士顿哈佛医学院外科02115
由R.John Collier传达，哈佛医学院，马萨诸塞州波士顿，2006年9月15日。
作者贡献：J.J.Z和T.M.R.设计的研究；J.J.Z.、H.C.、S.J.、L.W.和A.M.进行了研究；J.J.Z.贡献了新的试剂/分析工具；J.J.Z.、H.C.、O.V.G.和T.M.R.分析数据；J.J.Z.和T.M.R.撰写了这篇论文。
摘要
生长因子信号通过IA类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）介导。在这类酶中，只有p110α由PIK3CA公司已发现该基因在人类癌症中发生突变。为了确定p110α的特定功能，我们培育了携带条件靶向等位基因PIK3CA公司基因。这里，我们报告PIK3CA公司-敲除小鼠胚胎成纤维细胞对各种生长因子的反应缺乏细胞信号传导，不能分化为脂肪细胞，并且对多种致癌受体酪氨酸激酶诱导的致癌转化具有抵抗力，表明p110α在这些生物学过程中起着基础性作用。
关键词：脂肪细胞分化、癌症治疗、条件敲除、，PIK3CA公司
IA类PI3K是由p110催化亚单位复合到调节亚单位家族之一（p85α、p55α、p50α、p85β、p55γ）组成的异二聚体脂质激酶，统称为p85(1,2). 为了响应生长因子刺激和随后受体酪氨酸激酶（RTKs）的激活，IA类PI3Ks通过p85亚基与激活受体上含有磷酸酪氨酸的基序的相互作用被募集到膜上。PI3K的p110催化亚基随后催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP）的磷酸化2)形成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP三). 脂质第二信使PIP三反过来激活Ser/Thr激酶AKT和其他下游效应器来调节多种细胞功能，包括增殖、存活和迁移。p110催化亚单位（α、β和δ）有三种亚型，由PIK3CA公司,PIK3CB公司、和PIK3CD公司基因。p110α和p110β亚型普遍表达，而p110δ亚单位主要存在于白细胞中(三,4). 值得注意的是，在这些亚型中，只有p110α被发现在人类肿瘤中频繁突变(5)表明单个p110亚型在正常信号传导和致癌转化中具有不同的作用。以前在小鼠中使用基因靶向的研究表明，p110δ在淋巴细胞、肥大细胞和可能的中性粒细胞的发育和功能中起着重要作用(6–10). 然而，缺乏p110α或p110β的小鼠在胚胎发育早期死亡(11,12)这就排除了通过基因消融来描述单个p110α和p110β亚型的功能。最近的文章使用小鼠杂合子敲除p110α激酶死亡等位基因(13)或PI3K-p110α小分子抑制剂(14)研究其在胰岛素信号转导中的作用。在这里，我们首次报道了PI3K-p110α完全基因消融对一组生长因子、脂肪细胞分化和致癌转化诱导的信号传导的影响。引人注目的是，我们观察到敲除这一单一亚型能够阻断正常和致癌生长因子信号通路。
结果和讨论
为了研究p110α在信号转导中的特殊作用，并将其作为致癌生长因子信号转导的潜在治疗靶点，我们利用Cre-loxP介导的重组系统，有条件地使p110α失活PIK3CA公司基因。构建了一个靶向载体，其中小鼠的外显子1PIK3CA公司基因两侧有loxP位点，在外显子1和左loxP位置之间插入FRT侧翼选择盒(一). 在选择这一策略时，我们瞄准了在早期传统淘汰赛中被删除的同一区域(11). 靶向结构同源重组到PIK3CA公司将含有重组子的克隆与表达FLP重组酶的质粒瞬时转染到ES细胞的位点，以去除FRT侧翼的选择盒(一). 合成的ES克隆携带一个floxed等位基因PIK3CA公司将其注射到小鼠囊胚中以产生嵌合小鼠。雄性嵌合体与C57BL/6雌性进行杂交，通过Southern blot分析证实了生殖系的传播(B类)和基因组PCR（数据未显示）。将产生的丝线杂交产生纯合子丝线小鼠。
目标载体和Cre公司-p110α的介导性缺失。(一)目标载体和删除策略示意图。编码p110α的编码外显子显示为填充框。HTK表示潮霉素和胸苷激酶选择盒，两侧为FRT重组位点。HTK的表达由磷酸甘油激酶（PGK）启动子以与p110α转录相反的方向转录驱动。指出了用于基因分型的5′和3′外部探针和PCR引物（P1和P2）的位置。(B类)野生型和阳性重组ES细胞基因组DNA的Southern blot分析。EcoRV消化液上的5′探针杂交或PstI消化液上3′探针杂交，在携带一个漂浮p110α等位基因的重组ES细胞中分别检测到5.0kb和6.3kb片段，HTK盒仍然存在。在重组ES克隆中切除FRT侧翼的HTK盒后，提取基因组DNA并用EcoRV和HindIII消化。如预期的那样，将5′探针杂交到消化的DNA上，在重组ES细胞中检测到10.2 kb的片段。(C类)对从p110α（+/lox）、（lox/lox）和（+/+）MEF中提取的基因组DNA进行PCR分析：使用上述引物P1和P2对絮凝MEF进行Ade-Core处理(一)较小的350-bp带代表p110α基因的缺失等位基因。(D类)p110α消融的Western blot分析：用p110α特异性抗体进行的Westernblot分析显示，全长p110α和潜在的截短形式的蛋白均不存在。
为了研究p110α消融对细胞对不同生长因子信号反应的影响，我们从p110α（+/lox）小鼠杂交获得的胚胎中制备了p110α、p110α和p110α小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）队列。第1代细胞感染了表达Cre公司重组酶（Ade-Cre）和Cre公司-通过基因组PCR监测携带p110α（+/lox）或p110α（lox/lox）的MEFs中外显子1的介导切除(C类). 接下来，我们通过Western blotting检测p110α的表达，寻找全长蛋白的表达和潜在的截短形式。如参考文献所述。11，位于外显子2内的下游起始密码子可能允许缺失等位基因的翻译，该等位基因可能产生缺失N末端p85结合域的p110α截断形式（～97 KD）。我们使用针对p110αp85结合域下游表位映射的抗体进行的Western blot分析未能检测到纯合敲除MEF中p110α的全长和理论截断形式(D类).
我们还测试了p110α消融对IA类PI3K家族其他成分表达的影响。p110a-null（−/−）MEF中p110β的蛋白水平与野生型p110α细胞（+/+）中的蛋白水平相等(一). 相反，p85的表达水平在p110α缺失时降低(一). 传统的p110α基因敲除产生的胚胎死亡过早，无法分离MEF，但p85在可获得的早期胚胎中过度表达(11). 然而，来自p110δ-基因敲除小鼠的B细胞中也发现p85水平降低(8)小鼠肝脏和肌肉中p110α和p110β的双杂合缺失(15). 在p110α基因敲除的MEF中，p110α免疫沉淀物中的脂质激酶活性被完全消除，而p110β免疫沉淀素的活性保持不变(B类).
缺乏p110α时PI3K亚基的表达和活性。(一)野生型（+/+）和p110α-空（−/−）MEF中pan-p85和p110β表达的Western blotting分析。请注意，在本图和以下所有图中，控制细胞（+/+）和p110α-敲除细胞（−/−）是p110α（lox/lox）细胞的等基因对，无（++）或有（−/−）Ade-Core处理。(B类)体外脂质激酶检测：从p110α（+/+）和（−/-）MEF中制备免疫沉淀，并用p110α或p110β特异性抗体，以磷脂酰肌醇磷酸酯为底物检测相关脂质激酶活性。三次实验的平均结果以任意单位（a.u.）表示。误差条指示SD。
为了评估p110α消融对PI3K信号转导的影响，我们测量了两种Ser-473的Akt磷酸化()和Thr-308（数据未显示），作为向静止细胞添加给定生长因子后不同时间PI3K活性的信号读出。我们首先研究了胰岛素和IGF-1的作用，这对生长激素在进化研究中与PI3K信号联系最密切。当用10μg/ml胰岛素（数据未显示）或20 ng/ml胰岛素样生长因子1（IGF-1）刺激静止细胞时，p110α-敲除MEF中的磷酸化Akt水平显著降低（高达90%）(一). 当用不同浓度的胰岛素刺激p110α-敲除细胞时，也观察到类似的胰岛素/IGF-1反应性丧失(B类). 与该观察结果一致，在缺乏p110α的情况下，胰岛素刺激也会降低PI3K/Akt下游几个组分的磷酸化水平(B类). 除了胰岛素信号外，我们还监测了p110α消融对EGF和PDGF受体下游PI3K信号的影响，这两种受体是成纤维细胞中另外两种常见的RTK。经EGF刺激后，p110α-敲除细胞中磷酸化Akt的诱导也受到影响(一). PDGF治疗后早期，p110α缺陷细胞中的磷蛋白Akt水平与野生型细胞中的水平一样高，但在PDGF刺激后60分钟，敲除细胞中的磷酸Akt相对于对照细胞显著降低(一). 因此，选择性损伤p110α同时保留其他p110亚型显著降低胰岛素、EGF和持续PDGF信号。
p110α缺失时对生长因子刺激的信号反应。(一)Ser-473的磷酸化Akt水平显示在用IGF1、EGF和PDGF刺激的野生型（+/+）和p110α-敲除（−/−）MEFs中。条形图反映了三个独立实验的平均±SD。(B类)在野生型（+/+）和p110α-敲除（−/−）MEF中，对胰岛素刺激15分钟后PI3K下游几个组分（Akt、S6K、FKHRL、GSK和4EBP1）的磷酸化水平进行了分析。
据报道，胰岛素/IGF-1受体及其下游底物IRS-1和IRS-2通过调节脂肪生成的两个关键转录因子PPARγ和C/EBPα的表达，在脂肪细胞分化中发挥重要作用(16). 已知Akt1/2也是PPARγ和C/EBPα诱导和脂肪细胞分化所必需的(17). 最近的两项研究都使用了p110α激酶缺失等位基因的“敲除”(13)和针对各种PI3k亚型的化学抑制剂(14)表明p110α是肝脏和脂肪细胞中主要的胰岛素/IRS反应性PI3K。然而，p110α在脂肪细胞分化中的作用尚未报道。为了研究p110α是否可能是IRS-1/IRS-2和Akt1/2在脂肪生成中的分子联系，我们使用3T3方案建立永生化野生型和p110α敲除型MEF，并对其进行标准方案诱导脂肪细胞分化。p110α-敲除细胞分化为脂肪细胞的能力明显受损，如一PPARγ和C/EBPα的表达(B类). 这些结果提供了强有力的遗传学证据，证明p110α亚型是脂肪细胞分化所必需的。
p110α基因敲除MEF中脂肪细胞分化受损。野生型（+/+）和p110α-敲除（−/−）3T3 MEF（第26代）生长融合，并与IBMX/DEX/胰岛素/罗格列酮诱导分化。(一)诱导7天后，用油红O染色细胞。(B类)采用实时RT-PCR分析野生型和敲除型细胞诱导前（第0天）和诱导后（第7天）PPARγ和C/EBPαmRNA水平，以TBP作为内部对照。数据表示三个独立实验的平均值±SD。
以前试图确定p110α缺失对生长因子信号转导的生物学影响的研究几乎只关注胰岛素的代谢反应。因为自然界似乎已经挑出p110α在癌症中的激活，我们想知道它是否在介导致癌生长因子信号传导中也发挥重要作用。因此，我们研究了p110α消融对胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）和EGF受体（EGFR）组成性激活驱动的致癌转化的影响。初级鼠细胞可以转化在体外通过两个协同致癌事件(18). p53通路的失活通常是第一个，随后发生癌基因的激活。我们首先通过逆转录病毒介导的基因转导稳定引入显性阴性p53突变体（p53DD），使野生型和漂浮型p110αMEF永生化。为了产生实验细胞，腺病毒表达Cre公司在p53DD永生化p110α（lox/lox）MEF中引入消融p110α表达，而在同等代次的亲本p53DD-永生化p101α（lox2/lox，野生型MEF作为对照。为了评估致癌IGF-1信号，我们通过逆转录病毒感染，用野生型IGF-1R转导p53DD永生化对照和p110α敲除MEF的单层。这些MEF在血清减少（2%FBS）的培养基中培养，但在IGF-1（50 ng/ml）或胰岛素升高（30μg/ml）的情况下培养，以使病灶出现。IGF-1R的过度表达与IGF-1或胰岛素的添加相结合足以促进野生型MEF中的病灶形成，但在p110α-敲除细胞中不足以促进病灶形成(). 由于我们观察到p110α缺陷细胞与对照细胞相比，其群体倍增时间延长，因此我们特意在延长培养期内寻找病灶形成，但未能观察到p101α敲除细胞中出现任何病灶。单独的测量表明，p110α-敲除细胞表达的IGF-1R水平与对照细胞相当（数据未显示）。值得注意的是，p110α缺陷细胞并非不受转化的影响。p110αH1047R的肿瘤衍生激活突变版本和src的致癌等位基因v-src都能在野生型和p110α敲除细胞中以同等水平升高病灶(). 已发表的实验预测了后一结果，表明v-src介导的NIH 3T3细胞转化不能被p85显性阴性形式的表达所阻断(19). 此外，Vogt小组最近的一项研究表明，雷帕霉素阻断了活性PI3K突变体诱导的细胞转化，但未能干扰v-src诱导的致癌转化(20).
p110α的消融削弱了由各种致癌信号诱导的转化。p53DD永生化p110α（+/+）和（−/−）MEF均感染了一种控制性空载体病毒，一种过度表达野生型IGF1R的病毒，或携带多种致癌基因的病毒：EGFR、L858R-EGFR、NeuT-HER2的突变等位基因，或p110α、H1047R的肿瘤突变等位蛋白，如图所示。用表达v-src的pSG5转染细胞。然后在含有5%FBS或2%FBS的培养基中培养细胞，但如果细胞感染了IGF1R，则添加胰岛素（30μg/ml）或IGF1（50 ng/ml）。当野生型MEF培养3周，p110α-敲除（−/−）细胞培养4.5周时，对Foci进行评分。
EGFR在许多类型的人类癌症中经常发生突变，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和脑肿瘤。在20%-30%的原发性人类乳腺肿瘤中，HER2/Neu的表达或激活增强(21). 早期的研究表明，PI3K通路对HER2介导的细胞信号传导和转化很重要(22)，但没有证明HER2/Neu介导的致癌信号传导需要哪些PI3K亚型。鉴于NeuT公司，构成激活的等位基因HER2型/Neu公司(23)，在对照细胞中有效地提高了foci，在p110α-敲除细胞中只形成了微小的foci(). 我们的结果表明p110α对HER2/Neu介导的致癌转化很重要。
我们还选择了两个在非小细胞肺癌中发现的体细胞激活EGFR突变体进行分析：一个小的框内缺失突变等位基因（L747_E749del，A750P）和EGFR的ATP-结合区内的错义替换（L858R）(24). 先前的研究表明，Akt途径优先激活EGFR突变等位基因下游(25). 有趣的是，我们发现两种EGFR肿瘤突变体都能在野生型MEF中形成大的病灶，但在p110α缺陷细胞中仅诱导微小的病灶(和数据未显示）。即使在扩大培养的情况下，这些微焦点仍然很小。再次，单独的分析表明，EGFR突变体在p110α-敲除细胞和对照细胞中同样表达良好（数据未显示）。关于PI3K/Akt途径在EGFR突变转化细胞中的重要性，结果与Engelman的研究结果非常一致等。(26). 总之，我们的数据强烈表明，尽管其他p110α亚型持续表达，但p110α异构体的消融阻止了IGF1、胰岛素或EGF信号过度激活引起的致癌转化。
最近的研究发现，大约30%的脑、乳腺和结肠肿瘤携带激活性突变PIK3CA公司该基因强调了p110α亚型在肿瘤发生中的重要性，并增强了用小分子抑制剂靶向PI3K的兴趣。希望这些化合物对p110α本身、PTEN（负调控PI3K通路的肿瘤抑制因子）以及激活其生长因子受体突变的肿瘤具有临床益处。PI3K家族的化学抑制剂的最新数据表明，p110α和mTOR的双重抑制剂可以作为异种移植阻断肿瘤细胞系的生长(27). 这里提供的数据表明，仅p110α亚型的基因消融可以显著削弱许多激活的RTK和致癌Ras的致癌作用。因此，p110α的异构体特异性抑制可能足以中断癌症中多个上游事件产生的致癌信号。
材料和方法
条件靶向p110α小鼠和MEF的产生。
这个PIK3CA公司通过从129/SvJ小鼠基因组文库中分离包含外显子1–5的8.1-kb基因组片段，并将其亚克隆到pKO915-DT（德克萨斯州伍德兰Lexicon Genetics）中，构建基因靶向结构。在外显子1上游插入一个loxP位点。然后将FRT侧翼的潮霉素和胸苷激酶（HTK）选择盒和第二个loxP位点插入外显子1下游的EcoRV位点，从而破坏该限制位点。将构建物电穿孔到胚胎干细胞中，并使用同源重组区以外的探针通过Southern blot分析鉴定正确靶向的重组ES克隆。在分析的192个ES细胞克隆中，有11个在正确的位点进行了同源重组。用pCAGGS-FLPe（哈佛医学院S.M.Dymecki赠送的礼物）瞬时转染四个重组ES克隆，以去除FRT侧翼的HTK盒。通过Southern blotting和基因组PCR鉴定丢失HTK盒的ES克隆。使用两个正确靶向和核型正常的ES克隆来产生嵌合体漂浮p110α小鼠。雄性嵌合体被培育成C57BL/6雌性。通过PCR和Southern印迹鉴定了该种系的传播。
Dana-Farber癌症研究所和哈佛医学院的机构动物护理和使用委员会批准了动物护理和方案。
MEF培养和基因分型。
从p110α（lox/+）杂交的第13.5天胚胎中制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。我们的实验使用了来自同窝胚胎的MEF，以最小化遗传变异。MEF在第1代被腺病毒CMV-Cre（Ade-Cre）（基因转移载体核心，爱荷华州爱荷华市）感染两次，或在Ade-Core感染前被p53DD永生化，以进行病灶形成分析。使用引物对P1（5′-CTG TGT AGC CTA GTT TAG AGC AAC CAT CTA）和P2（5’-ACA GCC AAG GCT ACA CAG AAC CCT GTC TTG）通过PCR进行基因分型，扩增出野生型等位基因的900-bp片段、loxP等位基因1100-bp片段和缺失等位基因350-bp片段。Cre公司-基因外显子1的介导性缺失PIK3CA公司通过Southern印迹和测序验证了该基因。原代MEFs和p53DD永生化MEFs均在补充有10%FCS和10单位/ml青霉素和10μg/ml链霉素的DMEM中培养。
生长因子刺激、细胞裂解物和Western印迹。
对于生长因子刺激，细胞在无血清的DMEM（Invitrogen，CA）中饥饿2小时，然后用胰岛素、IGF1、EGF或PDGF刺激，如如前所述，对细胞进行裂解和处理以进行蛋白质印迹(28). 抗p110α、抗磷酸化Akt（Ser-473或Thr-308）、抗Akt、抗p70 S6激酶、抗磷化S6激酶（Thr-389）、抗GSK-3b、抗磷蛋白-GSK-3a/b（Ser-21/9）、抗磷蛋白-4E-BP1（Ser-65）和抗ani-4E-BP1抗体均来自（马萨诸塞州贝弗利市细胞信号技术）。从Upstate Biotechnology（纽约州普莱西德湖）获得抗p85抗体、抗磷酸化FKHRL1（Thr-32）和抗FKHRL。这种抗p110α抗体是针对与p85结合域下游区域匹配的肽而产生的（如Cell Signaling Technology的客户支持所述）。抗病毒抗体来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。
体外试验脂激酶测定。
体外脂质激酶分析基本上按所述进行(15). 简单地说，用新制备的细胞裂解物中的抗p110α或p110β制成的免疫沉淀物经过在体外以磷脂酰肌醇（PI；Avanti Polar lipid，Alabaster，AL）为底物的脂质激酶分析。磷酸化脂类通过锡层色谱（TLC）分离6 h。磷酸化三酰糖醇3-磷酸（PIP）的放射性通过荧光成像仪（分子动力学）进行可视化和定量。
脂肪细胞分化。
如前所述，通过添加罗格列酮的标准方案进行脂肪眼分化诱导(16).
焦点形成分析。
为了形成病灶，细胞单层被各种逆转录病毒感染，包括pBabe-IGF1R（哈佛医学院C.R.Kahn善意提供）、pBabe-EGFR突变体、L747_E749del、A750P和L858R（哈佛大学医学院M.Meyerson善意提供），pBabe-NeuT、pBabe-MT和pBabe-H1047R，或转染pSG5-v-src（由马萨诸塞州波士顿大学C.Chen善意提供）。用于感染的稀释液是根据试点实验中病灶形成细胞的数量确定的。为了确定转导蛋白的表达水平，平行板进行药物选择并通过Western blotting进行分析。在所有情况下，对照细胞和实验细胞中的蛋白质表达水平是可比较的。转导后，MEF在含有5%FCS（2%FCS加30μg/ml胰岛素或50 ng/ml IGF1R的IGF1R感染细胞）的DMEM中培养，野生型细胞不分裂3周，p110a敲除细胞不分裂4.5周。培养基每3天更换一次。合并有病灶的单层培养物用0.5%结晶紫在10%乙醇中染色。
致谢
我们感谢L.Cantley博士、C.D.Stiles博士和J.D.Iglehart博士的建议；S.H.Lee博士、S.Brachmann博士和Z.Liu博士为脂质激酶检测提供帮助；G.Girnun博士、C.Walkey博士和M.Uldry博士为脂肪细胞分化实验提供帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款P01-CA50661（给T.M.R.）、P01-CA089021（给T.M.R.）和CA30002（给T.MR.）的支持；NIH卓越研究专项计划奖5P50CA090381-05（授予J.J.Z.）；克劳迪娅·巴尔奖（授予J.J.Z.）；以及国防部拨款BC051565（J.J.Z.）。
缩写
| 表皮生长因子受体 | EGF受体 |
| HTK公司 | 潮霉素胸苷激酶 |
| MEF公司 | 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| 项目实施计划 | 3-磷酸磷酰糖醇 |
| RTK公司 | 受体酪氨酸激酶。 |
脚注
利益冲突声明：根据哈佛医学院指南，我们披露T.M.R.与诺华制药公司和Upstate生物技术公司有咨询关系。
工具书类
1Fruman DA、Meyers RE、Cantley LC。生物化学年度收益。1998;67:481–507.[公共医学][谷歌学者] 2Vanhaesebroeck B、Leevers SJ、Ahmadi K、Timms J、Katso R、Driscoll PC、Woscholski R、Parker PJ、Waterfield MD。生物化学年度收益。2001;70:535–602.[公共医学][谷歌学者] 三。Chantry D、Vojtek A、Kashian A、Holtzman DA、Wood C、Gray PW、Cooper JA、Hoekstra MF。生物化学杂志。1997;272:19236–19241.[公共医学][谷歌学者] 4Vanhaesebroeck B、Welham MJ、Kotani K、Stein R、Warne PH、Zvelebil MJ、Higashi K、Volinia S、Downward J、Waterfield MD。美国国家科学院程序。1997;94:4330–4335. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5.Bachman KE、Argani P、Samuels Y、Silliman N、Ptak J、Szabo S、Konishi H、Karakas B、Blair BG、Lin C等。癌症生物治疗。2004;三:772–775.[公共医学][谷歌学者] 6Okkenhaug K、Bilancio A、Farjot G、Priddle H、Sancho S、Peskett E、Pearce W、Meek SE、Salpekar A、Waterfield MD等。科学。2002;297:1031–1034.[公共医学][谷歌学者] 7Jou ST、Carpino N、Takahashi Y、Piekorz R、Chao JR、Wang D、Ihle JN。分子细胞生物学。2002;22:8580–8591. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Clayton E、Bardi G、Bell SE、Chantry D、Downes CP、Gray A、Humphries LA、Rawlings D、Reynolds H、Vigorito E、Turner M。《实验医学杂志》。2002;196:753–763. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9.Puri KD、Doggett TA、Douangpanya J、Hou Y、Tino WT、Wilson T、Graf T、Clayton E、Turner M、Hayflick JS、Diacovo TG。鲜血。2004;103:3448–3456.[公共医学][谷歌学者] 10Ali K、Bilancio A、Thomas M、Pearce W、Gilfillan AM、Tkaczyk C、Kuehn N、Gray A、Giddings J、Peskett E等。自然。2004;431:1007–1011.[公共医学][谷歌学者] 11Bi L、Okabe I、Bernard DJ、Wynshaw-Boris A、Nussbaum RL。生物化学杂志。1999;274:10963–10968.[公共医学][谷歌学者] 12Bi L、Okabe I、Bernard DJ、Nussbaum RL。哺乳动物基因组。2002;13:169–172.[公共医学][谷歌学者] 13Foukas LC、Claret M、Pearce W、Okkenhaug K、Meek S、Peskett E、Sancho S、Smith AJ、Withers DJ、Vanhaesebroeck B。自然。2006;441:366–370.[公共医学][谷歌学者] 14Knight ZA、Gonzalez B、Feldman ME、Zunder ER、Goldenberg DD、Williams O、Loewith R、Stokoe D、Balla A、Toth B等。单元格。2006;125:733–747. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Brachmann SM、Ueki K、Engelman JA、Kahn RC、Cantley LC。分子细胞生物学。2005;25:1596–1607. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Miki H、Yamauchi T、Suzuki R、Komeda K、Tsuchida A、Kubota N、Terauchi Y、Kamon J、Kaburagi Y、Matsui J等。分子细胞生物学。2001;21:2521–2532. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17.Peng XD、Xu PZ、Chen ML、Hahn-Windgassen A、Skeen J、Jacobs J、Sundararajan D、Chen WS、Crawford SE、Coleman KG、Hay N。基因发育。2003;17:1352–1365. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18土地H，帕拉达LF，温伯格RA。自然。1983;304:596–602.[公共医学][谷歌学者] 19.Rodriguez-Viciana P、Warne PH、Khwaja A、Marte BM、Pappin D、Das P、Waterfield MD、Ridley A、Downward J。单元格。1997;89:457–467.[公共医学][谷歌学者] 20Kang S、Bader AG、Vogt PK。美国国家科学院程序。2005;102:802–807. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Berger MS、Locher GW、Saurer S、Gullick WJ、Waterfield MD、Groner B、Hynes NE。癌症研究。1988;48:1238–1243.[公共医学][谷歌学者] 22Yakes FM、Chinratanab W、Ritter CA、King W、Seelig S、Arteaga CL。癌症研究。2002;62:4132–4141.[公共医学][谷歌学者] 23Bargmann CI、Hung MC、Weinberg RA。单元格。1986;45:649–657.[公共医学][谷歌学者] 24Paez JG、Janne PA、Lee JC、Tracy S、Greulich H、Gabriel S、Herman P、Kaye FJ、Lindeman N、Boggon TJ等。科学。2004;304:1497–1500.[公共医学][谷歌学者] 25Sordella R、Bell DW、Haber DA、Settleman J。科学。2004;305:1163–1167.[公共医学][谷歌学者] 26Engelman JA、Janne PA、Mermel C、Pearlberg J、Mukohara T、Fleet C、Cichowski K、Johnson BE、Cantley LC。美国国家科学院程序。2005;102:3788–3793. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Fan QW、Knight ZA、Goldenberg DD、Yu W、Mostov KE、Stokoe D、Shokat KM、Weiss WA。癌细胞。2006;9:341–349. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28.赵JJ，刘Z，王L，申E，洛达MF，罗伯茨TM。美国国家科学院程序。2005;102:18443–18448. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
