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分子细胞生物学。2006年12月；26(23): 8928–8941.
2006年9月25日在线发布。 数字对象标识：10.1128/MCB.00228-06
预防性维修识别码：项目经理1636815
PMID：17000777

APPL1与TrkA和GIPC1相关，是神经生长因子介导的信号转导所必需的▿

丹·C·林，1 西莉亚·奎韦多，1 娜塔莉·布鲁尔，2 亚历克斯·贝尔，三 约瑟夫·R·特斯塔，4 马克·L·格里姆斯，5 弗雷达·D·米勒，1,6和大卫·R·卡普兰1,6,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

神经营养素受体TrkA通过招募激活神经元生长和存活所需通路的信号分子，在神经系统中发挥关键作用。在这里，我们将APPL1报告为TrkA-相关蛋白。APPL1和TrkA在交感神经元共免疫沉淀。我们已经确定了两种可能发生这种关联的途径。通过质谱法从大鼠脑裂解物中分离出APPL1作为TrkA相互作用蛋白GIPC1的结合伙伴。GIPC1的PDZ结构域直接与APPL1的C端序列结合。这种互动提供了一种方式，通过这种方式，APPL1可以被招募到TrkA。此外，APPL1 PTB域绑定到TrkA，表明APPL1可以独立于GIPC1与TrkA关联。通过高分辨率离心分离内体组分，确定APPL1、GIPC1和磷酸化TrkA在相同组分中富集。APPL1或GIPC1蛋白水平降低可抑制PC12细胞中依赖神经生长因子（NGF）的MEK、细胞外信号调节激酶、Akt活化和突起生长。总之，这些结果表明，GIPC1和APPL1在TrkA功能中发挥作用，并表明携带APPL1、GIPC1和激活的TrkA复合物的内体群体可能传输NGF信号。

TrkA受体酪氨酸激酶对脊椎动物神经系统的发育和功能至关重要。作为原型神经营养素神经生长因子（NGF）的受体，TrkA传播NGF诱导的信号级联，这些信号级联是神经元生存、分化、生长和功能所必需的。在外周神经系统中，NGF和神经营养素家族的其他成员是靶向性的，并以有限的量分泌，以确保适当的神经支配，只支持那些建立了正确连接的神经元的存活(21，22). 特别是，一旦轴突达到目标，NGF就会在轴突末端与TrkA结合。TrkA的后续激活刺激了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇（PI）3-激酶/Akt和磷脂酶C（PLC）-γ途径的活性(19，28). 许多NGF介导的信号以逆行的方式从轴突末端传递到细胞体，最终传递到细胞核，以引发转录反应。那些接收到足够逆行生存和生长信号的神经元存活下来并为其靶细胞提供神经，而那些没有接受逆行生存信号的神经元则被凋亡所消灭。

越来越多的证据表明逆行信号转导的一种方式是在内体中(2，9，15)由TrkA受体通过氯氰菊酯依赖性内化产生(14)和氯氰菊酯非依赖性(30，35)机制。在内体中，NGF、活化的TrkA和TrkA信号通路的成分被发现在一起，并形成一个离散的信号单元，沿着轴突运输到细胞体(4，6，7，10，11，14，18，33，37，40). 因此，TrkA不仅作为质膜上的受体，而且作为细胞内的信号实体发挥作用。通过这种方式，TrkA的信号功能也与其贩运有关。

虽然已经确定了TrkA的一些相互作用伙伴，但相对较少的蛋白质被证明与TrkA信号传递有关。一种TrkA相关蛋白可能实现这一功能，即PDZ结构域蛋白GIPC1。GIPC1通过与受体膜旁区域的直接结合与TrkA和TrkB构成相关。在PC12细胞中过度表达GIPC1可降低NGF诱导的细胞外信号调节激酶1（ERK1）和ERK2活化，这与GIPC1参与TrkA信号传导有关(24). 一些证据表明，GIPC1可能参与内吞和早期贩运事件。GIPC1定位于大鼠肾脏和ARPE-19视网膜色素上皮细胞中的网格蛋白涂层凹坑和外周内胚体(1，23). GIPC1与运动蛋白KIF-1B和肌球蛋白VI的关联表明其在囊泡转运中具有潜在功能(5). 在NGF处理的PC12细胞中，磷酸化TrkA（pTrkA）和GIPC1在内吞结构中共定位(24). GIPC1被假定为一种支架蛋白，因此可以招募其他蛋白到TrkA中，形成对TrkA信号传递和贩运至关重要的多蛋白复合物。

APPL蛋白是一个已被证明连接受体酪氨酸激酶下游信号传导和运输的分子家族。APPL1和APPL2通过HeLa细胞内吞室将受体转运与表皮生长因子（EGF）信号耦合(26). APPL与小分子GTPase Rab5相关，后者是质膜向早期内体转运的关键调节因子(32，41). 在EGF处理和随后的GTP-Rab5水解后，APPL1和APPL2从质膜释放并转移到细胞核，在那里它们与核小体重塑和组蛋白脱乙酰化机制的组成部分相关。APPL1和APPL2介导的内体信号通路将质膜上的信号事件与细胞核中的染色质重塑联系起来，对细胞增殖至关重要。

在本研究中，我们确定APPL1是一种新的TrkA相互作用蛋白。APPL1通过两种不同的方式与TrkA结合：通过PDZ结构域介导的相互作用间接通过GIPC1，直接通过APPL1磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域。细胞分馏研究表明，APPL1、GIPC1和pTrkA存在于相同的内胚体组分中。最后，我们通过确定这两种蛋白都是NGF诱导的MEK、ERK1/2、Akt活化和神经突起生长所必需的，证明了APPL1和GIPC1在TrkA功能中的作用。本研究将APPL1的功能扩展到神经营养素受体信号传导，并与APPL1在NGF下游信号传导内体中的潜在作用一致。

材料和方法

构建物、诱变、融合蛋白和抗体。

Moses Chao善意地提供了Flag-GIPC1 pcDNA3（Invitrogen）模板。对于谷胱甘肽-S公司-转移酶（GST）融合构建物，将大鼠GIPC1的cDNA序列（全长，残基1至333；N末端，残基1-108；N末端加PDZ，残基1-216；PDZ，残留109至216；C末端，残基216至333）克隆到pGEX2载体中（GE Healthcare）。编码APPL1融合蛋白的构建体是通过扩增人APPL1 cDNA的对应于全长（残基1至709）、Bin amphysin Rvs（BAR）结构域（残基1至269）、pleckstring同源性（PH）结构域（残基263至480）、PTB结构域（残基472至655），和PTB结构域加上C末端（残基472到709），并在框架中亚克隆到pFLAG CMV2（其中CMV是巨细胞病毒）、pEYFP（其中EYFPs是增强黄色荧光蛋白）（克隆）、pGEX4T3（GE Healthcare）或pPRO EX HTc（Invitrogen）。编码TrkA融合蛋白的构建物是通过扩增与膜旁区域（残基434到510）、激酶域（残基502到660）和C末端区域（残基660到790）相对应的人类TrkA cDNA片段生成的，并在框架中亚克隆到pPRO EX HTc中。使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）产生GIPC1和APPL1 cDNA的突变。所有融合结构和突变均通过测序确认。GST和His融合结构用于转换大肠杆菌BL21菌株，并使用标准程序纯化重组融合蛋白。

分别制备兔抗全长GIPC1和APPL1 PTB与C末端GST融合的多克隆抗体。使用标准方法每隔6周对兔子进行免疫接种和增强。通过将原始血清应用于GST-Sepharose柱以去除抗GST抗体，然后通过GST-APPL1 PTB和C末端Sepharoze柱进行富集，对APPL1抗体进行亲和纯化。兔子抗TrkA RTA是L.Reichardt（加州大学旧金山分校）赠送的礼物。兔抗pan-Trk抗体已在前面描述过(12). 其他使用的抗体是小鼠抗Flag M2（Sigma）；小鼠抗四氢嘧啶（QIAGEN）；小鼠抗磷酪氨酸（4G10；Upstate Biotechnology）；兔抗磷（Tyr490）TrkA、兔抗p（Ser-217/Ser-221）MEK、兔抗MEK、家兔抗磷酸（Tyr317）Shc、兔抗Akt和兔抗磷酸（Ser-473）Akt（细胞信号）；兔抗磷（Thr-183/Tyr-185）ERK（Promega）；小鼠抗绿色荧光蛋白（抗GFP）（分子探针）；兔抗ShcA（Upstate Biotechnology）；小鼠抗Trk（Zymed）；和兔抗ERK1（Santa Cruz）。

质谱和肽分析。

在pH 7.4的10 mM HEPES中对成年大鼠大脑进行均质化，并添加迷你完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）和1.5 mM钒酸钠。将Triton X-100添加至1%，匀浆在4°C下培养20分钟。通过10000×离心分离可溶性部分克在4°C下保持30分钟。将裂解物与5μg GST-GCP1融合蛋白在4°C下孵育2小时。随后在含有1%Triton X-100的裂解缓冲液中清洗珠子三次。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离GST-GIPC1相关蛋白，考马斯亮蓝染色。如前所述，切除带、还原带、烷基化带和凝胶内胰蛋白酶消化带(第36页). 利用纳米级液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪对所得肽提取物进行分析。使用Mascot软件（集群版本1.9.03）分析结果MS。

细胞培养、初级交感神经元培养、转染和生长因子。

COS7细胞在添加10%胎牛血清、120μg/ml青霉素、200μg/ml硫酸链霉素和600μg/ml谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。稳定过表达TrkA的PC12（克隆6-24）细胞(12)保存在含有10%马血清、5%牛小牛血清、120μg/ml青霉素、200μg/ml硫酸链霉素、600μg/ml谷氨酰胺和200μg/ml Geneticin（Invitrogen）的DMEM中。如前所述，对出生后第1天的Sprague-Dawley大鼠的颈上神经节（SCG）交感神经元进行大规模培养(34). 在无NGF的超培养基（Cambrex）中进行三次1.5小时的洗涤，从交感神经元培养物中提取NGF。对于神经营养素诱导，在细胞溶解之前，将最终浓度为50 ng/ml的NGF添加到培养基中10分钟。对于在Trk抑制剂存在下进行的实验，在NGF处理之前，将200nM K252a（Calbiochem）添加到交感神经元培养物中。使用制造商（Invitrogen）概述的Lipofectamine 2000和Opti-MEM进行瞬时转染。对于SCG培养物的瞬时转染，在电镀时将原代培养物转染到含有120μg/ml青霉素、200μg/ml硫酸链霉素、600μg/ml谷氨酰胺、50 ng/ml神经生长因子、3%大鼠血清（Wisent，Inc.）、0.7%胞嘧啶β-阿拉伯呋喃糖苷（Sigma）和50 mM氯化钾的超培养基中。NGF来自Cedarlane Labs，Ltd。

重组腺病毒与病毒感染。

之前已经描述过编码野生型人类TrkAI的复制缺陷型重组腺病毒，该野生型人类TrkAI在细胞外区域含有Flag标签表位(20). 如前所述，对交感神经元进行病毒感染(25，36). 隔夜用100种病毒感染细胞，并在感染后48小时进行检测。

免疫沉淀和蛋白质印迹分析。

在冰镇磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗细胞两次，并在添加10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮氨酸蛋白酶、1 mM钒酸钠和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的PLC裂解缓冲液中进行裂解(13). 用浓度为1μg/ml的抗体和蛋白a或山羊抗鼠Sepharose在4°C下进行免疫沉淀2 h。GST混合实验是通过在4°C下将裂解液与固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖上的5μg融合蛋白孵育2 h来进行的。为了测量GIPC1与APPL1的直接结合，将1μg细菌产生的纯化的APPL1 His标记片段与5μg与谷胱甘肽-脑葡萄糖结合的纯化重组GST-GIPC1融合蛋白孵育。通过将1μg细菌产生的纯化His标记的TrkA片段与5μg纯化的与谷胱甘肽-Sepharose结合的重组GST-APPL1融合蛋白孵育来检测APPL1与TrkA的直接结合。对于肽混合实验，将1.25 nmol生物素化TrkA或pTrkA肽或1.25 nmolbiotin与15μl高性能链霉亲和素Sepharose（GE Healthcare）在4°C下孵育1 h。将珠子在PLC缓冲液中清洗两次，以去除未结合肽，然后在4°C下与2 mg PC12（6-24）裂解物孵育2 h。生物素-Aca-AAVALLPAVLLALLAPHIENPQYFSD序列的TrkA-Shc-结合位点肽和相关的磷酸肽-生物素-Aca-AAVALPLAVLLALALLAPHIIENPQpYFSD是Jerry Gish赠送的礼物。在免疫沉淀和混合实验中，将珠子在含有10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮氨酸蛋白酶、1 mM钒酸钠和1 mM PMSF的HNTG缓冲液中洗涤三次(13). 蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用适当的抗体进行免疫印迹。通过增强化学发光（GE Healthcare）开发印迹。对于内体组分的Western blot分析，使用带有Fuji LAS-3000系统的冷却电荷耦合器件相机测量发光，并使用Fuji Image Gauge软件量化数据。使用Total Lab 1.0软件（GE Healthcare）对扫描胶片上的其他免疫印迹进行密度分析。强度值被归一化为ERK1和MEK负荷控制的测量值。

内体组分的制备。

PC12细胞（109)在RPMI 1640中的胶原蛋白涂层板上生长，5%胎牛血清和10%马血清在冷冻PBS中收集。细胞在含有1 mM EGTA和1 mM EDTA的PBS中冲洗，然后在含有0.1%葡萄糖和0.1%牛血清白蛋白（PGB）的PBS内冲洗一次。为了确保内化时间的精确控制，细胞在4°C的PGB中用50 ng/ml NGF处理1小时，以允许与受体结合，在PGB中洗涤以去除未结合的配体，以避免流相内吞，并在PGB内加热至37°C 10分钟，然后在冰水中进行温度淬火。在含有1 mM EGTA和1 mM EDTA的PBS中进行洗涤，然后在缓冲液B中进行洗涤（每种K的细胞质离子组成为38 mM+天冬氨酸、谷氨酸和葡萄糖酸盐，20 mM MOPS[吗啉丙基磺酸]，pH 7.1，37°C，10 mM碳酸氢钾，0.5 mM碳酸镁，1 mM EDTA，1 mM-EGTA），细胞重新悬浮在补充有5 mM还原型谷胱甘肽的缓冲液B中，蛋白酶抑制剂（0.1μg/ml抑肽酶、凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑制素A；1μg/ml 1,10-菲咯啉；10μg/ml双苯甲酰胺；和1 mM PMSF）和磷酸酶抑制剂（100 nM萼蛋白A和1 mM钒酸钠）。如前所述，通过Balch均质器的单一通道实现细胞的机械渗透(10，11).

在1000×克.将所得上清液（S1）分层在0至30%的碘克沙醇速度梯度上，并在133000×克持续1.5小时。从速度梯度中收集五个级分，并通过平衡梯度离心进一步解析：将级分与60%碘克沙醇混合至32.5%或更高的浓度，用连续的0至30%碘克沙醇缓冲液B加谷胱甘肽梯度覆盖，并离心至平衡（16至18小时）。从每个平衡梯度中收集了24个组分。为了确定密度，使用阿贝折射仪（Bausch和Lomb）测量折射率，并使用公式ρ=RI×3.4319−3.5851转换为密度，其中RI是折射率。该公式是通过称量缓冲液B中已知浓度的碘xanol来确定的。

siRNA的制备和转染。

靶向大鼠APPL1（5′-CUCCACCUGACUUCGAAACUTT和5′-AGUUCGAAGUCAGUGAGTT）或靶向大鼠GIPC1（5′-AGAGGUGGAAGUAUUCAAGTT和5′-CUGAAUACUCUCUTT）或非特异性序列（5′-UCUGUGUCGAUCGUGUUCUTT和5′-AGAACACCGAUCGACAAGATT）的双重小干扰RNA（siRNA）购自Dharmacon。对于生物化学研究，在12孔组织培养板中以每孔16000个细胞的密度电镀PC12（6-24）细胞，24小时后通过Lipofectamine 2000转染100 nM siRNA寡核苷酸。为了评估NGF诱导的ERK和Akt激活，细胞在DMEM中每隔3小时冲洗两次，以去除转染后42小时的血清。转染48小时后，将50 ng/ml NGF添加到培养基中10分钟，并制备细胞裂解液以进行分析。对于神经突起生长分析，将PC12（6-24）细胞镀在30μg/ml聚乙烯上-我-将密度为每孔16000个细胞的12孔组织培养板中的赖氨酸与1μg pEGFP（其中EGFP是增强的绿色荧光蛋白）（Clontech）和100 nM的siRNA寡核苷酸共同转染。转染24小时后，在含有0.5%马血清的DMEM中用50 ng/ml NGF处理细胞，使神经突起生长。NGF治疗48小时后，使用Retiga Exi数码相机（Q成像）在配备荧光光学元件的蔡司Axiover 200 M倒置显微镜上拍摄图像。对于每种情况，在放大倍率为20倍的条件下，从两个孔中拍摄24张随机场图像。使用Northern Eclipse软件（Empix Imaging）测量GFP阳性细胞的神经突起长度。实验进行了三次。从这三个实验中，APPL1 siRNA/pEGFP共转染细胞的总细胞数为279，GIPC1/pEGFP-共转染的细胞为359，siRNA对照/pEGFP-共同转染细胞为563。使用SAS软件8.02版（SAS Institute，Inc.）进行统计分析。使用广义线性模型程序进行Tukey和Bonferroni试验。如前所述，进行MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-γl]-2,5-二苯基四氮唑）分析(36).

免疫荧光显微镜。

细胞在PBS中短暂冲洗，用4%多聚甲醛在PBS内固定20分钟，用0.1%Triton X-100在PBS里渗透5分钟，并在室温下放置在封闭溶液（5%牛血清白蛋白、5%正常山羊血清和0.01%吐温20在PBS）中1小时。采用单或双标记免疫荧光染色程序检测内源性APPL1、内源性TrkA和外源性Flag-GIPC1。样品在4°C下与1μg/ml浓度的初级抗体在封闭溶液中孵育过夜。使用Alexa 488偶联抗鼠、Alexa 48偶联抗兔、Alexa555偶联抗鼠和Alexa 555偶联抗兔抗体（分子探针）检测一级抗体。细胞核通过浓度为0.5μg/ml的Hoechst试剂染色进行可视化。显微镜使用配备荧光光学的蔡司Axiovert 200 M倒置显微镜进行。在蔡司LSM510 META激光扫描共聚焦显微镜上拍摄共聚焦图像。

结果

通过质谱鉴定GIPC1的结合伙伴。

为了确定GIPC1在神经系统内的潜在相互作用伙伴，将全长GIPC1的GST融合物与成年大鼠脑裂解物孵育。捕获的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过考马斯蓝染色进行可视化。该方法检测到了两条谱带，分别位于130 kDa和90 kDa，它们与GST-GIPC1特异结合，但不单独与GST结合（图。​（图1）。1). 通过液相色谱-四极杆飞行时间辅助激光解吸电离质谱分析切除的蛋白质，确定三种蛋白质为GIPC1的假定结合伙伴。

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将APPL1标识为GIPC1的绑定伙伴。从成年大鼠脑提取物中分离出与全长GIPC1的GST融合沉淀的细胞蛋白。相互作用蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过考马斯亮蓝染色进行检测。代表起始材料（SM）的总细胞蛋白质显示在第一条通道中。将GST单独添加到裂解液中，并在没有裂解液的情况下孵育GST-GIPC1，作为阴性对照。GST-GIP1波段用箭头标记。用GST-GIPC1特异性沉淀的条带（用箭头标记）从凝胶中切除并用胰蛋白酶消化。用质谱法对所得肽进行测序。

在130-kDa带中检测到10个肽，它们与非常规肌球蛋白肌球蛋白VI的序列相匹配(5)，证实了屏幕的功效。突出的条带以90kDa的相对分子量迁移，产生与两种不同蛋白质序列同源的胰蛋白酶肽。用亨廷顿相互作用蛋白1相关肽（HIP1R）对应的序列鉴定了10个肽，检测到16个肽对应APPL1。HIP1R与迄今为止发现的许多GIPC1相互作用蛋白的功能一致，是网格蛋白包被的小孔和小泡的组成部分，支持GIPC1在内吞中的作用(8). APPL1在将EGF在质膜上启动的事件与细胞核染色质重塑联系起来的内胚体信号传递中起着关键作用(26). 含有TrkA的特殊内体被证明可以将NGF介导的存活和分化信号从轴突传递到细胞体。因此，我们选择在TrkA函数的上下文中研究APPL1和GIPC1之间的相互作用。

GIPC1的PDZ域与APPL1的C末端直接相互作用。

为了验证GIPC1和APPL1之间的相互作用，将全长GIPC1的GST融合物与转染表达YFP-APPL1的COS7细胞的裂解物孵育。融合蛋白的回收和结合蛋白与抗GFP抗体的免疫印迹证实GIPC1与APPL1特异性结合，而不是GST对照（图。​（图2B）。2B型). 通过融合到GST的GIPC1蛋白部分来定义GIPC1介导相互作用的区域（图。​（图2A）。2安培). 观察到包含GIPC1的N末端区域和PDZ域以及PDZ域单独的片段与APPL1结合，而未检测到与GIPC1 N末端或C末端区域单独的相互作用（图。​（图2B）。2B型). 这些结果表明GIPC1的PDZ域对于APPL1结合是必要的和充分的。

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GIPC1的PDZ结构域直接与APPL1的C末端结合。（A） GIPC1（左）和APPL1（右）的域架构示意图。显示了GIPC1和APPL1片段和突变体的GST、Flag和His表位标记融合。（B） 全长GIPC1或包含PDZ结构域的GIPC1片段的GST融合可从转染COS7细胞的裂解液中特异性沉淀YFP-APPL1。如图所示，将细胞裂解物与GST融合蛋白孵育，并通过免疫印迹（IB）和抗GFP抗体分析所得复合物。（C） GIPC1的PDZ域对于与APPL1的C-末端区域（C-term）直接关联是必要且充分的。融合到His表位的APPL1纯化片段与GIPC1 N末端（N-末端）、GIPC1 N-末端加PDZ（N-末端+PDZ）或单独GST的纯化、Sepharose固定化GST融合物孵育。用抗-His抗体免疫印迹法检测His-APPL1蛋白。（D） 去除APPL1的C-末端丙氨酸残基（ΔC-项Ala）消除了其与GIPC1的关联。瞬时转染COS7细胞以表达野生型Flag-APPL1或Flag-APPL1ΔC-term Ala。将细胞裂解物与GST融合蛋白孵育，并用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。转染细胞的裂解液显示野生型和截短蛋白的表达水平。（E） GIPC1 PDZ结构域内羧酸结合环的突变消除了其与APPL1的相互作用。用抗Flag抗体从转染COS7细胞中免疫沉淀（IP）Flag-GIPC1和Flag-GIPC1 PDZ突变体。用APPL1抗体检测与Flag-GIPC1相关的内源性APPL1（顶部）。使用抗Flag抗体（底部）测定Flag-GIPC1蛋白的水平。

为了测试相互作用是否直接，并绘制APPL1上的结合位点，我们培养了跨越蛋白质长度的APPL1片段的His-tagged融合（图。​（图2A）2安培)与GIPC1的纯化GST融合。GIPC1的N-末端区域和PDZ结构域的GST融合蛋白与APPL1的C-末端三分之一直接相关（图。​（图2C）。2厘米). 未检测到该GIPC1片段与APPL1的N末端BAR结构域或中央PH结构域结合。这些结果表明GIPC1的PDZ结构域与APPL1的C末端序列之间存在直接相互作用。

为了评估APPL1和GIPC1的这些区域是否是蛋白质相互作用所必需的，我们在APPL1与GIPC1中产生了突变，我们预测这些突变会破坏它们的关联。PDZ结构域通常在其目标蛋白的羧基末端结合4-5个残基的短序列。哺乳动物APPL1蛋白具有一个假定的PDZ结构域结合位点（ESEA-CO2H） ●●●●。删除APPL1的C末端丙氨酸残基有效地消除了其与GIPC1的N末端区域和PDZ结构域的GST融合的结合，证实APPL1正是C末端残基构成了GIPC1 PDZ结构区的结合位点（图。​（图2D）。二维). 在补充实验中，将组成GIPC1 PDZ结构域羧酸结合环的每个残基突变为丙氨酸消除了其与APPL1的关联（图。​（图2E）。第二版). 综上所述，这些观察清楚地表明，GIPC1和APPL1通过GIPC1的PDZ结构域与APPL1的短羧基末端序列之间的典型相互作用直接关联。

APPL1与细胞中的GIPC1相关。

先前有报道称GIPC1与PC12细胞中的TrkA相关(24). 将APPL1确定为GIPC1的交互伙伴，为APPL1和TrkA之间提供了可能的链接。因此，我们有兴趣确定APPL1和GIPC1是否与TrkA功能被广泛描述的细胞相关。PC12细胞和交感神经元是检测TrkA信号对生长和生存的需求的典型模型。由于尚未报道这些细胞类型的APPL1表达，我们评估了出生后第1天大鼠SCG中稳定过度表达TrkA的PC12（6-24）细胞和培养的交感神经元中APPL1的表达。利用针对APPL1的PTB结构域产生的抗体进行免疫印迹，检测到两种细胞类型中的APPL1稳健水平（图。3A和B). 免疫荧光染色法检测交感神经元中APPL1和GIPC1的亚细胞定位。内源性APPL1（图。​（图4A）4A级)和内源性GIPC1（图。​（图4B）4B类)轴突呈点状。在没有一级抗体的情况下，通过染色作为阴性对照来确认模式的特异性（图。​（图4C4摄氏度).

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GIPC1和APPL1在细胞中结合。（A） APPL1、TrkA和pTrkA在PC12（6-24）细胞中与GIPC1共沉淀。内源性GIPC1从用50 ng/ml NGF处理10 min（+）的细胞裂解液或未处理的细胞裂解物中沉淀。沉淀中内源性APPL1、TrkA和pTrkA的存在分别通过抗APPL1抗体、抗TrkA抗体和抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹（IB）检测。免疫前血清免疫沉淀（Pre-Imm IP）作为阴性对照。TrkA、pTrkA，APPL1和GIPC1蛋白用箭头标记。抗GIPC1免疫印迹的上带是免疫球蛋白重链。（B） APPL1与GIPC1在大鼠初级交感神经元中共沉淀。用50 ng/ml NGF处理交感神经元裂解液10分钟，从中沉淀出内源性GIPC1。用所示抗体检测免疫印迹。

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APPL1和GIPC1在交感神经元中具有相似的共分布模式。内源性APPL1（A）和GIPC1（B）在含有NGF的培养基中培养的交感神经元的轴突中显示点状分布。新生大鼠SCG的神经元用APPL1或GIPC1抗体进行免疫染色，如图所示。（C） 作为阴性对照，省略了一级抗体。（D） 瞬时转染表达Flag-GIPC1的交感神经元轴突的反荧光染色（红色）。（E） 通过抗APPL1抗体的免疫荧光染色测定内源性APPL1（绿色）的分布。面板D中显示了相同的字段。箭头标记了Flag-GIPC1和内源性APPL1共分布（D和E）的示例。（F） 面板D和E.Bar的合并图像，10μm。

确认表达后，我们询问内源性APPL1和GIPC1是否在这些细胞中形成复合物。为了评估APPL1和GIPC1是否呈现共分布模式，短暂转染交感神经元以表达Flag-GIPC1。结合针对Flag表位和APPL1的抗体显示，Flag-GIPC1和内源性APPL1在转染细胞的轴突中有点状共定位（图。4D至F). 接下来，我们进行共沉淀实验以确定内源性APPL1和GIPC1是否相互作用。GIPC1共沉淀APPL1在PC12细胞和交感神经元中的免疫沉淀（图。3A和B). 免疫前血清沉淀未产生可检测的APPL1，表明这种相互作用是特异性的。未经处理的PC12细胞和用50 ng/ml NGF处理10分钟的细胞的GIPC1免疫沉淀物中APPL1的水平相当（图。​（图3A）。3A级). 该观察结果表明，APPL1和GIPC1之间的相互作用不受NGF治疗的调节。除APPL1外，TrkA还存在于未经处理和NGF处理的PC12细胞的GIPC1免疫沉淀物中（图。​（图3A）。3A级). 这一结果，之前由Lou等人报道(24)与GIPC1可以充当APPL1和TrkA之间交互桥梁的模型一致。

APPL1的PTB结构域以磷酸酪氨酸非依赖性的方式与TrkA直接相互作用。

除了通过GIPC1在APPL1和TrkA之间建立链接外，APPL1还可以通过APPL1本身的PTB域耦合到TrkA。TrkA下游的关键信号分子，包括Shc和FRS2，通过其PTB结构域被招募到TrkA上的酪氨酸490对接位点，将TrkA连接到Ras途径。最近，利用基于肽阵列上发现的蛋白质组中假定和已知PTB结构域结合位点序列的肽确定了APPL1的PTB结构区的结合谱。利用这种方法，APPL1 PTB结构域被证明与对应于TrkA和TrkC的Shc-结合位点的肽直接相关（M.Smith和T.Pawson，个人通信）。

为了探讨TrkA的Shc结合位点可能与APPL1相关的可能性，将含有与Shc结合部位对应序列的生物素化肽与链霉亲和素Sepharose珠结合，并与PC12（6-24）细胞的裂解物孵育。作为阳性对照，用抗ShcA的抗体对沉淀的复合物进行免疫印迹。ShcA的三种亚型与酪氨酸490处磷酸化的TrkA肽（而非非磷酸化肽）特异相关，表明肽在结合其预测靶点方面的功效（图。​（图5A）。5A级). 用针对APPL1的抗体进行重组，确定内源性APPL1与磷酸化和非磷酸化的TrkA肽相关，但不与仅与生物素结合的链霉亲和素珠相关（图。​（图5A）。5A级). 这一结果表明，APPL1可以以磷酸酪氨酸非依赖性的方式与TrkA的Shc结合位点结合。

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APPL1的PTB结构域以磷酸酪氨酸非依赖性的方式直接与Trk受体结合。（A） APPL1与对应于Shc-结合位点的TrkA肽结合。将含有TrkA序列PHIIENPQpYFSD的生物素化磷酸肽或该肽的非磷酸化版本结合到链亲和素珠上，并与PC12（6-24）细胞的裂解物一起孵育。只与生物素结合的链霉亲和素珠作为阴性对照。用抗APPL1抗体进行免疫印迹（IB）检测内源性APPL1，并用抗ShcA抗体作为阳性对照进行印迹检测。（B） pTrkA与APPL1的PTB域关联。从交感神经元原代培养物中提取NGF，用50 ng/ml NGF处理细胞10分钟（+）或不处理（-）。将裂解物与作为阴性对照的GST-APPL1-PTB或单独的GST一起孵育，或与作为阳性对照的泛Trk抗体一起免疫沉淀（IP）。用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹法检测代表NGF激活型TrkA的内源性pTrkA。（C） APPL1 PTB结构域和TrkA之间的关联是磷酸酪氨酸非依赖性的。按照B组所述进行实验。用抗TrkA抗体检测免疫印迹，以检测TrkA的磷酸化和非磷酸化形式。成熟的糖基化TrkA蛋白标有箭头。TrkA免疫印迹中额外的低带对应于TrkA的未成熟、糖基化形式。（D） APPL1的PTB结构域与TrkA的膜旁区域直接相互作用。含有膜旁区域的TrkA纯化His标记片段与APPL1 BAR、PH和PTB结构域的GST融合或与GST单独孵育。将纯化的His-TrkA膜旁蛋白（50 ng）作为对照。用针对His标签的抗体检测免疫印迹。

接下来，我们试图确定APPL1的PTB结构域是否可以介导其与TrkA的相互作用。将APPL1 PTB结构域的GST融合物与交感神经元的裂解物孵育，交感神经元裂解物用50 ng/ml NGF处理10分钟或清洗以去除NGF。GST融合仅包括APPL1的PTB结构域（残基472-655），不包括C末端PDZ结构域结合位点，因此PTB结构区与TrkA的相互作用可以独立于GIPC1进行评估（图。​（图2A）。2安培). 我们用抗磷酸酪氨酸抗体对合成的复合物进行免疫印迹，以检测内源性pTrkA。pTrkA与APPL1 PTB域的GST融合结合，但不单独与GST结合（图。​（图5B）。5亿). 在本实验中，用抗磷酪氨酸抗体进行免疫印迹，无法检测到未磷酸化的TrkA。因此，还用TrkA抗体对GST下拉实验的印迹进行了探测。该方法表明，GST-APPL1 PTB在经NGF处理的交感神经元和未经处理的细胞的裂解液中与TrkA相互作用（图。​（图5C）。5摄氏度). 与肽混合实验的结果一致，这些数据表明，APPL1 PTB结构域与X11、Numb和Fe65蛋白质中发现的PTB结构区一样，不需要配体磷酸化来结合其目标序列。

为了确定APPL1 PTB结构域和TrkA之间的相互作用是否直接，在结合实验中使用了纯化蛋白。TrkA的近膜、激酶和C末端区域的His标记融合被添加到谷胱甘肽Sepharose珠固定的APPL1 BAR、PH和PTB结构域的GST融合中。在混合实验中，只有APPL1 PTB结构域与含有Shc结合位点的TrkA膜旁区域结合（图。​（图5D）。第五天). 未检测到APPL1 PTB结构域与激酶或TrkA的C末端区域的结合（数据未显示）。总之，这些结果清楚地表明，APPL1的PTB结构域可以以酪氨酸磷酸化和非磷酸化的形式直接与TrkA结合。

内源性APPL1与交感神经元中的TrkA相关。

在确定了APPL1与TrkA偶联的两条可能途径后，我们接下来评估了APPL2和TrkA在交感神经元中是否相关。TrkA是从感染了编码TrkA的腺病毒的神经元的大规模培养物中免疫沉淀出来的，以提高受体的水平。内源性APPL1与来自受感染神经元的TrkA特异性共沉淀（图。​（图6A）。6A级). 这种相互作用似乎与TrkA磷酸化无关，因为用50 ng/ml NGF处理10分钟的交感神经元和洗去NGF的细胞中都观察到了这种相互作用。单独用蛋白A Sepharose沉淀的样品或在没有裂解物的情况下用抗TrkA抗体沉淀的样品中不存在APPL1，证实了这种相互作用的特异性。

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内源性APPL1与TrkA共沉淀。（A） 感染Flag-TrkA腺病毒的交感神经细胞被提取NGF，然后用50 ng/ml NGF治疗10分钟（+NGF）或不治疗（−NGF）。通过使用抗pan-Trk抗体从裂解物中免疫沉淀TrkA（IP）。将单独用蛋白A Sepharose（Prot A）沉淀裂解产物和在没有裂解产物的情况下培养pan-Trk抗体作为阴性对照。用所示抗体检测免疫印迹（IB）。APPL1、pTrkA和TrkA带用箭头标记。TrkA免疫印迹中的附加带对应于TrkA的未成熟、糖基化形式。（B） 内源性APPL1与TrkA的结合不需要TrkA催化活性。按照面板A所述进行实验，但细胞在二甲基亚砜（+）中使用200 nM抑制剂K252a或单独使用二甲基亚磺酸（-）处理。（C） TrkA和APPL1在含有NGF的培养基中培养的大鼠初级交感神经元的轴突中显示部分重叠分布。用抗APPL1（绿色）或TrkA（红色）抗体染色的神经元拍摄共焦图像。最右边的面板显示合并的图像。箭头标记TrkA和APPL1分布之间重叠的示例。棒材，5μm。

为了评估与APPL1的相互作用是否需要TrkA催化活性，进行了类似的实验，但是否存在Trk抑制剂K252a。无论是在二甲基亚砜（DMSO）中用K252a处理细胞还是单独用DMSO处理细胞，都观察到内源性APPL1与TrkA的共沉淀，这表明APPL1相互作用不需要TrkA激酶域的受体自磷酸化（图。​（图6B6亿).

作为检测交感神经元中APPL1与TrkA相关性的另一种方法，对培养的神经元进行免疫荧光染色以检测这些蛋白的分布。联合检测TrkA和APPL1确定了沿着轴突束的部分重叠分布模式（图。​（图6C）。6摄氏度). 联合免疫沉淀和免疫荧光数据表明，APPL1和TrkA可以在交感神经元中结合。

APPL1和GIPC1在内胚体组分中存在磷酸化的TrkA。

据报道，APPL1定位于EGF下游执行信号传递功能的内体(26). 在证明了APPL1和TrkA之间的关联后，我们有兴趣确定这些蛋白质是否也具有共同的内体分布。为了解决这个问题，我们执行了一系列分馏步骤，根据其物理特性以高分辨率分离不同群体的内体。用NGF处理PC12细胞10分钟，这是一个特征明确的时间点，在这个时间点，大多数NGF与内吞细胞器中的TrkA受体共存(10，11). 从渗透细胞中分离出内切体，并首先用速度离心法按其质量进行分离。收集了五个速度梯度组分，并通过平衡浮选梯度对每个组分进行离心，以通过密度分解内吞细胞器。

通过SDS-PAGE和抗pTrkA（抗pY490）、APPL1和GIPC1抗体的免疫印迹分析平衡梯度组分，发现一组pTrkA-阳性内体也含有APPL1与GIPC1（图。7A和B). pTrkA、APPL1和GIPC1在组分12~15中同时存在，所有三种蛋白质在组分13处都有一个峰值，对应于1.12 g/ml的密度。这一结果与共免疫沉淀数据一起强烈表明，用NGF处理PC12细胞后，这些蛋白质与内体相关。有趣的是，APPL1也存在于组分6到9中，峰值为1.21 g/ml。在这些组分中，pTrkA未被检测到。这一观察结果表明，至少还有一个携带APPL1的内体群体不参与TrkA的运输和信号传递。

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pTrkA、APPL1和GIPC1同时存在于内胚体亚组分中。（A） 从NGF处理的PC12细胞中分离出内体部分，然后通过速度离心法根据大小进行分离。收集了五个速度梯度分数，并根据浮选平衡梯度进一步解析每个池。显示了速度梯度分数2的平衡梯度数据。收集平衡梯度级分，使得较高密度的内体包含在编号较低的级分中。蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并用所示抗体进行免疫印迹（IB）检测。（B） 面板A中所示数据的量化和图形表示。每个分数的密度通过折射率测量确定。对pTrk、APPL1和GIPC1条带的化学发光信号强度进行量化，并绘制密度曲线。面板A和B中显示的数据代表了三个单独的实验。

APPL1或GIPC1水平的降低降低了NGF诱导的MEK、ERK和Akt激活。

GIPC1和APPL1与TrkA的相互作用表明这些蛋白在受体功能中发挥作用。为了研究降低APPL1或GIPC1蛋白水平对TrkA信号的功能影响，用靶向APPL1和GIPC1的合成siRNA或随机序列的对照siRNA转染PC12（6-24）细胞。48小时后，用50 ng/ml NGF处理血清饥饿的细胞10分钟。用针对GIPC1或APPL1的siRNAs转染PC12（6-24）细胞，有效且特异性地降低了这些蛋白质的内源性水平（图。​（图8A）。8安). 图中所示斑点的密度分析。​图8A8安表明GIPC1 siRNA处理后，GIPC1蛋白水平大约降低至在无NGF或有NGF的情况下用对照siRNA处理的细胞观察到的水平的8%和15%。经APPL1 siRNA处理后，在无NGF和有NGF的条件下，分别在39%和48%的对照水平上检测到APPL1蛋白。siRNA-介导的APPL1减少不影响GIPC1水平，GIPC1减少也不影响APPL1水平。正如预期的那样，对照siRNA的转染对APPL1或GIPC1水平均无影响。处理细胞中ERK1和ERK2水平未受影响，证实了siRNA的靶向特异性。

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通过RNA干扰降低APPL1和GIPC1蛋白水平可降低ERK和Akt激活，但不影响TrkA酪氨酸磷酸化。（A） 在APPL1或GIPC1 siRNA处理的细胞中，pERK和pAkt减少。用阴性对照siRNA或靶向GIPC1或APPL1的siRNA转染PC12（6-24）细胞。提取NGF后，用50 ng/ml NGF处理细胞10分钟（+NGF）或不处理细胞（−NGF）。用所示抗体通过免疫印迹（IB）分析等量的细胞提取物（总蛋白30μg）。检测ERK1和ERK2水平，作为siRNA治疗特异性的对照。（B） 在APPL1和GIPC1 siRNA处理的细胞中，MEK活化减少，而ShcA磷酸化不受影响。使用针对pMEK、MEK、pShcA（pY317）、ShcA和Akt的抗体对A组所述实验的相同裂解产物进行检测。（C） 无论是TrkA水平还是TrkA总酪氨酸磷酸化水平都不受APPL1和GIPC1蛋白水平降低的影响。TrkA是从面板A和B中显示的相同实验的100μg裂解液中免疫沉淀（IP）的。用TrkA和磷酸酪氨酸抗体检测免疫印迹。

通过测量ERK、MEK和Akt激活水平来分析TrkA受体下游NGF诱导的信号传导。在用GIPC1或APPL1 siRNA处理的细胞中，与用对照siRNA处理的细胞相比，NGF诱导的ERK1和ERK2磷酸化显著减少（图。​（图8A）。8安). 密度分析显示，在APPL1 siRNA处理的细胞中，NGF介导的ERK1和ERK2磷酸化水平分别降低至对照水平的22%和21%。在GIPC1 siRNA处理的细胞中，pERK1和pERK2分别减少到63%和32%。在评估NGF刺激的MEK磷酸化时，观察到类似的减少模式（图。​（图8B）。8B类). APPL1 siRNA处理的细胞中pMEK水平下降至对照siRNA水平的29%，GIPC1 siRNA处理细胞中的pMEK浓度下降至对照siRNA水平的41%。对磷酸化Akt水平的检测确定，转染APPL1 siRNA的PC12（6-24）细胞中NGF诱导的Akt活化也降低到对照siRNA水平的39%，或转染GIPC1 siRNA的细胞中Akt激活降低到对照siRNA水平的61%（图。​（图8A）。8安). 此外，我们检测了ShcA和FRS2的酪氨酸磷酸化，这两个TrkA的近端靶点已知可以调节MEK和MAPK活性。我们没有检测到ShcA酪氨酸磷酸化的减少（图。​（图8B）8B类)这些结果表明，APPL1和GIPC1参与激活MAPK通路以及TrkA和ShcA下游但MEK上游的PI3-激酶/Akt通路。

pERK和pAkt水平降低的一个可能解释是，NGF诱导的TrkA激活可能由于APPL1或GIPC1水平降低而受到影响。为了测试这种可能性，我们从上述相同实验的裂解液中免疫沉淀TrkA，并使用抗磷酪氨酸抗体检测其磷酸化水平。与对ERK和Akt活化的影响相反，TrkA总磷酸化不受内源性APPL1或GIPC1下调的影响（图。​（图8C）。8摄氏度). 这些数据表明，GIPC1和APPL1在NGF诱导的ERK和TrkA激活下游的Akt磷酸化中发挥作用。

APPL1或GIPC1水平降低的细胞中，神经突起生长减少。

确定了在NGF诱导的ERK和Akt激活中对APPL1和GIPC1的需求后，我们接下来研究了这些蛋白是否对NGF信号介导的生物学结果是必要的。我们以PC12细胞为模型，研究GIPC1和APPL1在NGF诱导的突起延伸中的作用，以探讨这种可能性。PC12（6-24）电池镀在聚乙烯上-我-用pEGFP和siRNA寡核苷酸共同转染赖氨酸以帮助其分化。24小时后，细胞在含有50 ng/ml NGF的培养基中分化2天。GFP的表达用于观察转染细胞中的神经突起。优化了pEGFP DNA与siRNA寡核苷酸的比率，以便大多数GFP阳性细胞与siRNA共同转染（数据未显示）。

对神经突长度的检查表明，与对照siRNA处理的细胞相比，当siRNA处理降低APPL1或GIPC1水平时，细胞延长了短突起（图。​（图9A）。9安). 我们通过测量GFP阳性细胞的轴突长度来量化这种影响。与对照siRNA处理细胞的平均长度50.7±7.4μm每细胞相比，用APPL1 siRNA和GIPC1 siRNA处理的细胞的平均轴突长度分别为28.2±6.8μm/细胞和30.8±9.2μm每个细胞（图。​（图9B）。9亿). 因此，与对照处理细胞相比，APPL1或GIPC1水平的降低显著减弱了NGF诱导的神经突起生长(P（P）< 0.02). 这种对生长的影响与观察到的NGF介导的ERK通路激活减少一致。通过免疫荧光显微镜捕获图像后，用抗GIPC1、APPL1和ERK抗体进行免疫印迹分析，检测细胞和蛋白质水平。用各自的siRNA治疗后，APPL1与GIPC1蛋白质水平降低，而ERK水平不受影响，确认这些细胞中内源性APPL1或GIPC1蛋白水平的有效降低（图。​（图9C9摄氏度).

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APPL1或GIPC1水平降低可减少NGF诱导的神经突起生长。（A） 小干扰RNA处理后NGF分化的PC12（6-24）细胞场中的GFP表观荧光。用所示的siRNA和pEGFP共同转染细胞，以便观察神经突起。转染后24小时，用50 ng/ml NGF处理48小时，Bar，10μm，分化细胞。（B） RNA干扰介导的APPL1或GIPC1水平降低对PC12（6-24）细胞突起生长的影响。NGF处理后48小时和转染后72小时测量神经细胞长度。三个独立实验得出的每个细胞的平均神经突起长度(n个=3），以及标准误差。用靶向APPL1或GIPC1的siRNA处理的细胞比用对照siRNA转染的细胞具有显著更短的平均轴突长度(P（P）<0.02，Bonferroni和Tukey对配对设计进行测试）。（C） 在面板A所示的细胞中，APPL1和GIPC1蛋白的水平降低。免疫荧光分析后，对细胞进行裂解，并用所示抗体通过免疫印迹（IB）分析APPL1与GIPC1的水平。ERK水平提供了对均匀加载的控制。

由于我们观察到，由于APPL1或GIPC1蛋白水平的降低，Akt通路的激活减少，因此我们分析了对细胞存活的影响。我们对siRNA处理的NGF分化的PC12（6-24）细胞进行了Hoechst染色。分析显示，3.2%±0.9%的对照siRNA处理细胞、7.6%±1.7%的GIPC1 siRNA处理的细胞和6.2%±0.8%的APPL1 siRNA处理后的细胞显示细胞核浓缩或碎片化，表明细胞凋亡。为了进一步验证siRNA处理的细胞并不是简单地经历广泛的细胞死亡，通过测量线粒体功能的MTT分析来量化存活率。当对照siRNA处理细胞的标准值为100%时，GIPC1 siRNA治疗细胞的MTT读数平均为92.5%±3%(n个=3），APPL1 siRNA处理细胞的读数为91.4%±5.3%(n个= 3). Hoechst染色和MTT分析检测到的细胞凋亡的有限程度表明，降低APPL1或GIPC1蛋白水平对轴突长度的影响不是影响细胞存活的结果，而是由TrkA受体下游ERK通路介导的轴突生长扰动引起的。

讨论

在本报告中，我们已经确定APPL1是神经元中一种新的TrkA-相关蛋白。已知APPL1在内胚体信号传导和Akt调节中发挥作用，也发现其与GIPC1相关，GIPC1是另一种TrkA相互作用蛋白，先前显示其与细胞内小泡中的TrkA聚集。APPL1和TrkA的关联可能通过至少两种机制发生，一种需要GIPC1，另一种通过APPL1 PTB域与TrkA直接绑定。APPL1与GIPC1的结合由APPL1的C末端区域和GIPC1 PDZ结构域介导。APPL1、GIPC1和活化的TrkA在来自PC12细胞的相同高纯度内体膜制备物中共分离。APPL1和GIPC1都是TrkA信号转导所必需的，因为这两种蛋白中任一蛋白水平的降低都会抑制NGF刺激的ERK1/2和Akt活化以及PC12细胞中突起的生长。

APPL1在NGF介导的信号转导中的作用是什么？我们发现，APPL1水平的抑制抑制了NGF介导的Akt和Erk激活，而这两种激活分别是NGF-介导的生存和神经发生所必需的(19). 据报道，APPL1是Akt2的直接结合伙伴，并假设通过将该激酶连接到PI3-激酶来增强Akt的活化(27). 与这一假设一致，APPL1以PI3-激酶依赖的方式增强了Akt介导的雄激素受体反式激活抑制，并且需要丝氨酸残基473上的Akt磷酸化来响应PC-3细胞中的胰岛素样生长因子(38). 我们的观察结果表明，降低APPL1水平会降低NGF介导的Akt磷酸化，这也暗示了APPL1的类似作用。然而，通过抑制APPL1水平降低Akt活性并没有抑制NGF诱导的PC12细胞存活，可能是因为Akt的残留水平足以介导存活。为了支持这一结论，已知交感神经元的生存所需NGF比轴突生长所需的NGF少10倍(三).

我们的实验还揭示了在NGF诱导的MEK和ERK1/2活化中对APPL1的需求，而不是TrkA活化或ShcA磷酸化。在PC12细胞和交感神经元中，活化MAPK通路是NGF介导的神经细胞生成所必需的(19). 与神经生长因子下游MAPK通路的这种作用一致，我们证明抑制APPL1水平也会减弱神经生长因子诱导的神经细胞生成。有趣的是，APPL1先前被证明与Grb2弱相关(27)，一种调节TrkA诱导的MAPK活性的衔接蛋白，为APPL1调节该途径的活性提供了可能的手段。

观察到APPL1与内吞体亚群中的TrkA相关并与TrkA共分馏，这与APPL1可能在NGF下游的内吞体信号传导中发挥作用的模型一致。APPL蛋白以前被认为与EGF诱导的胞内信号通路有关，该信号通路将质膜上的转运事件与细胞核中的染色质重塑联系起来(26). 在EGF处理的HeLa细胞中，通过将EGF吸收到膜上含有APPL和Rab5的内胚体中，并将APPL运输和释放到核室，需要APPL来诱导细胞增殖。虽然到目前为止，我们尚未观察到NGF介导的APPL1易位，但这些蛋白之间的关联可能有助于将NGF-TrkA内体信号复合物与Rab蛋白控制的其他贩运事件耦合。这一假设与Rab GTPases是TrkA贩运和信号传递的重要参与者这一新兴主题相一致。事实上，最近发现Rab7与TrkA联合调节信号内体停留时间(29)在NGF处理的PC12细胞的内胚体部分中发现Rab5与GIPC1、APPL1和pTrkA（M.Grimes，个人通讯）。

我们发现APPL1与GIPC1相关，GIPC1是一种TrkA结合蛋白，先前已被证明是激活NGF诱导的MAPK信号所必需的(24). 我们发现，GIPC1也是NGF诱导的有效轴突生长以及MEK、MAPK和Akt激活所必需的。GIPC1介导这些功能的确切机制尚待阐明。然而，降低GIPC1水平的效果与降低APPL1水平的效果相似。此外，我们还鉴定了GIPC1和APPL1之间的PDZ结构域直接介导的关联，并在相同的内体部分检测到APPL1、GIPC1以及磷酸化的TrkA。基于这些观察结果，我们认为GIPC1可能是连接APPL1和TrkA的桥接蛋白。尽管GIPC1仅包含单个蛋白质-蛋白质相互作用结构域，但已被假设为组织多蛋白复合物的支架分子。有趣的是，GIPC1-PDZ结构域羧酸结合环的突变并没有消除TrkA和GIPC1之间的相互作用，这增加了GIPC1-PDZ结构域的结合囊仍然开放以招募其他蛋白质的可能性(24). 因此，可以想象GIPC1可以同时与TrkA和APPL1结合，因为TrkA相邻膜区的内部序列的结合发生在GIPC1 PDZ结构域内的一个位点，该位点不同于与APPL1的C末端序列相互作用的羧酸结合囊。GIPC1能够组织包含APPL1和TrkA的高阶复合物的另一种机制是通过GIPC1的多重聚合能力，这是一个涉及其N末端结构域的过程(5). 这种蛋白质相互作用的多功能性允许GIPC1通过同时结合不同的蛋白质来桥接不同的途径。例如，GIPC1可以招募GAIP（异源三聚体G蛋白的调节器）到TrkA(24)和D2R多巴胺受体(17). 我们认为GIPC1可能通过桥接APPL1和TrkA之间的联系在TrkA功能中发挥重要作用。

APPL1 PTB域直接绑定TrkA，而不涉及GIPC1。APPL1与TrkA关联的GIPC1-dependent和GIPC1-independent路由的可用性表明，内部化TrkA信号复合体的组成可能是动态的。一种可能性是，GIPC-依赖性关联在TrkA激活后的早期事件中可能很重要，而GIPC1-独立的交互作用在后期事件中发挥作用。一些证据表明，GIPC1参与了受体内化后的内吞和早期贩运事件。在非神经元细胞中，GIPC1定位于膜相关小泡和管状结构以及网格蛋白包被的小孔(23). 我们已经证明在NGF治疗10分钟后，内胚体组分中存在GIPC1、APPL1和活化的TrkA。这一观察结果与PC12细胞和皮层神经元的分馏研究一致，该研究显示GIPC1和Trk在细胞膜组分中的富集情况相似(39). 然而，在TrkA内吞和转运过程中，GIPC1或APPL1可能与TrkA无关。GIPC1与上皮细胞早期内体融合后从囊泡中分离(1)GIPC1与D的非穷尽性共贴2研发三R多巴胺受体(16)建议在以后的排序事件中释放GIPC1。在随后的时间点，通过APPL1 PTB结构域的GIPC1非依赖性结合可能是TrkA和APPL1在神经元细胞中持续结合的机制。

根据我们的观察结果，我们提出了一个模型，其中APPL1和GIPC1与TrkA构成结合。在NGF激活TrkA后，APPL1增强质膜上的Akt激活。GIPC1和APPL1都与激活的TrkA结合在一起，位于以TrkA为靶向信号蛋白（如MAPK）或核膜的内体中。未来的实验将评估在分区培养中破坏初级神经元中APPL1、GIPC和TrkA相互作用的效果，这将使我们能够进一步阐明这些蛋白质在NGF逆行信号传递中的作用。

致谢

我们感谢M.Chao和Jerry Gish分别慷慨提供GIPC1抗体和TrkA肽。我们感谢B.M.Kramer和F.Robinson对手稿的批判性阅读，以及J.F.Lavoie在数据统计分析方面的协助。

这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向D.C.L.提供的博士后奖学金、西班牙教育和科学部向C.Q.提供的博士后奖学金、国家卫生研究院向J.R.T.提供的资助（RO1 CA 77429）、麦吉尔大学约翰·贝杰伦（John Bergeron）的蛋白质组学资助、加拿大基因组研究院（CFI）、CIHR、魁北克基因组，和魁北克省资产评估协会（Valorisation Recherche de Quebec），以及向D.R.K.和F.D.M.F.D.M.和D.R.K.CIHR提供的运营补助金是加拿大研究主席的接收人。

脚注

▿2006年9月25日提前出版。

参考文献

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