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EMBO J。2006年11月15日；25(22): 5317–5328.
2006年10月26日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601404
预防性维修识别码：项目经理1636622
PMID：17066076

SUMO和PIAS蛋白对MBD1介导的转录抑制的调节

Matthew J Lyst公司,1 新生南,1,*和伊琳娜·斯坦切娃1,一
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摘要

在哺乳动物细胞中，DNA甲基化与可遗传和稳定的基因阻遏相关，部分由甲基-CpG-结合域（MBD）蛋白介导，MBD蛋白招募辅阻遏物来修饰染色质。MBD1蛋白是MBD家族的成员，与SETDB1组蛋白甲基化酶形成复合物，通过组蛋白H3的赖氨酸9甲基化沉默靶启动子处的转录。MBD1介导的转录抑制是如何调节的目前尚不清楚。这里我们显示MBD1是PIAS1的sumoylation目标(P（P）蛋白质我抑制剂一个已激活S公司TAT 1）和PIAS3 E3 SUMO(秒购物中心u个类铋瞬间差异）-连接酶，位于MBD1 C末端的两个保守赖氨酸残基。尽管琥珀酰化MBD1与甲基化DNA结合，但它不能与SETDB1结合成复合物，也不能有效抑制HeLa细胞中靶基因p53BP2的转录。我们的数据表明，MBD1的转录沉默受PIAS介导的SUMO1偶联物调节，该偶联物可对抗SETDB1抑制复合物的形成。

关键词：染色质、DNA甲基化、MBD1、PIAS、SUMO

介绍

CpG二核苷酸处胞嘧啶的甲基化是脊椎动物基因组中的主要表观遗传修饰，有助于维持基因组稳定性、调节基因表达和发育过程中的正常进展(Meehan和Stancheva，2001年;伯德，2002). 约70%的CpG二核苷酸在哺乳动物体细胞中甲基化。甲基化的CpG在整个基因组中随机分布，但通常被排除在启动子相关的富含CpG的序列中，这些序列被称为CpG岛(伯德，2002). 在人类癌症中，CpG岛的异常甲基化导致稳定和可遗传的基因沉默，由含有甲基CpG结合域（MBD）的蛋白质家族介导(伯德和沃尔夫，1999年;琼斯和拜林，2002年). MBD系列包括MBD1、MBD2、MBD3、MeCP2和MBD4(亨德里希和伯德，1998年). MBD蛋白的转录抑制作用是通过辅抑制复合物的募集来实现的，辅抑制复合物质将染色质修饰为非活性状态(伯德和沃尔夫，1999年;Prokhortchouk和Hendrich，2002年). 组蛋白脱乙酰化酶和组蛋白甲基化酶（HMT）共抑制物活性已被发现与MBD蛋白稳定或暂时相关(南等, 1998;张等, 1999;福克斯等, 2003;Sarraf和Stancheva，2004年).

MBD1是MBD家族中最大的蛋白质。它包含一个保守的N末端MBD结构域、三个位于中心的CxxC基序和一个C末端转录抑制结构域（TRD）。第三个CxxC基序具有独立于MBD结构域的DNA结合特性，优先识别非甲基化富含CpG的DNA(约根森等, 2004). 已在人类和小鼠细胞中鉴定出MBD1的几种剪接变体，并显示出CxxC基序的数量以及最后一个CxxC模序和TRD之间区域的长度不同(葛田等, 1999;约根森等, 2004). 具有两个CxxC基序（CxxC2和CxxC3）的亚型是HeLa细胞和多种其他人类细胞系中最丰富的MBD1蛋白(十字架等, 1997).

MBD1的转录抑制在很大程度上是组蛋白脱乙酰化诱导依赖性的，并且通过组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）甲基化酶SETDB1和SETDB1辅因子AM/MCAF1向染色质的募集而起作用(Ng公司等2000年;葛田等2003年a;Sarraf和Stancheva，2004年). 还报道了MBD1与另一种H3K9甲基化酶Suv39H1之间的相互作用(葛田等，2003年3月). 几乎所有MBD1结合位点都发现了H3K9甲基化，包括沉默的基因启动子，这表明MBD1/SETDB1复合物通过抑制H3K8甲基化来沉默转录(Sarraf和Stancheva，2004年). 进一步研究表明，迁移复制叉破坏了MBD1与甲基化DNA的相互作用，从而促进MBD1/SETDB1与染色质组装因子CAF-1的主要亚单位p150之间的短暂S相特异性复合物的组装。SETDB1向复制后染色质组装机器的MBD1依赖性招募对于保持H3K9甲基化与DNA甲基化同步以及沉默染色质的稳定表观遗传至关重要(Sarraf和Stancheva，2004年).

我们想知道什么机制可以调节MBD1介导的基因沉默维持。在细胞分化和发育期间，当基因表达模式和染色质状态发生重大变化时，这种调节可能特别重要。MBD蛋白的翻译后修饰可能会改变MBD结构域对甲基化DNA的亲和力，或影响MBD组装成与辅抑制蛋白的复合物。作为第一种可能性的一个例子，已经观察到MeCP2的磷酸化是皮层神经元中钙依赖性膜去极化的结果(陈等, 2003;马丁诺维奇等, 2003). 磷酸化MeCP2在BDNF启动子处与甲基化CpG分离，促进BDNF转录的激活。然而，还没有已知的特定翻译后修饰的例子可以促进或破坏MBD与伙伴蛋白的相互作用。

SUMO对核蛋白的修饰(S公司购物中心U型类铋钼difier）已被证明在转录调控中起作用(约翰逊，2004;海伊，2005). SUMO可以通过酶的方式附着在多种蛋白质上，包括转录因子、组蛋白和染色质相关蛋白(格德伍德等, 2003;Shiio和Eisenman，2003年;海伊，2005). 靶蛋白的氨酰化通常发生在共识位点ΨKxE内的赖氨酸残基上，其中Ψ是一个大的疏水氨基酸（L、I或V），x可以是任何氨基酸。SUMO与靶底物的结合在机理上与泛素化类似，但使用SUMO特异的酶机制，包括由异二聚体Aos1/Uba2形成的E1-SUMO活化酶、E2-SUMO结合酶Ubc9和E3连接酶，如RanBP2和PIAS(P（P）蛋白质我抑制剂一个已激活S公司TAT）家族蛋白。E3酶将SUMO从Ubc9转移到特定蛋白质底物(施维恩霍斯特等2000年;约翰逊，2004年;海伊，2005). 与泛素化不同，目标蛋白的sumoylation不促进蛋白质降解，在许多情况下稳定修饰的蛋白质(德斯特罗等, 1998;乌尔里奇，2005). 然而，SUMO结合的效果是多样的，并且在很大程度上取决于用于sumoylation的蛋白质的功能。与其他翻译后蛋白质修饰一样，琥珀酰化可以促进或抑制特定蛋白质复合物的形成，影响蛋白质的亚核定位，并积极和/或消极调节转录(萨契戴夫等, 2001;格德伍德等, 2003;约翰逊，2004年;长等, 2004;Pastushok和Xiao，2004年;戈梅兹·德尔·阿科等, 2005;海伊，2005).

在本报告中，我们证明了在人类细胞中，MBD1蛋白在MBD1 C末端赖氨酸K450和K489周围的两个保守位点被SUMO1修饰。我们确定PIAS1和PIAS3是E3 SUMO连接酶，它们直接与MBD1相互作用，是MBD1的sumoylation所必需的体内Sumoylated MBD1不能与SETDB1有效结合，导致MBD1靶基因p53BP2的去表达。我们的数据表明，MBD1/SETDB1抑制复合物的组装受SETDB1和SUMO结合机制之间的竞争控制，以结合MBD1。这种竞争的结果取决于SETDB1和PIAS1/3 SUMO连接酶的蛋白水平，并为MBD1介导的基因沉默的灵活调节提供了潜在的机制。

结果

MBD1由SUMO1修改

我们之前使用人类MBD1作为HeLa cDNA文库的诱饵进行了酵母双杂交筛选，以鉴定MBD1相互作用蛋白(Sarraf和Stancheva，2004年). 从该筛选中，我们分离并鉴定了两个MBD1结合伙伴——SETDB1 HMT和染色质组装因子CAF-1的p150亚单位。从同一个筛选中，我们还回收了9个含有编码E3 SUMO连接酶PIAS1和PIAS3的cDNA的质粒。MBD1与PIAS蛋白的假定相互作用促使我们研究MBD1蛋白是否在人类细胞中被SUMO修饰。SUMO与靶蛋白的结合产生了分支蛋白质分子，与丙烯酰胺凝胶中未修饰的蛋白质相比，其分子量更大。调查MBD1是否被磺化体内，我们制备了核提取物，无论是否使用SUMO异肽酶抑制剂N个-乙基马来酰亚胺（NEM），来自HeLa、MRC5原代人肺成纤维细胞和NCI-H226肺癌细胞。抗MBD1抗体的Western blot在所有核提取物中检测到70 kDa MBD1主带(图1A). 仅在用NEM制备的提取物中可以看到额外的～130 kDa条带，这表明它可能代表SUMO修饰的MBD1形式。第三条带的迁移速度略慢于主要的70kDa MBD1蛋白，也可以在所有提取物中看到，无论是否用NEM制备(图1A、B和G). 该条带可能代表MBD1的磷酸化形式。值得注意的是，根据进一步的实验（未显示），通过Western blots检测到的琥珀酰化MBD1的数量很低，估计仅占MBD1总蛋白的10%左右。

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MBD1蛋白的氨酰化体内. (一个)抗MBD1抗体在用SUMO异肽酶抑制剂NEM制备的核提取物中检测到额外的130kDa带。(B类)抗MBD1抗体识别SUMO1中的130 kDa带，但不识别SUMO2/3 IP。(C、 D类)MBD1 IP中的130kDa带被抗SUMO1抗体识别，但不被抗SUMO2/3抗体识别。(E类)SUMO1 siRNA可有效降低HeLa核提取物中SUMO1修饰蛋白的阶梯。箭头表示主要的SUMO1修饰蛋白RanGAP1。(F类)针对SUMO2/3的siRNA导致HeLa核提取物中SUMO2/3-修饰蛋白的大量损失。(克)SUMO1而非SUMO2/3 siRNA可降低sumoylation MBD1。

为了研究抗MBD1抗体识别的130kDa蛋白是否代表sumoylated MBD1，我们使用HeLa核提取物中的抗MBD1、抗SUMO1和抗SUMO2/3抗体进行免疫沉淀（IP）。当使用抗MBD1抗体在Western blot上检测免疫沉淀蛋白时，70kDa和130kDa蛋白都可以在抗MBD1-IP中看到，而抗SUMO1抗体仅免疫沉淀130kDa-MBD1(图1B). 在反向实验中，Western blots上的抗SUMO1抗体也仅检测到抗MBD1 IP的130 kDa带，表明该蛋白确实代表SUMO1修饰的MBD1(图1C). MBD1在抗SUMO2/3抗体免疫沉淀的蛋白质中均未检测到，MBD1 IP中的130kDa带也未被抗SUMO2/3抗体识别(图1B和D). 从这些实验中，我们得出结论，MBD1在HeLa细胞中是SUMO1修饰的。

此外，我们使用小干扰RNA同时耗尽HeLa细胞中的SUMO1、SUMO2和SUMO3或所有SUMO蛋白(图1E和F). 仅当细胞接受抗SUMO1 siRNA时，130kDa MBD1带才显著减少，进一步证实了我们的结论，即在HeLa中MBD1被SUMO1修饰，而不是被SUMO2或SUMO3修饰(图1G).

MBD1有两个功能性sumoylation位点

接下来，我们检测了人MBD1蛋白的氨基酸序列，并在MBD1的C末端发现了围绕赖氨酸450（K450）和489（K489）的两个潜在的sumoylation位点，即VKQE(图2A). 不同哺乳动物MBD1蛋白的比对显示，这两个潜在的sumoylation位点高度保守(图2B). 有趣的是，尽管热带非洲爪蟾MBD1与人MBD1蛋白不同源，它还包含围绕赖氨酸446和471的两个潜在SUMO靶点（IKEE和VKTE）(补充图S1). 所有脊椎动物MBD1蛋白中SUMO结合位点的保存与MBD1的sumoylation可能具有重要功能的观点一致。

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Sumoylation位点对MBD1的本地化并不重要。(一个)人类MBD1及其已知域和结合伙伴。围绕赖氨酸450和489的VKQE序列是两个假定的sumoylation位点。(B类)人类MBD1（仅显示氨基酸403–513）与其他哺乳动物MBD1蛋白的比对证明了sumoyalization位点的保守性。(C类)野生型和突变型mRFP标记的MBD1蛋白与HeLa中的Flag-SUMO1共表达，并用抗RFP抗体检测。双突变2（K-A）和2（E-A）完全消除了MBD1的sumoylation。(D类)抗-SUMO1抗体仅检测用抗RFP抗体免疫沉淀的慢迁移野生型和突变RFP-MBD1蛋白。(E类–克)HeLa与表达GFP-wtMBD1（E）和RFP-MBD1的质粒共转染K450安（F） 显示两种蛋白质的相同定位（G）。(H（H）–J型)表达GFP-wtMBD1（H）和RFP-MBD1的质粒联合转染HeLa细胞2（K–A）（一） ●●●●。野生型和突变型MBD1蛋白显示相同的定位（J）。

为了研究人类MBD1的VKQE序列是否对SUMO1的接合至关重要，我们将K450和K489或E452和E491突变为丙氨酸，并与HeLa细胞中的Flag-SUMO1共表达单体RFP标记的野生型和突变蛋白。用抗RFP抗体在Western blot上分析外源表达的MBD1蛋白(图2C). 随后，我们免疫沉淀了野生型和突变型RFP-MBD1蛋白，并用抗SUMO1抗体在Western blot上证实了sumoylated形式的一致性(图2D). 正如预测的那样，一些130 kDa RFP-MBD1被酰化，产生两个缓慢迁移的条带，分别为～190和～140 kDa，而单个突变（K450A、K489A、E452A和K491A）只产生了一个附加的～140 kDa条带(图2C和D). 因此，我们得出的结论是，190 kDa蛋白在两个赖氨酸残基处均被MBD1酰化，而140 kDa蛋白质是MBD1的单酰化形式。我们无法检测到与MBD1结合的SUMO1携带双K到A或E到A点突变（RFP-MBD12（K–A）和RFP-MBD12（E–A）;图2C和D). 在GST-MBD1（野生型和突变体）同时表达于大肠杆菌使用SUMO共轭机械(补充图S2). 总之，这些实验表明，VKQE序列是MBD1中唯一的功能性sumoylation位点。此外，SUMO1产生的位移修改了RFP-MBD1和GST-MBD1大肠杆菌与在人类细胞中观察到的sumoylated MBD1的～60 kDa位移相当。这表明内源性MBD1通常在两个赖氨酸残基处被SUMO1修饰。

SUMO结合位点对MBD1定位到核病灶并不重要

据报道，SUMO修饰的转录因子被招募到早幼粒细胞白血病蛋白体和核基质附着区(钟等2000年;萨契戴夫等, 2001). 因此，我们询问MBD1的sumoylation，尽管在Western blots上似乎很低，但是否对某些特定核隔室的MBD1招募很重要。在人类细胞中，内源性MBD1以及转染质粒表达的GFP标记的MBD1在扩散核染色的背景下积聚在6-7个核病灶中(图2E和H). 当我们在HeLa细胞中共表达GFP标记的MBD1和RFP标记的单（K450A，K489A）或双（2（K–A））MBD1赖氨酸突变体时，野生型和突变型MBD1蛋白显示相同的核定位(图2E-G和H-J). 因此，sumoylation似乎不太可能促进MBD1蛋白向特定核结构域的募集。

PIAS1和PIAS3与MBD1的中央部分相互作用

PIAS1和PIAS3蛋白具有约65%的同源性，包含一个SAR/Acinus/PIAS（SAP）推定的DNA结合结构域、一个核定位信号、一个被称为SP-RING的催化结构域和一个SUMO相互作用基序（SIM）(图3A). 为了更详细地描述MBD1和PIAS蛋白之间的相互作用，我们生成了一系列PIAS1和PIAS3缺失结构，并在酵母双杂交试验中测试了它们与全长MBD1的结合(补充图S3和S4). GST-MBD1下拉试验独立证实了这些相互作用在体外翻译的HA-标记全长和截断的PIAS1(补充图S3). 从这些实验中，我们发现PIAS1的C-末端（氨基酸510-651）和PIAS3的C-终端（氨基酸500-619）是与MBD1结合所必需的在体外和体内.

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PIAS1和PIAS3与第二CxxC基序和MBD1的相邻区域结合。(一个)人类PIAS1蛋白及其已知结构域的示意图。指出了PIAS1和PIAS3之间的保守区域（>80%同源性）。(B类)在酵母双杂交分析中，MBD1缺失结构用于识别MBD1结合PIAS1和PIAS3的区域。通过-Leu/-Trp/-His/-Ade（QDO）培养基上的生长对相互作用进行评分。(C类–D类)GST-MBD1缺失蛋白用于下拉在体外翻译的HA标记的PIAS1和PIAS3蛋白。

为了进一步研究PIAS1和PIAS3是否与MBD1的特定区域结合，我们用全长PIAS1和PIAS3蛋白在酵母双杂交分析中测试了各种MBD1缺失构建体(图3B). 如上所述，这些相互作用通过GST标记的截短MBD1蛋白和在体外翻译的HA-tagged PIAS1和PIAS3(图3C和D). 在所有MBD1缺失结构中，含有第二CxxC基序和MBD1邻近区域（氨基酸221-480）的蛋白质足以结合PIAS1和PIAS3在体外和体内(图3B–D). 值得注意的是，PIAS1和PIAS3结合与MBD1在K450的第一个sumoylation位点重叠，并且与K489的第二个sumo酰化位点非常接近。这提示MBD1可能是PIAS1和PIAS3结合SUMO1的直接靶点。

MBD1的聚合需要PIAS1和PIAS3体内

由于PIAS蛋白与MBD1相互作用，我们询问PIAS1和PIAS3是否负责MBD1的sumoylation体内我们用针对PIAS1、PIAS3或PIAS1和PIAS3的siRNA库转染HeLa细胞，并在Western印迹上分析PIAS蛋白的水平和MBD1的sumoyalization(图4A-C). 针对萤火虫荧光素酶的GL2 siRNA被用作非特异性效应的对照。与对照组相比，PIAS1和PIAS3 siRNAs有效降低了各自PIAS蛋白的蛋白质水平(图4A). 在这两种情况下，PIAS蛋白的丢失伴随着SUMO1修饰的MBD1的减少(图4B). 然而，只有当我们同时耗尽PIAS1和PIAS3时，MBD1-SUMO1才能在蛋白质印迹上检测到(图4B). 这意味着这两种PIAS蛋白都有助于SUMO1与MBD1的结合。

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MBD1的聚合需要PIAS1和PIAS3体内. (一个)HeLa中PIAS1、PIAS3和两种PIAS蛋白的siRNA缺失。GL2是一种针对萤火虫荧光素酶的控制小干扰RNA。(B类)在PIAS缺失细胞的提取物中检测到MBD1和MBD1-SUMO1（如A）。只有当PIAS1和PIAS3都耗尽时，MBD1-SUMO1才完全丢失。(C类)PCNA被用作（a）和（B）所示实验的加载控制。(D类)用表达所示蛋白的质粒转染HeLa细胞。PIAS1、GFP-PIAS1和GFP-PIAS 3（野生型和催化突变体PIAS1C350S型和PIAS3碳钢/高碳钢)用抗PIAS1和抗GFP抗体检测。(E类)用抗MBD1抗体探测（D）中相同提取物的Western blot表明，MBD1-SUMO1在转染GFP-PIAS1和GFP-PIAS 3的细胞中积累，但在转染催化失活PIAS蛋白的细胞中没有积累。(F类)MBD1从与（D）和（E）相同的提取物中免疫沉淀，MBD1-SUMO1用抗标记抗体检测。

为了进一步研究PIAS1和PIAS3水平的增加是否会刺激MBD1的sumoylation，我们用表达Flag-taged SUMO1的质粒转染HeLa，或用标记野生型PIAS1、PIAS3或催化非活性PIAS1的Flag-SUMO1和GFP共同转染HeLaC350S型和PIAS3碳钢/高碳钢(长等, 2004;穆纳里兹等, 2004) (图4D). 转染后2天收集细胞，并检测核提取物中PIAS1、PIAS3蛋白和SUMO修饰的MBD1的水平。用抗PIAS1抗体进行的Western blot检测到内源性和GFP标记的PIAS1，表明瞬时转染细胞中的总PIAS1水平大约是对照细胞的两倍(图4D，顶部面板）。抗GFP抗体可检测到GFP-PIAS1和GFP-PIAS 3(图4D，底部面板）。与我们的结合分析和siRNA实验一致，我们观察到与GFP-PIAS1和Flag-SUMO1或GFP-PIASP3和Flag_SUMO1联合转染的细胞核提取物中SUMO修饰的MBD1显著增加(图4E和F). 我们没有检测到MBD1-SUMO1在用催化失活PIAS蛋白转染的细胞中的积聚(图4E和F). PIAS1和PIAS3对MBD1的sumoylation似乎是特异性的，因为GFP-PIASy、另一个PIAS家族蛋白或Flag-SUMO1单独转染不会诱导MBD1-SUMO的积累(补充图S5). 我们还注意到，转染GFP-PIAS1或GFP-PIAS3而不转染标志SUMO1足以刺激MBD1的sumoylation(图5A和B和补充图S5). 这表明PIAS蛋白的内源性浓度而不是SUMO1本身限制了内源性MBD1的SUM酰化。这也意味着PIAS1和PIAS3SUMO连接酶在功能上是等价的，可以独立靶向MBD1。原则上，PIAS1和PIAS3既可以直接对MBD1进行酰化，也可以通过一些间接机制刺激MBD1的酰化。由于PIAS蛋白与MBD1相互作用在体外和体内（见下文），MBD1的sumoylation需要它们的催化活性，这些数据共同表明MBD1是PIAS1和PIAS3结合SUMO的直接靶点。

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MBD1-SUMO1与CAF-1交互，但不与SETDB1交互。(一个)MBD1而非MBD1-SUMO1与表达GFP-PIAS1和GFP-PIAS 3的细胞核提取物中的SETDB1共同免疫沉淀。(B类)MBD1和MBD1-SUMO与CAF-1共同免疫沉淀，来自与（A）中相同的提取物。(C类)转染SETDB1 siRNA但未转染对照GL2 siRNA的HeLa细胞显示SETDB1水平降低并积累MBD1-SUMO1。PIAS1和PIAS3水平不受SETDB1 siRNA处理的影响。控制蛋白RanGAP-SUMO1不受SETDB1缺失的影响。(D类)测试来自用指示的siRNA和PIAS蛋白转染的细胞的MBD1-IP掺入三H标记的甲基转化为重组组蛋白H3 N-末端肽（H3N）。干燥的12%考马斯染色凝胶的放射自显影（顶面板）（底面板）。顶部面板下的数字为三相对于未转染细胞MBD1 IP的H标记甲基。

氨酰化抑制MBD1和SETDB1之间复合物的形成

靶蛋白的氨酰化可以通过促进或破坏蛋白质-蛋白质相互作用来影响特定蛋白质复合物的组装(约翰逊，2004). 我们的证据表明，SUMO1通常与人类细胞中MBD1的K450和K489结合，这导致我们研究了sumoylated MBD1是否能够与其伙伴蛋白SETDB1和CAF-1相互作用。我们之前已经证明，在HeLa细胞中，MBD1在整个细胞周期中与SETDB1形成稳定的复合物，并在S期与染色质组装因子CAF-1特异性结合(Sarraf和Stancheva，2004年). MBD1与SETDB1相互作用的区域（氨基酸221-480）包含MBD1在K450的第一个sumoylation位点。值得注意的是，MBD1的SETDB1结合区域也与PIAS1/PIAS3结合所需的氨基酸重叠(图2A和​和3B）。第3页). MBD1的TRD（氨基酸480–546）包括位于K489的第二个sumoylation位点，已知其招募SETDB1辅因子AM/MCAF1(葛田等，2003年a). 因此，有理由推测MBD1的sumoylation可能影响SETDB1和/或AM结合。另一方面，CAF-1与MBD1的N末端结合，MBD1远离sumoylated赖氨酸，可能不受SUMO与MBD1-结合的影响(图2A).

为了确定sumoylated MBD1是否与SETDB1和CAF-1相互作用，我们用GFP-PIAS1、GFP-PIASP3转染HeLa，或用GFP-PAAS1和Flag-SUMO1共同转染HeLa，以实现MBD1-SUMO1.的积累。在含有抗MBD1抗体的转染细胞中，很容易检测到未修饰的MBD1和磺酰化MBD1(图5A和B，IP上清液）。我们同步了S期细胞，制备了核提取物和免疫沉淀的SETDB1和CAF-1(图5A和B，IP颗粒）。在SETDB1 IPs中，通过抗MBD1抗体检测到，非肿瘤化的MBD1很容易与SETDB1共同免疫沉淀(图5A，IP颗粒）。相比之下，无论是通过抗MBD1还是通过抗Flag抗体，在SETDB1 IP中都无法检测到MBD1-SUMO，并且始终保留在上清液中(图5A，IP上清液）。CAF-1抗体免疫沉淀MBD1和MBD1-SUMO(图5B，IP颗粒）。证实了我们之前的发现，S期提取物中只有大约30%或更少的MBD1蛋白与CAF-1共同免疫沉淀。因此，在带有CAF-1抗体的IP后，上清液中保留了大量未经修饰和磺酰化的MBD1(图5B，IP上清液）。从这些实验中可以清楚地看出，MBD1-SUMO1不能有效地与SETDB1相互作用，但仍能在S阶段与CAF-1结合。

SETDB1下调导致MBD1-SUMO积聚

在早期的研究中，我们发现大多数MBD1与来自HeLa核提取物的SETDB1共同免疫沉淀(Sarraf和Stancheva，2004年). 由于PIAS蛋白和SETDB1共享MBD1的相同结合区，我们假设MBD1和SETDB1之间复合物的形成可能保护MBD1免受内源性PIAS1或PIAS3与SUMO1的结合。为了测试这一点，我们使用siRNA降低HeLa中的SETDB1蛋白水平，并询问MBD1-SUMO1是否在这些细胞中积累。GL2 siRNA作为对照。用抗SETDB1抗体进行的Western blot显示，与对照组相比，2和4μg SETDB1 siRNA（而不是等量的GL2 siRNA）分别将SETDB1蛋白减少到约40%和10%(图5C). 在相同的提取物中，带有抗MBD1抗体的Western blot检测到在用SETDB1 siRNA处理的细胞中MBD1-SUMO1的剂量依赖性积累，而不使用GL2 siRNA(图5C). SETDB1和GL2 siRNA均未导致PIAS1或PIAS3蛋白水平的上调，也未对SUMO1修饰蛋白产生一般影响，因为RanGAP1的sumoylation保持不变(图5C). 与用SETDB1 siRNA处理的细胞中MBD1-SUMO1的积累一致，当SETDB1水平降低时，MBD1与PIAS蛋白共同免疫沉淀的效率更高(补充图S6). 总之，这些实验表明，当SETDB1蛋白存在于HeLa细胞中时，它与PIAS1和PIAS3竞争，以结合MBD1，从而保护MBD1免受SUMO修饰机器的靶向作用。鉴于HeLa中大多数MBD1与SETDB1复合，这可能解释为什么这些细胞中只有一小部分MBD1被酰化(图1A).

SUMO1抑制SETDB1与MBD1结合应导致MBD1相关HMT活性的可检测下降，与在SETDB1缺失细胞中观察到的结果相当(Sarraf和Stancheva，2004年). 为了验证这一点，我们从转染GFP-PIAS1、GFP-PIASP3、GFP-PAAS3的细胞制备的核提取物中免疫沉淀MBD1立方米/公顷或来自用SETDB1和GL2 siRNA处理的细胞。这些IP进一步用于在体外利用重组组蛋白H3 N末端尾部作为基质掺入三氢标记甲基(图5D). 与我们之前的结果一致，与对照组相比，转染GFP-PIAS1或GFP-PIAS 3的细胞或经SETDB1 siRNA处理的细胞的MBD1 IP显示组蛋白甲基化活性显著降低(图5D). 这反过来又促使我们研究MBD1-SUMO1水平升高的细胞中MBD1的转录抑制是否受到损害。

Sumoylation拮抗MBD1介导的转录抑制

我们之前已经证明，MBD1/SETDB1复合组蛋白H3的K9处的甲基化染色质可以沉默HeLa中MBD1靶基因p53BP2的转录(Sarraf和Stancheva，2004年). MBD1的有效转录抑制需要与SETDB1蛋白相互作用，因为p53BP2在用SETDB1 siRNA处理的细胞中异常表达(Sarraf和Stancheva，2004年). 考虑到MBD1-SUMO1与SETDB1没有相互作用，我们询问在过度表达PIAS1的细胞中MBD1-SSUMO1的积累是否会导致p53BP2沉默的丢失，从而反映SETDB1 siRNA的作用。因此，我们比较了联合转染SETDB1 siRNA的细胞与联合转染GFP-PIAS1和Flag-SUMO1的细胞中p53BP2的表达(图6B，第53BP2页）。作为对照，我们将无催化活性的GFP-PIAS1与细胞共转染C350S型和标志-SUMO1。在所有实验中，我们使用组成性表达的乙醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为非特异性效应的对照(图6BGAPDH）。与我们之前的观察一致，在用SETDB1 siRNA处理的细胞中检测到p53BP2的表达。PIAS1/3 siRNA和SUMO1/2/3 siRNA均未导致p53BP2.的异常表达。相反，使用PIAS1和Flag-SUMO1转染，但不使用PIASl转染C350S型Flag-SUMO1将p53BP2转录上调至与SETDB1 siRNA处理的细胞相当的水平(图6B). 因此，PIAS1对MBD1的酰化不仅抑制SETDB1结合，而且破坏通常由MBD1/SETDB1复合物介导的p53BP2基因的转录抑制。

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MBD1-SUMO不能有效抑制p53BP2转录。(一个)p53BP2启动子示意图。指出了PCR在ChIP（C）和RT-PCR（B）实验中扩增的区域。CpG显示为竖线。(B类)半定量RT-PCR检测转染SETDB1 siRNA或GFP-PIAS1和Flag-SUMO1（P1/F-S1）的细胞中p53BP2的转录，但不检测转染突变GFP-PIASP1和Flage-SUMO2（C350S/F-S1）的细胞。非肿瘤性MBD12千安（2KA）拯救GFP-PIAS1/Flag-SUMO1转染细胞中p53BP2的抑制。无论是wtMBD1蛋白还是具有单个赖氨酸突变（K450A和K489A）的MBD1都不能有效地挽救p53BP2的阻遏。GAPDH是一种广泛表达的控制基因。RT-PCR通道上方的三角形表示PCR反应中使用的cDNA数量增加了两倍。M是分子量DNA标记。(C类)染色质IP检测与p53BP2启动子结合的MBD1和MBD1-SUMO1。在过度表达GFP-PIAS1（P1）、GFP-PIAS 1和Flag-SUMO1（P1/F-S1）的细胞中，SETDB1和H3K9的甲基化在p53BP2启动子处降低，但在过度表达突变GFP-PIASP1和Flage-SUMOl（PC350S/F-S1）的细胞内没有降低。

我们进一步假设，一种含有两种sumoylatable赖氨酸的MBD1突变为丙氨酸（MBD12（K–A）)不应成为SUMO结合机制的靶点，并可能拯救PIAS1过度表达细胞中p53BP2的抑制。我们用GFP-PIAS1、Flag-SUMO1和RFP-MBD1联合转染细胞2（K–A）或RFP-MBD1，并对其p53BP2表达进行分析。同时，我们研究了MBD1（MBD1）的单个赖氨酸突变体k450安培和MBD1K489A型)确定单个sumoylation位点对SUMO调控MBD1介导的抑制的贡献。所有RFP-MBD1蛋白在转染细胞中的表达相似(补充图S7). 然而，只有不可杀菌的MBD12（K–A）但RFP-MBD1不能成功挽救PIAS1过度表达细胞中p53BP2的抑制(图6B). MBD1型K450安和MBD1K489A型效率不如MBD12（K–A）在沉默p53BP2中(图6B). 总的来说，这些实验表明，SUMO与MBD1的两种Sumoylate赖氨酸中的任何一种结合都会导致MBD1介导的p53BP2阻遏被破坏。

SETDB1介导的p53BP2启动子H3K9甲基化在PIAS1过度表达细胞中丢失

将MBD1/SETDB1复合物招募到HeLa细胞的p53BP2启动子中，建立组蛋白H3的K9处三甲基化的转录抑制染色质(Sarraf和Stancheva，2004年). 鉴于PIAS1对MBD1的sumoylation抑制了SETDB1与MBD1之间的结合，并诱导了p53BP2转录，我们检测了这是否伴随着p53BP1启动子MBD1、SETDB1和H3K9甲基化的缺失。在非转染细胞、转染GFP-PIAS1、GFP-PIAS 1和Flag-SUMO1的细胞以及转染PIAS1的对照细胞中，用抗MBD1抗体的染色质免疫沉淀（ChIP）检测到与p53BP2启动子结合的MBD1的量大致相等C350S型和标志-SUMO1(图6C，α-MBD1）。因此，在过度表达PIAS1的细胞中积累MBD1-SUMO1并不影响MBD1与p53BP2启动子的结合。在PIAS1和PIAS1/SUMO1转染的细胞中，用抗SUMO1和抗Flag抗体连续下拉MBD1富集的染色质（用MBD1抗体免疫沉淀），检测到SUMO1修饰的MBD1与p53BP2序列结合，但在对照细胞中未检测到(图6C，α-SUMO1，α-标志）。这表明MBD1-SUMO与甲基化DNA的结合没有受损，并且定位于内源性MBD1结合位点。然而，与对照组相比，含有抗SETDB1和抗三甲基H3K9抗体的ChIP在p53BP2启动子处检测到SETDB1数量减少，并且在转染了PIAS1和PIAS1/SUMO1的细胞中p53BP1启动子染色质的H3K9-甲基化减少(图6C，α-SETDB1，α-H3K9me3）。总之，这些实验表明，磺酰化MBD1虽然能够与甲基化DNA结合，但不能将SETDB1 HMT招募到染色质中。这导致抑制性组蛋白修饰的丢失和p53BP2的异常表达。

讨论

MBD1通过PIAS1和PIAS3蛋白进行sumoylation

翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、乙酰化和琥珀酰化，通常有助于调节蛋白质的功能和稳定性。在这里，我们证明甲基-CpG结合蛋白MBD1在人类细胞中的两个保守SUMO结合位点（VKQE）内的赖氨酸K450和K489处被SUMO1修饰。这两个序列似乎是MBD1中唯一的功能性sumoylation位点，因为含有赖氨酸450和489或谷氨酸452和491突变为丙氨酸的突变MBD1蛋白不能在HeLa或大肠杆菌表达哺乳动物SUMO结合酶。两栖动物和人类MBD1之间的sumoylation位点在氨基酸相似性总体较差的区域内保持不变，这表明SUMO与MBD1的结合可能在所有脊椎动物物种中都具有重要的功能。

在寻找以MBD1为靶点的酶活性以进行sumoylation时，我们发现两种E3 SUMO连接酶PIAS1和PIAS3（我们最初在酵母双杂交筛选中鉴定）是SUMO1与MBD1结合所必需的，如RNAi实验所示。当PIAS蛋白在HeLa中表达高于其内源性水平时，这两种蛋白都有效地靶向MBD1进行SUMO结合。SUMO很可能直接从PIAS1或PIAS3转移到MBD1，因为PIAS1催化活性不高C350S型和PIAS3碳钢/高碳钢没有导致MBD1-SUMO的积累体内PIAS1和PIAS3在其功能SAP和SP-RING域中具有显著同源性(图3A). 然而，这两种PIAS蛋白的最不保守的C末端区域与MBD1结合在体外在酵母双杂交试验中。另一方面，另一个PIAS家族蛋白PIASy既不与MBD1相互作用，也不刺激HeLa细胞中MBD1的sumoylation。对于短暂的酶-底物相互作用，内源性MBD1和PIAS1或PIAS3不能有效地从HeLa核提取物中免疫沉淀。只有当SETDB1蛋白水平被siRNA降低时，我们才能检测到内源性MBD1和PIAS蛋白之间的相互作用(补充图S6). 因此，PIAS1和PIAS3不太可能与MBD1形成稳定的复合物。

琥珀酰化MBD1蛋白的性质

大量研究表明，核蛋白的酰化可影响其定位和功能(约翰逊，2004;海伊，2005). 所有检测的人类细胞系中都存在sumoylated MBD1，并且在过度表达PIAS1或PIAS3的细胞中积累MBD1-SUMO，这促使我们研究SUMO1-修饰MBD1的特性。作为一个起点，我们确定MBD1的sumoylation位点对MBD1定位到核病灶并不重要。一种突变的MBD1蛋白MBD12（K–A）当两种sumoylatable赖氨酸均被丙氨酸取代时，显示出与野生型MBD1（包括过度表达PIAS蛋白的细胞中的MBD1）无明显区别的定位（未显示）。我们随后通过ChIP进行的分析表明，MBD1-SUMO与已知的内源性MBD1结合位点（如p53BP2启动子）结合以及未修饰的MBD1。鉴于sumoylatable赖氨酸K450和K489不位于MBD1的两个DNA结合域内，MBD1-SUMO1不太可能具有修饰蛋白质特有的DNA结合特性。然而，SUMO1的接合可能会引起细微的构象变化，从而影响MBD1对某些特定基因组序列的亲和力。未来，可能有兴趣更详细地研究MBD1-SUMO1的绑定偏好。

由于翻译后蛋白质修饰，包括sumoylation，可以促进或抑制特定蛋白质复合物的组装，我们研究了MBD1-SUMO1是否与其伴侣蛋白结合。有趣的是，我们发现MBD1-SUMO1很容易与HeLa核提取物中的染色质组装因子CAF-1 p150共免疫沉淀，但与SETDB1 HMT不共免疫沉淀。一贯地，来自PIAS1-或PIAS3-过度表达细胞的MBD1免疫沉淀物降低了HMT活性。假设MBD1的sumoylation位点与SETDB1结合区重叠或接近(图2A)可以假设，与MBD1偶联的SUMO1在空间上干扰SETDB1结合。然而，初步在体外结合实验表明，细菌表达的GST-MBD1和GST-MBD-SUMO1与SETDB1的相互作用同样良好(补充图S8). 因此，抑制SETDB1与MBD1-SUMO的结合体内可能涉及优先识别MBD1-SUMO1但不与MBD1结合的其他蛋白质，或者，sumoylation可能促进MBD1随后的翻译后修饰，从而抑制SETDB1结合。

在审查这份手稿时，据报道，AM/MCAF1是一种结合并调节SETDB1的蛋白质，优先与SUMO2/3修饰的MBD1相互作用在体外(内村等, 2006). 这些发现表明，SUMO2/3与MBD1的偶联可以通过MCAF1促进SETDB1向MBD1招募，从而导致异色位点的稳定，而我们的观察结果表明SUMO1与MBD1的偶联破坏了与SETDB1的相互作用。MCAF1绑定是否需要修改MBD1的SUMO2/3体内显然需要进一步研究，因为SUMO1和SUMO2/3的共轭可能会对MBD1相关的辅阻遏物复合物产生相反的影响。然而，我们注意到，与内村等(2006)在我们的实验条件下，我们未能检测到任何SUMO2/3修饰的MBD1。这些不同结果的原因可能是由于所使用的特定细胞类型和/或生长条件。

通过PIAS和SETDB1蛋白与MBD1的竞争性结合调节MBD1介导的抑制

当我们研究MBD1靶基因p53BP2在过度表达PIAS1的细胞中的表达时，SUMO1与MBD1结合的功能意义变得明显。正常情况下，MBD1与p53BP2启动子处的甲基化DNA结合，并通过SETDB1的募集抑制转录，SETDB1使组蛋白H3的K9处的染色质甲基化。在过度表达PIAS1的细胞中，MBD1-SUMO1仍与p53BP2启动子结合，但不再招募SETDB1。这导致H3K9甲基化降低和p53BP2基因异常转录。有趣的是，只有MBD12（K–A）含有两种sumoylatable赖氨酸的蛋白质被丙氨酸取代，但没有携带单个赖氨酸突变的MBD1蛋白质，可以挽救PIAS1过度表达细胞中p53BP2的抑制。这意味着赖氨酸、K450或K489的sumoylation足以消除MBD1介导的转录沉默。另一方面，当MBD1与SETDB1复合时，它似乎受到SUMO共轭的保护。因此，在用SETDB1 siRNA处理的细胞中，MBD1更容易用于sumoylation机器。值得注意的是，PIAS1过度表达细胞中p53BP2的上调与用SETDB1 siRNA处理的细胞中p53 BP2的表达水平相当。总之，这些观察结果表明存在一种精细平衡的机制来调节MBD1的转录抑制，通过SETDB1和PIAS蛋白质竞争结合MBD1(图7). 假设MBD1水平是恒定的，就像我们的整个实验一样，这种竞争的结果，以及MBD1抑制转录的能力，将取决于SETDB1和PIAS蛋白的浓度。因此，在SETDB1蛋白水平高或PIAS1和PIAS3水平低的细胞中，抑制性MBD1/SETDB1复合物的形成应该是有利的(图7A). 相反，高水平的PIAS1和/或PIAS3或低水平的SETDB1应导致SUMO连接酶更有效地与SETDB1竞争结合MBD1(图7B). 最终，MBD1与PIAS蛋白的相互作用将导致MBD1的sumoylation，抑制MBD1和SETDB1之间的复合物形成，以及MBD1靶基因的低效抑制。预计MBD1琥珀酰化后的转录激活需要从染色质中去除抑制性H3K9甲基化。鉴于sumoylated MBD1与CAF-1结合，但不再招募SETDB1使新组装的核小体甲基化，MBD1靶基因的有效表达可能需要细胞通过S期。或者，H3K9甲基化可以通过组蛋白H3交换伴随转录激活或通过酶促H3K9-去甲基化活性（被招募到MBD1-SUMO1）来去除。进一步的实验将解决这些有趣的可能性。

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通过PIAS蛋白和SETDB1之间的竞争调节MBD1介导的抑制。(一个)在表达低水平PIAS1或PIAS3的细胞中，MBD1/SETDB1抑制复合物的形成是有利的。(B类)如果PIAS1和PIAS3的表达量较高，它们将更有效地与SETDB1竞争。这将导致SUMO1与MBD1结合，并减少抑制性MBD1/SETDB1复合物。为了实现靶基因的高效表达，必须通过细胞进行一轮DNA复制或通过其他机制从染色质中去除H3K9甲基化。

总之，我们已经证明，PIAS家族蛋白将SUMO1偶联到MBD1可以抑制MBD1和SETDB1 HMT之间形成复合物，并拮抗MBD1/SETDB1介导的阻遏作用。我们的数据与MBD1在沉默染色质的转录抑制和维持中的功能由SETDB1和PIAS蛋白竞争结合MBD1来调节的模型一致。这种调节MBD1介导的抑制的灵活机制在胚胎发育过程中尤其重要，此时分化细胞的不同谱系中的基因表达被开启或关闭。此外，在进行致瘤转化的细胞中，CpG岛异常甲基化可能需要MBD1增强沉默转录的潜力，这可以通过下调PIAS蛋白实现。值得注意的是，PIAS1和PIAS3的异常高或异常低表达已被检测到人类肿瘤，并可能导致疾病的进展(啤酒等, 2002;拉波因特等, 2004;Wang和Banerjee，2004年).

材料和方法

质粒和瞬时转染

通过诱变PCR产生MBD1、PIAS1和PIAS3的点突变。为了产生催化活性的PIAS蛋白，我们将PIAS1的SP-RING结构域中的半胱氨酸350突变为丝氨酸（PIAS1C350S型)PIAS3催化域中的半胱氨酸334和组氨酸336分别为丝氨酸和丙氨酸（PIAS3碳钢/高碳钢). 将PIAS1、PIAS3（野生型和突变体）和PIASy克隆到带有N末端EGFP的pEGFP-C3载体中。在带有C末端单体RFP（mCherry）蛋白的框架中，将MBD1（野生型和突变体）克隆到pRFP-N1中(沙纳等, 2004). pFlag-SUMO1质粒是来自加州大学洛杉矶分校洪武的礼物。针对SUMO1、SUMO2、SUMO3、PIAS1和PIAS3设计的siRNA智能池是从Dharmacon购买的。SETDB1 siRNA靶序列如前所述(王等, 2003). 每个质粒500纳克或4μg siRNA瞬时转染到1.5×106使用Nucleofection试剂盒R和Nucleofector设备（Amaxa Biosystems）的HeLa细胞。细胞在标准的补充DMEM培养基中在10厘米的培养皿上培养48小时，并收集用于制备核提取物。在大多数siRNA实验中，细胞被转染两次，两次转染之间间隔2天。

抗体和co-IP分析

根据标准程序制备核提取物和co-IP。在适当的情况下，将NEM添加到用于制备核提取物和IP清洗液的所有缓冲液中，添加量为10 mM。根据标准方案进行蛋白质印迹。用于IP和Western blot的抗体为抗MBD1 IMG-306（TCS Cell Works）、抗Flag M2（Sigma）、抗CAF-1、抗GFP、抗HA（CRUK提供）、抗SETDB1（Upstate）、抗RFP（Clontech）、抗-PIAS1 sc8152、抗SUMO 1 sc5308、抗SUMO2/3 sc32873（Santa Cruz Biotechnology）和抗PIAS3（Abcam）。

体外下拉

GST标记的MBD1缺失结构和下拉过程已在前面描述(Sarraf和Stancheva，2004年). 在兔网织红细胞裂解物（TnT T7试剂盒，Promega）中翻译pGADT7-PIAS1和pGADT7-PIAS3。下拉实验中使用了100纳克每种GST-MBD1蛋白和1μl翻译的PIAS1或PIAS3。

组蛋白甲基化分析

如前所述，使用MBD1免疫沉淀物进行组蛋白甲基化分析(Sarraf和Stancheva，2004年). 将含有1–54氨基酸的重组GST标记组蛋白H3 N末端肽用作底物(橘树等, 2001). 成立三通过闪烁计数（Perkin-Elmer）测量免疫沉淀MBD1复合物的H-甲基，并通过放射自显影术在12%SDS凝胶上进行分析。

RT–PCR

RNA纯化、逆转录和聚合酶链式反应如其他地方所述进行(Sarraf和Stancheva，2004年).

炸薯条

按照中所述进行染色质IPSarraf和Stancheva（2004）对于re-ChIP，通过将SDS添加至1%并在室温下培养15分钟，从蛋白G sepharose中去除第一个IP（标度为3×）的免疫沉淀染色质。将样品稀释至0.1%十二烷基硫酸钠，并进行第二轮IP和洗涤。用于ChIP分析的其他抗体（针对上述抗体）为抗H3K9me3（由P Singh提供）和抗H3（Upstate）。

显微镜

转染HeLa细胞生长在DMEM中的15 mm盖玻片上，用PBS中4%的多聚甲醛固定，安装在vectashield中，并通过配备ColorViewII CCD相机和AnalySIS软件的Olympus BX61显微镜进行观察，以获取图像。

补充材料

补充数字和信息

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致谢

我们感谢Mario Mencia、Hong Wu、Prim Singh和Roger Tsien提供基本试剂，感谢Ken Sawin和Adrian Bird批判性阅读手稿。这项工作得到了CRUK高级研究奖学金和Wellcome信托基金项目拨款的支持。MJL由BBSRC资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团