MYC失活后肿瘤的持续消退需要p53或血小板反应蛋白-1来逆转血管生成开关

p53功能丧失促进肿瘤复发。

p53功能丧失在肿瘤中很常见(22)并且被描述为在肿瘤复发中起着关键作用(13). 因此，我们分析了在我们的淋巴瘤模型中，p53缺失是否会促进MYC失活后的肿瘤复发。与这种可能性相一致的是，MYC失活后复发的原发性淋巴肿瘤通常表现为p53表达缺失(图1B类). 为了直接研究p53功能丧失的影响，我们产生了一组小鼠，这些小鼠表达了条件MYC转基因，同时缺失了一个p53等位基因。与以前的报告类似(23–26)一个p53等位基因的缺失足以加速肿瘤的发生，使肿瘤发病的平均潜伏期缩短3周（图5一,P（P）< 0.0001). 由条件MYC转基因诱导的原发性肿瘤表达p53 mRNA和蛋白，而由p53基因杂合子小鼠引起的原发肿瘤则失去了p53 mDNA和蛋白表达，这在某些情况下可以解释为第二个p53等位基因的丢失(图1C类和5B类).

原发性p53阴性肿瘤在MYC持续失活后均开始退化，小鼠临床上恢复，但与原发性野生型p53肿瘤相比，这些肿瘤总是复发(图1一,P（P）= 0.0002;图2). 我们的结果有几种可能的解释。首先，p53功能的丧失可能促进肿瘤绕过Tet系统并表达MYC转基因或激活内源性C-、N-或L-MYC表达的能力。然而，当检测复发肿瘤的MYC蛋白表达时，未观察到人类MYC转基因或内源性C-、N-或L-MYC蛋白的过度表达（图6，作为PNAS网站上的支持信息发布）。因此，复发的肿瘤已经独立于MYC表达，与我们所描述的情况类似(6).

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图2。

p53状态和MYC灭活后肿瘤细胞清除率。(一)MYC灭活后肿瘤细胞清除率的测定。p53野生型（p53⁺)，p53阴性（p53⁻)和p53恢复（p53⁻到⁺)在皮下注射到同基因小鼠之前，用荧光素酶逆转录病毒标记肿瘤细胞。在MYC灭活前后的指定时间，通过生物发光成像对小鼠进行连续成像，以监测移植瘤生长（MYC-On）和强力霉素治疗（100μg/ml）后的肿瘤消退（MYC Off）。显示了荧光素酶活性变化的总结。每个队列包括至少5只小鼠。显示了三个实验之一的代表性数据。(B类)生物发光成像的代表性图像。

另一种可能性是，MYC过度表达和p53表达缺失背景下产生的肿瘤是不同类型的淋巴瘤，这可能解释了它们对MYC失活的不同反应。虽然不能排除这种可能性，但MYC过表达与MYC过度表达和p53缺失诱导的肿瘤表现出相似的组织学和相同的FACS表型：Thy-1、CD4、CD8、CD3、CD5和T细胞抗原受体αβ阳性（数据未显示）。另一种可能性是，p53缺失导致基因组失稳，促进肿瘤获得基因事件的能力，从而补偿MYC过度表达的缺失。然而，我们之前对肿瘤进行了光谱核型分析，未能检测出p53阳性与阴性肿瘤的基因组异常差异(6). 最后一种可能性是，p53缺失通过阻止肿瘤细胞的消除，使肿瘤摆脱了对MYC过度表达的依赖。

p53缺失损害MYC失活后肿瘤细胞的根除。

为了准确评估p53功能缺失如何影响MYC失活后的肿瘤消退，我们使用生物发光成像(27)比较MYC灭活后移植p53阳性和阴性肿瘤消除的动力学体内我们将荧光素酶逆转录导入肿瘤衍生细胞系。检测到荧光素酶标记的细胞时，每个位点的最低灵敏度为1000个细胞，并且细胞数量超过多个对数范围（数据未显示）。用荧光素酶标记的p53阳性或阴性肿瘤皮下接种小鼠队列，并在MYC灭活前后监测发光信号的强度，以测量肿瘤消退的动力学(图2一). p53的肿瘤消退初始率相似⁺和p53⁻MYC灭活前2天内的肿瘤和肿瘤减少的第一个日志(图2). 然而，2天后，p53⁺肿瘤被迅速消除，而p53⁻MYC失活后，肿瘤继续在宿主中存在。在MYC灭活19天后，在注射p53的小鼠中检测到生物发光信号⁻在注射p53的小鼠中观察到肿瘤细胞完全消除⁺肿瘤细胞(图2). 因此，p53的缺失对MYC失活的最初后果没有影响，但阻止了肿瘤细胞的完全根除。

p53缺失阻断MYC失活后TSP-1介导的抗血管生成反应。

血管生成对肿瘤的扩大至关重要(28). MYC癌基因已被证明可以调节血管生成，并特异性抑制抗血管生成调节剂TSP-1的表达(29–32). 相反，p53被描述为抑制肿瘤血管生成，也被证明调节TSP-1(33,34). 因此，我们推测p53的缺失可能通过阻断TSP-1介导的抗血管生成反应，阻碍MYC失活后的肿瘤完全消退。在肿瘤发生时和MYC失活后6天，通过免疫荧光检测移植的p53阳性和阴性肿瘤的微血管密度（CD31）和TSP1表达(图3一和B类). 而p53状态在肿瘤发病期间并不影响CD31或TSP-1的表达(图3一，MYC-On），在MYC失活后观察到TSP-1表达的显著差异(图3一，MYC关闭）。重要的是，p53⁻尽管MYC失活，但肿瘤中TSP-1表达水平显著降低。p53中TSP-1表达降低⁻Western印迹分析也证实了肿瘤细胞(图3B类). 为了进一步证实p53缺失影响MYC失活后的血管生成程序，通过内皮细胞特异性CD31染色评估肿瘤微血管密度。即使在MYC灭活六天后，我们也注意到p53缺陷肿瘤中持续存在较大的管腔血管，而p53⁺肿瘤CD31染色减少(图3一). 使用TUNEL分析，我们观察到p53中的内皮细胞凋亡⁺，但不是p53⁻MYC失活后的肿瘤。此外，在MYC失活之前，p53中的微血管密度（MVD）相似⁺和p53⁻肿瘤。然而，在MYC失活后，p53⁺，但不是p53⁻肿瘤，MVD显著降低(图3C类). 这些数据共同表明p53⁻肿瘤未能诱导足够水平的TSP-1介导对MYC失活的适当抗血管生成反应，而MYC的失活是肿瘤完全和持续消退所必需的。

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图3。

p53状态改变了MYC失活后肿瘤的血管生成反应。(A左边)p53状态不影响MYC激活后肿瘤发生的血管生成反应。p53野生型（p53⁺)，p53阴性（p53⁻)和p53恢复（p53⁻到⁺)用免疫荧光法检测移植瘤的微血管密度（CD31）和TSP-1表达（MYC on）。(A正确)尽管MYC失活，但p53的缺失降低了TSP-1水平。p53野生型（p53⁺)，p53阴性，p53恢复（p53⁻到⁺)在MYC失活（MYC-Off）6天后，用免疫荧光法检测移植瘤的微血管密度（CD31）和TSP-1表达。尽管TUNEL反应水平没有显著差异，但在p53野生型（p53⁺)和p53恢复（p53⁻到⁺)肿瘤与p53阴性（p53⁻)肿瘤。用同型匹配的对照抗体对连续肿瘤切片进行免疫染色，以确保染色的特异性。(B类)p53野生型（p53）的Western blot分析⁺)和p53阴性（p53⁻)在MYC激活和MYC灭活6天后，对移植瘤进行TSP-1表达检测。密度分析显示野生型p53（p53）中TSP-1的表达显著升高⁺)与β-actin相关的肿瘤细胞与p53阴性（p53⁻)肿瘤细胞。(C类)定量每高倍视野（hpf）的微血管密度（MVD）显示p53阴性（p53）患者的MVD/hpf显著增加⁻)MYC失活6天后肿瘤与p53野生型（p53⁺)肿瘤。在有代表性的肿瘤切片中至少统计了五个区域，并分析了至少两个不同的移植肿瘤。数值表示为平均值±标准偏差。

p53的恢复允许MYC失活后的肿瘤持续退化。

p53缺失通过阻止MYC失活诱导的血管生成抑制导致肿瘤退化缺陷。我们推断，通过恢复p53，我们将诱导更完整的抗血管生成反应，并随后在MYC失活后维持肿瘤退化。为了研究p53修复的后果，三种不同的p53⁻用p53逆转录肿瘤衍生细胞系（6814、7031和B-1601）。重要的是，通过Western blot分析（图7，作为PNAS网站上的支持信息发布）测量，发现p53蛋白表达水平与几个p53阳性的肿瘤衍生细胞系相当。

然后我们研究了p53修复是否会挽救TSP-1的表达并减少肿瘤新生血管。检测移植p53修复（p53）中TSP-1和CD31的水平⁻到⁺)MYC灭活6天后分离肿瘤标本。p53的异位表达导致与p53相当的TSP-1水平的恢复⁺MYC失活后的肿瘤(图3一). 此外，CD31和TUNEL染色显示p53修复后内皮细胞凋亡增加，微血管密度降低（p53⁻到⁺)肿瘤(图3 一和C类).

最后，我们研究了p53修复对肿瘤细胞清除动力学的影响体内通过生物发光成像使MYC失活。我们发现移植的p53修复的肿瘤显示出与p53相当的快速和完全的肿瘤细胞清除⁺肿瘤(图2). 因此，p53的恢复现在允许在MYC失活后完全消除肿瘤细胞体内.

肿瘤监测和致瘤性分析。

每两周观察一次转基因小鼠的肿瘤生长情况。当小鼠因肿瘤负担而奄奄一息时，他们要么被人道地安乐死，要么在饮用水（100μg/ml）中使用强力霉素治疗，以跟踪肿瘤的消退和复发。MYC过表达小鼠的生存率（有或无p53丢失）作为小鼠的生存期进行测量，并用于评估淋巴显像。为了监测肿瘤的消退和复发，生存率被测量为多西环素治疗（如果肿瘤消退发生在1周内）和复发之间的时间，复发被定义为发病迹象的复发。卡普兰-迈耶曲线的统计比较基于对数秩检验。在移植实验中，原发肿瘤首先适应于在体外如前所述的增长(21)然后是10⁷将细胞在PBS中清洗一次，然后腹腔或皮下注射到FVB/N同基因小鼠。为了评估肿瘤的消退，用卡尺测量30天多西环素治疗期间移植的皮下肿瘤，并使用长度（mm）×宽度公式计算肿瘤体积²（毫米）×0.52(20,43).

细胞培养。

通过机械破坏肿瘤组织，然后Ficoll–Paque纯化单细胞悬浮液，生成肿瘤衍生细胞系。然后维持细胞在体外如前所述(21). 为了使人c-MYC转基因表达失活，用强力霉素（20 ng/ml）处理肿瘤细胞。

逆转录病毒构建、病毒产生和肿瘤细胞感染。

MSCV-IRES-GFP和MSCV-p53-IRES-GFP构造由S.Lowe（纽约州冷泉港冷泉港实验室）提供。路易斯·苏亚雷斯（斯坦福大学）提供了MSCV-LUC-IRES-GFP构建体。MSCV-Puro-LUC构建物是pDON质粒载体（Takara Mirus Bio，Madison，WI）的改良版本，由Mobin Karimi和Robert Negrin（斯坦福大学）提供。通过瞬时转染293T细胞制备含有上清液的逆转录病毒，并按所述测定病毒滴度(44). 将肿瘤细胞与含有逆转录病毒的上清液在32°C的含有4μg/ml聚brene的培养基中孵育12 h。然后将细胞在37°C下再扩增48 h，并在FACS Vantage上通过流式细胞术纯化表达GFP的细胞（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）。用嘌呤霉素筛选含有MSCV-Puro-LUC的细胞。

TSP-1逆转录病毒是通过将8μg PWZL-TSP1质粒DNA或PWZL载体单独（Addgene，Cambridge，MA）和24μl Mirus TransIT Express转染试剂转染GPG-293细胞产生的。在转染后第5、7和9天收集高浓度病毒上清液。病毒通过高速离心浓缩，用于感染2×10⁵第53页⁻2000×克用载体单独或连续三次与TSP-1病毒孵育2 h。

在体内生物发光成像。

p53野生型（p53⁺)，p53阴性（p53⁻)和p53恢复（p53⁻到⁺)将表达荧光素酶的肿瘤细胞经腹腔或皮下注射到同基因小鼠体内。肿瘤被允许发展，直到达到类似的生物发光信号。然后通过强力霉素治疗（100μg/ml）诱导肿瘤消退。通过XGI-8五端口气体麻醉系统将发生移植性肿瘤的小鼠与吸入的异氟醚/氧气进行联合麻醉。基板d日-显像前10min腹腔注射荧光素（150mg/kg）。然后将动物放在一个不透光的房间里，并用IVIS-100冷却CCD相机（加利福尼亚州阿拉米达市Xenogen）拍摄图像。首先，在弱光下拍摄灰度人体表面参考图像（数字照片）。接下来，收集动物体内荧光素酶表达细胞发出并通过组织传输的光子5秒至1分钟，并由软件程序Living Image（Xenogen）量化，作为图像分析程序“Igor”（Wavemetrics，西雅图，华盛顿州）的覆盖物。对于解剖定位，在Living image中生成表示光强度（蓝色，最低强度；红色，最高强度）的假彩色图像，并如前所述叠加在灰度级全身参考图像上(45). Living Image用于收集、存档和分析光子通量，并使用Living Image软件（Xenogen）将其转换为伪彩色图像。每组至少5只小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤。

免疫组织化学。

在肿瘤发生时和MYC灭活后6天对小鼠实施安乐死，收集移植瘤并将其固定在中性缓冲福尔马林中进行石蜡切片。石蜡包埋肿瘤切片在二甲苯、95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇中连续孵育，然后在PBS中进行脱蜡。在室温下用20 ug/ml蛋白酶K在PBS内孵育30分钟，并在PBS和0.3%Triton X-100（PBS-T）中冲洗两次，以揭开表位。切片用大鼠抗CD31单克隆抗体（1:50；Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥）、小鼠抗TSP1抗体（克隆A6.1，1:50；Lab Vision，加利福尼亚州弗里蒙特）或同型匹配对照（Pharminggen）在室温下过夜进行免疫染色。然后用山羊抗大鼠Alexa 594或山羊抗小鼠Alexa 584结合二级抗体（1:500；分子探针）孵育2小时。用Hoechst染料（西格玛，密苏里州圣路易斯；1 ug/ml）进行短暂洗涤，对细胞核进行标记。

对于TUNEL染色，在抗CD31免疫染色后，使用DeadEnd荧光TUNEL系统（Promega）对切片进行染色。简言之，将切片在平衡缓冲液中孵育15分钟，然后与核苷酸混合物（含有荧光素-12-dUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶在37°C下孵育60分钟。通过在2×SSC中孵育15分钟，然后在PBS-T中连续洗涤来停止反应。切片用甘油固定，在蔡司显微镜上获得图像，并使用AxioVision 4.0软件（Carl Zeiss Vision）进行分析。

Western Blot分析。

在Tris·HCl、pH 8/50 mM/NaCl 150 mM/1%Triton X-100/DTT 1 mM/1×抑制剂混合物（加州圣地亚哥Calbiochem）/100μg/ml PMSF中裂解肿瘤片或肿瘤衍生细胞系。采用传统技术对蛋白裂解物（60μg）进行蛋白质印迹。使用从Novocastra Laboratories获得的抗体以1/400的稀释度检测p53蛋白表达。作为p53表达的阳性对照，使用了一种由MEF细胞制备的、过度表达p53的裂解物(46). 使用人类c-MYC（9E10，癌基因，加利福尼亚州圣地亚哥）（稀释1/200）、小鼠c-MYC（c19；圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯）（稀释1/2 50）、小鼠N-MYC（OP13；癌基因）（稀释1/100）和小鼠L-MYC（c 20；圣克鲁兹生物技术）（稀释1:100）抗体评估MYC蛋白水平。作为N-Myc和L-Myc的阳性对照，分别从BJAB细胞（Santa Cruz Biotechnology）和NCI-H209细胞（American Type Culture Collection Biotechnology，Manassas，VA）制备蛋白裂解物。α-微管蛋白抗体购自Oncogene（Ab-1），以1/500的稀释度使用。辣根过氧化物酶（HRP）偶联二级抗体从Amersham Biosciences获得，并以1/2000的稀释度使用。使用ECL1显示蛋白质条带⁺检测试剂盒（Amersham Biosciences，新泽西州皮斯卡塔韦）。通过免疫印迹全细胞裂解物评估TSP-1的表达。细胞在RPMI培养基中单独用强力霉素处理10 h，用PBS洗涤三次，然后用样品缓冲液溶解。电池（1×10⁶)负载在6%Tris·HCl SDS/PAGE凝胶上，进行凝胶电泳，并转移到硝化纤维素膜上。在室温下用TSP-1单克隆抗体（新标记物Ab-11；1/1000）在TBST中孵育细胞膜1小时，然后用山羊抗小鼠HRP（Zymed；1/1000。用ECL检测试剂盒（Amersham）观察蛋白质条带。剥离膜，用抗β-肌动蛋白单克隆抗体（1/5000）重制膜，然后用山羊抗小鼠HRP，并通过ECL检测进行可视化。对薄膜进行密度分析，TSP-1水平归一化为β-肌动蛋白水平。

这部作品是为了纪念乔治·古埃吉先生而创作的。我们感谢Michael Cleary博士、Laura Attardi博士、Steven Artandi博士、Mark Lee博士和D.W.F.实验室成员的有益讨论和对手稿的批判性阅读，感谢Jack Lawler博士的有益建议，感谢Randolph Watnick博士的有益讨论。这项工作得到了淋巴瘤研究基金会（S.G.）博士后奖学金的支持；理查德·史密斯和苏珊·史密斯家庭基金会（致S.R.）；白血病和淋巴瘤学会临床研究职业发展特别研究员奖（授予A.F.）；斯坦福大学医学学者项目（转P.B.）；霍华德·休斯医学院医学生研究奖学金（至A.K.）；Jose Carreras白血病基金会的博士后奖学金（发给E.P.）；乳腺癌研究基金会（J.F.）；和国家癌症研究所（NCI）拨款R01-CA85610、R01-CA105102、3R01CA089305-03S1；美国国立卫生研究院在体内细胞和分子成像中心P50拨款；NIH/NCI拨款1P20 CA112973；白血病和淋巴瘤学会；Burroughs Wellcome基金；和Damon Runyon Lilly临床研究员奖（授予D.W.F.）。