结果和讨论
Six2在后肾间质中表达
我们之前已经表明Six2型在排泄系统的整个发育过程中表达，包括肾原索和后肾(奥利弗等, 1995). 在E10.0左右，Six2型UB侵袭前在后肾母细胞中检测到表达(奥利弗等, 1995). 半天后，Six2型表达定位于UB周围的MM中(). 在E11.5，在UB上皮周围诱导的MM中检测到表达(). 高水平的Six2型在UB的背侧观察到，在靠近输尿管柄的腹侧发现较低的水平，在那里管前聚集物将形成（箭头所示). 开发后期（E14.5），Six2型信使核糖核酸(和补充图S2B)和Six2蛋白（箭头，)留在Pax2（帕克斯）-在UB端背侧表达凝集的间充质（MM祖细胞池；补充图S2A)但在聚集和随后的间充质-上皮转换后形成Cadherin-6-、Pax2-和重量4-表示逗号正文（箭头在，以及补充图S2A和C). 这种表达模式表明，类似于Six1型(徐等, 2003),Six2型控制早期MM开发的某些方面。为了直接解决这个问题，我们在功能上取消了Six2型通过删除大多数Six2编码序列，包括两个DNA结合域、同源盒域和六领域(补充图S1).
Six2型在肾脏发育过程中表达。(A类)在E10.5处，Six2型（蓝色）在后肾母细胞中表达，这表示UB（星号）从Wolffian管中外翻。(B类)Six2型在E11.5的背侧MM（d）中高水平表达，在UB腹侧（v）管前聚集物形成（箭头）处下调。(C类)在E14.5处，Six2型肾皮质外周间质持续表达。(D类)Six2蛋白（棕色；箭头）定位于肾原区，但在表达钙粘蛋白-6（灰色；箭头）的MM的上皮衍生物中不存在。比例尺，100μm。
哺乳动物肾脏的正常发育需要Six2活性
Six2型-杂合小鼠没有表现出任何明显的异常。然而，Six2型-未受精小鼠出生后不久死亡。突变小鼠的初步形态学特征表明肾脏发育存在重大缺陷。E14.5泌尿生殖道的分离表明Six2型−/−肾脏大约比野生型同卵双胞胎小50%(); 在E16.5，降幅更大，约为65%(). 这些结果表明Six2型哺乳动物肾脏的正常发育需要活动。生殖道或中肾未见明显改变。
Six2对肾脏发育至关重要。E14.5解剖的泌尿生殖道分析(A类)和E16.5(B类)透露了Six2型-在E14.5和E16.5时，无肾（k）比野生型（+/+）胎仔小约50%，比野生型胎仔小65%。肾上腺（a）和膀胱（b）正常。（C–H）苏木精和伊红染色显示野生型肾脏中E11.5处(C类)UB（星号）诱导MM（箭头）凝结，但在此阶段没有管前聚集物或上皮。(D类)在Six2型-无窝卵，MM在UB背侧（d）形成异位和过早上皮小泡（箭头所示）。(E类)在E12.5处，UB尖端腹侧的野生型MM已开始转化为肾小泡上皮（箭头所示）。在UB尖端的背侧也检测到冷凝间质（箭头）。(F类)在Six2型−/−室友，UB腹侧和背侧的MM从间充质转变为上皮，并形成早熟和异位肾小泡（箭头所示）。注意花蕾顶端没有凝结的MM（箭头）。(G公司)在E14.5，野生型肾脏在皮质中表现出典型的未诱导和浓缩的间充质（箭头）和生长的分支尖端（星号），在髓质中表现出成熟的肾小球（g；箭头），以及分散在各处的间质基质细胞。(H（H）)Six2型-空肾显示皮质（箭头）中没有凝集的间充质，整个肾脏无组织的上皮结构（箭头），包括少数肾小球结构（g），基质细胞分布正常。比例尺，100μm。
组织学分析Six2型-空肾显示出一些有趣的形态学缺陷。在E11.5，野生型UB被冷凝的间充质包围（箭头，); 然而，在这个阶段还没有观察到上皮小泡的形成。相反，E11.5Six2型−/−肾脏表现为异位和间充质-上皮早期转变，导致UB周围形成早熟上皮性肾小泡（箭头所示，). E12.5时，野生型UB开始第二轮分支，输尿管分支腹侧的管前聚集物经历了间充质-上皮转化，形成肾小泡（箭头，). 在Six2型−/−室友，UB的分支没有超过最初的“T”发展阶段（星号，)，UB周围的异位肾小泡继续进一步发展（箭头所示），并且明显没有冷凝MM（箭头所指）。在E14.5处，野生型肾脏表现出冷凝MM（箭头，)以及在皮质肾原区生长的UB分支（星号）和散布在整个肾脏的间质基质细胞。相比之下Six2型-空肾显示异常、无组织的肾上皮肿块（箭头，)周围肾原区（箭头）缺少凝集的间质，整个肾脏的UB分支（星号）。间质基质细胞群似乎正常分布于Six2型-无肾().
Six2-完整肾脏出现过早和异位肾小泡
早熟异位多余肾小泡的存在Six2型-空肾是一种以前没有描述过的独特而有趣的表型。为了确认和更好地描述这些形态变化，Six2型-在E11.5时解剖空白肾脏，培养24、48和96小时，然后用以下抗体染色：抗泛细胞角蛋白标记UB(弗莱明和赛姆斯，1987年)，抗E-钙粘蛋白标记UB和远端小管(赵等, 1998)，抗层粘连蛋白A标记所有极化上皮结构(埃克布洛姆等, 1980,1991)，抗Cadherin-6标记近端小管前体(赵等, 1998)和抗Wt1标记足细胞前体/肾小球(巴克勒等, 1991;阿姆斯特朗等, 1993;Miner和Li，2000年).
在培养24小时的野生型外植体中，新的上皮性肾小泡在UB尖端的腹侧形成，并开始在少数细胞中表达Cadherin-6（箭头，). 相反，Six2型-空白肾移植体在UB腹侧和背侧形成的早熟肾小泡中显示出丰富的Cadherin-6表达（箭头，). 这一结果证实，在Six2型-突变肾，发育中的肾单位过早形成和分化。正如预期的那样，在培养48小时的野生型外植体中，表达层粘连蛋白A的上皮性肾小泡继续分化为逗号和S形小体，仅在UB尖端的腹侧（箭头，). 在Six2型-肾缺如，UB的分支非常有限（星号，)腹侧和背侧被层粘连蛋白-A表达的上皮小泡完全包围（箭头所示）。层粘连蛋白-A的表达和全细胞角蛋白的缺失表明，囊泡是来自间质的极化上皮，间质在UB分支尖端的背侧形成。
Six2型-无肾表现为早熟肾形成。(A、 B类)野生型和Six2型-保留在培养基中的空白肾外植体，与E-cadherin共染，标记UB（绿色；星号）和cadherin-6，标记发育中的肾单位（红色；箭头）。培养24h后，野生型肾小泡中很少有细胞表达Cadherin-6（A）；相反，在UB尖端的背侧和腹侧可以看到更高级的上皮结构（箭头）Six2型−/−外植体（B）。(C、 D类)48小时后，用抗泛细胞角蛋白（绿色）标记UB（星号）和抗层粘连蛋白A（红色）标记上皮结构，进行免疫组化。（C） 野生型肾脏芽尖腹侧（v）可见发育正常的逗号和S形体（箭头）。（D） 在这些患者中发现了大量异位肾上皮结构（箭头所示）和UB分支减少Six2型-无效外植体。(E、 F类)培养96小时的外植体标记有Wt1（红色）、Cadherin-6（红色）和E-Cadherin（绿色）。（E） 在野生型外植体中观察到UB（绿色）尖端的间充质祖细胞（箭头）和整个肾脏正常发育的肾小球（箭头）的正常储备。（F）Six2型−/−外植体在外周缺乏MM（白色箭头），但形成肾小球（箭头）。(G、 H（H）)培养96 h的外植体仅标记有Cadherin-6（红色）和E-Cadherin（绿色），以确定其在近端和远端小管（黄色箭头）边界处的任何重叠表达。这个Six2型-空白外植体（H）显示这些标记在发育中的小管中异常广泛的共表达，以及小管与UB（c）的罕见连接。
确定是否Six2型-空白肾脏产生形态正常的肾单位，我们将外植体培养96小时。如Wt1的核标记所示Six2型-肾形肾小球无效（箭头，; 肾单位定量包括在补充图S3A)但与野生型肾脏相比，它的皮质缺乏MM的储备（白色箭头，). 在野生型肾脏中，Cadherin-6和E-Cadherin在近端和远端肾小管的边界处共存（黄色箭头位于); 在中Six2型-肾功能不全，其表达域异常扩张，重叠程度更大（黄色箭头，). 小管段的其他标记物的表达包括Slc34a1公司(柯林斯和吉山，1994年;穆尔等, 2004),Slc12a1系列(冈巴等, 1994),Slc12a3系列(冈巴等, 1994;赫伯特等, 2004)、和钙结合蛋白-3(沙姆利等, 1992)E15.5中也检测到Six2型-变异肾(补充图S3).
野生型肾单位通常包含通过远端小管连接到UB的单个肾小球结构（). 相比之下，尽管存在大量肾小球，但在肾结构和UB之间只发现了少数（1-3）联系Six2型-空外植体（'c'in). 总之，这些结果表明Six2型-空肾形成肾小球并表达不同小管段的标记物；然而，Six2活性的缺乏导致肾小管的模式和区域化缺陷以及肾单位与UB的连接缺陷。这些缺陷可能是UB分支缺失的次要原因。
后肾通过MM和UB上皮之间的相互作用形成，这些相互作用导致功能性肾单位的形成(格罗布斯坦，1955年). 在这个过程中，许多特征良好的基因，包括重量1,埃亚1,Bmp7型,Pax2（帕克斯）,Six1型,Lim1型,销售1,重量4,第2部分,重量11,Gdnf公司,Ret公司，以及Foxd1系列，对正常的肾脏形态发生至关重要(Vainio和Lin，2002年;于等, 2004). 确定观察到的表型改变的原因Six2型-我们分析了这些基因在不同发育阶段的表达。
威尔姆斯的肿瘤抑制剂重量1编码UB生长和后肾母细胞存活所必需的锌指转录因子(克里德伯格等, 1993;多诺万等, 1999;摩尔等, 1999). Wt1在E10.5（箭头，)但随着发育进程，其在MM中的表达增加（箭头，)、聚集体、逗号体和S形体，并存在于鲍曼氏囊的podoctye前体和上皮细胞中（箭头，). 这个眼睛缺失1(埃亚1)基因编码作为转录辅激活物的蛋白酪氨酸磷酸酶(锂等, 2003)，用MM表示() (卡拉齐斯等, 1998)，并且是MM UB入侵所必需的(徐等, 1999). 在埃亚1-胚胎发育不全，UB无法侵入肾脏间质，肾脏无法发育(徐等, 1999). 骨形态发生蛋白-7(Bmp7型)是分泌生长因子TGF-β家族的成员，最初在UB、MM和来自间质的早期小管中表达() (达德利等, 1995;里昂等, 1995;达德利和罗伯逊，1997年). 在Bmp7型-空胚胎，E12.5后浓缩的MM细胞逐渐丢失，这导致出生时肾脏发育不全，肾小球很少。这一结果表明，Bmp7在肾脏发育过程中作为肾源性祖细胞池的存活因子(达德利等, 1995;罗等, 1995).
分子特征Six2型-肾脏无效。在E10.5，Wt1的表达水平没有明显差异(A、 B类; 红色），埃亚1(C、 D类)，或Bmp7型(E、 F类)在位于UB（星号）尖端的MM（箭头）中检测到Six2型-肾脏无效。在E11.5中也未检测到其表达水平的变化(G–L)，尽管UB周围的MM（箭头）（星号和轮廓）的大小减小，并且在Six2型−/−在E12.5处，在对照肾中可见上皮小泡（箭头），其中MM祖细胞位于皮层（箭头）(M、 O、Q).Six2型-无肾(N个)在UB的背侧和腹侧显示Wt1（红色）和Cadherin-6（绿色）表达的异位肾小泡（箭头），皮层无MM（箭头）。(P（P）)与UB周围MM的损耗一致（星号；用破折号概括），表示埃亚1在E12.5中丢失Six2型-肾脏无效。(R（右）)Bmp7型在异位肾小泡和UB中以正常水平表达。比例尺，100μm。
上述所有分子标记在E10.5中的表达正常Six2型-零基性(). 在野生型肾脏中，上皮小泡最初仅在E12.5左右分支UB的腹侧检测到(). 与发育缺陷的最早形态学迹象一致Six2型-肾功能缺失、早产和异位Wt1-表达（箭头，)和Bmp7型-表达()在突变肾的E11.5左右检测到上皮小泡。此外，我们观察到表达Wt1、，埃亚1，以及Bmp7型（箭头，). 在E12.5，异位Wt1-、Cadherin-6-和Bmp7型-表达整个UB周围的上皮小泡Six2型-零肾（箭头，)最有可能导致埃亚1-表示MM()这通常存在于野生型肾脏中().
Pax2（帕克斯），一种在UB、MM和MM上皮衍生物中表达的配对域蛋白()，是肾脏形态发生的关键参与者(德雷斯勒等, 1990;德莱斯勒和道格拉斯，1992年). 在Pax2（帕克斯）-胚胎发育不足，肾脏和生殖道无法发育(托雷斯等, 1995;赞成等, 1996).销售1，的鼠同源物果蝇属同源异形的spalt公司MM UB侵袭所必需的基因(西上村等, 2001;Nishinakamura和Takasato，2005年)，在E10.5胚芽的间充质细胞群中表达()在MM中为逗号体，在后期阶段被排除在Pax2表达域之外的细胞群（绿色箭头，). E10.5左右，UB入侵之前（数据未显示）和之后()，Pax2和Sall1在未诱导MM中的表达正常Six2型-无胚胎。在E11.5Pax2（帕克斯）MM和UB也正常Six2型−/−肾脏；然而Pax2（帕克斯）-嵌入UB周围的阳性MM细胞减少(). 如Sall1和Pax2的表达所示，在E12.5突变肾中检测到异位逗号体（箭头，). 如中使用的标记所示，边缘MM前体的耗尽Six2型-Pax2表达缺失进一步支持了肾功能缺失；然而，在皮质基质细胞群中仍有微弱表达Sall1的细胞().
成员的表达Wnt（重量）路径是在体外过早检测到的Six2型-肾脏无效。(A、 B类)Pax2（红色）和Sall1（绿色）用于识别E10.5 MM。在这个阶段，这两个标记的表达在Six2型−/−（B） ●●●●。(C类)重量4表达定位于E10.5野生型肾脏的腹侧间质（箭头所示）；相反，它从外胚层扩展到了Six2型-空室友(D类). (E类)在此阶段，正常的低水平Sfrp2型存在于Wolffian导管周围的野生型间充质中（箭头所示）。第2部分表达也在外周扩展到UB（箭头）的背侧，并且在突变的同窝卵中其表达高度上调(F类). (G、 H（H）)在E11.5，Pax2（帕克斯）UB和MM中的表达式Six2型-空肾与野生型相似，尽管MM的大小减小了。(我)在此阶段，Six2（棕色）和重量4（蓝色）在MM中是互补的，即Six2主要在UB的背侧表达重量4（箭头）仅在腹侧。(J型)在Six2型−/−肾，重量4外胚层的表达扩展到MM的背侧（箭头）。(K（K）)在E11.5，第2部分野生型MM中的表达与Wnt4；虚线表示UB上皮。(L（左）)在Six2型−/−肾脏，水平第2部分上调并向外扩张至背侧（箭头）。(M（M）)在E12.5，Pax2和Sall1在MM（白色箭头）中保持表达，在肾小泡中也检测到表达（箭头）。基质群体（绿色箭头）也表达Sall1。(N个)在E12.5，Pax2在Six2型−/−肾脏突出显示UB周围存在异位多余肾小泡（箭头）。Pax2在UB和肾小泡中表达正常，但表达Pax2的间充质细胞（白箭头）缺失。然而，表达Sall1的基质细胞（绿色箭头）仍然存在于Six2型-在这个阶段肾脏是空的。(P、 R（右）)重量4和第2部分在E12.5的异位肾小泡（箭头）中表达Six2型−/−肾脏的水平与野生型相当(O、 问)肾脏。比例尺，100μm。
Wnt4和Sfrp2在Six2-全后肾间质中异位表达
这个Wnt（重量）信号通路调节胚胎发生过程中的各种关键形态发生步骤，包括肾间充质转化为上皮。重量4编码一种必要的间充质衍生信号，该信号是管前聚集物转变为上皮性肾小泡所必需的，其活性对肾单位的形成是必要的(完全的等, 1994;Vainio和Uusitalo，2000年). 在重量4-肾功能不全，间充质最初在UB生长周围凝结，但通常形成肾单位的细胞聚集体不能上皮化，并且很少形成肾小泡(完全的等, 1994). 此外，Wnt4足以触发孤立MM的小管生成(基斯佩特等, 1998). 然而，Wnt4不太可能是UB衍生的主要诱导信号，因为它首先在UB尖端腹侧的间充质聚集体中表达(完全的等, 1994).
之前已经表明Wnt（重量）活性由分泌的卷曲相关蛋白调节(分泌型卷曲相关蛋白). 基质表达Sfrp1，这是一种可能通过与Wnt4结合的卷曲受体竞争来阻止间质上皮化的因子(吉野等, 2001). Sfrp1的抑制活性被Sfrp2抑制，该家族的另一个成员的表达模式与重量4(莱迈斯特等, 1998;莱舍尔等, 1998). 因此，Sfrp2拮抗Sfrp1抑制功能的能力可以促进上皮极化(吉野等, 2001).
观察到的早熟肾发生Six2型−/−肾脏提示Wnt（重量）突变MM中的信号可能发生改变。在E10.5，重量4仅在野生型肾脏（箭头，)，而在Six2型-空室友，重量4表达外延至MM背部至UB（箭头，). 如所示,第2部分在Wolffian导管周围的野生型MM中检测到低水平表达。类似于重量4,第2部分表达也在外周扩大并在Six2型−/−MM（毫米）(). 这些结果确定，早在E10.5，Six2活性的缺乏促进了允许诱导信号的间充质区异位扩张。
有趣的是，在E11.5左右，Six2的表达模式与重量4和第2部分在野生型MM中，其表达域重叠最小；Six2的表达主要局限于UB的背侧（棕色，)，而重量4和第2部分表达仍局限于UB腹侧管状前聚集物（箭头，). 在Six2型−/−肾，重量4表达仍在外周扩张至MM背侧（箭头，)，与强异位灶共定位Sfrp2型表达式(). 异位早发肾的存在和MM的耗竭Six2型−/−通过分析E12.5处这些相同信号分子的表达，证实了肾脏。在正常肾脏的这个阶段，重量4和Sfrp2型表达为管状前聚集体、逗号体和S形体（箭头、，)，所有这些都来自表达Six2的间充质细胞群体。如前面E12.5中所示Six2型-由于UB尖端背侧和腹侧多余异位肾小泡的过早形成，MM人群已经耗尽()继续表达这些分子标记().
最近，重量9b据报道，在肾脏发育过程中，Wolffian导管和UB分支也表达(钱等, 2003). 此外，该基因在Wnt4上游作用，诱导肾发生，并对MM的诱导和随后上皮性肾小管的形成至关重要(卡罗尔等, 2005). 在E11.5和E12.5处，重量9b表达正常Six2型-零Wolffian导管及其衍生物，UB(补充图S4). 发现重量4是外扩张的重量9b在中保持正常Six2型-突变肾脏表明Six2是Wnt-促进肾发生级联的MM调节器（Wnt9b下游但Wnt4上游）。在这种情况下，通常需要Six2活性来抑制背部间充质中的诱导信号，从而抑制间充质祖细胞池中的肾发生。
Six2-null肾脏的相互诱导作用有缺陷
接下来，我们分析了除了一些调控MM分化的基因表达的确定变化外，UB分支所必需的其他基因的表达是否也受到影响Six2型-无效肾脏。UB分支需要Wnt11、Gdnf和Ret之间的协作交互(马宗达等, 2003). 的表达式重量11通常在分支UB提示中检测到(;基斯佩特等, 1996). 功能性失活重量11UB分支形态发生中的细微缺陷导致轻度肾发育不全(马宗达等, 2003). 胶质源性神经营养因子(Gdnf公司)在间质中表达()及其受体酪氨酸激酶Ret公司，用UB表示()，对于促进UB从肾管中生长至关重要(帕奇尼斯等, 1993;杜贝克等, 1996;黑尔米希等, 1996;摩尔等, 1996;皮凯尔等, 1996;桑切斯等, 1996;特鲁普等, 1996;织女星等, 1996;舒哈特等, 1996;萨里奥拉和萨尔马，1999年). 当UB在E10.5侵入后肾母细胞时，重量11的UB提示中的表达式Six2型−/−肾脏正常()确认初始UB诱导未受影响。到E11.5，入侵的UB分支成T形结构，两端有两个扩张的壶腹，表达重量11(). 在这个阶段，重量11在UB提示中减少了Six2型−/−肾脏(). 这减少了重量11是最早表明MM和UB之间的相互作用在硅x2-肾脏无效。在E12.5处，重量11表情消失在Six2型-空UB()结果表明，突变肾脏中UB分支形态发生的诱导机制被过早破坏。The levels of expression ofGdnf公司和Ret公司在中是正常的Six2型-E10.5、E11.5和E12.5处的肾脏无效(); 因此，这种表达下调重量11可能是由于其他替代机制的缺陷，如蛋白多糖环境的变化(基斯佩特等, 1996).
相互感应作用在Six2型-肾脏无效。重量11(A、 B类),Ret公司(C、 D类)、和Gdnf公司(E、 F类)表达正常Six2型−/−E10.5的肾脏，表明UB的初始诱导机制未受影响。(G公司,H（H）)在E11.5，重量11UB端的表达下调Six2型−/−肾脏与野生型同卵双胞胎相比Ret公司(我,J型)和Gdnf公司(K（K）,L（左）)是正常的。(M（M）,N个)在E12.5，相互诱导相互作用在Six2型−/−肾脏缺乏重量11UB中的表达式（虚线轮廓）。(O（运行）,P（P）)Ret公司表达保持在正常水平Six2型-E12.5处的UB为空。(问,R（右）)Gdnf公司这种表达证实了MM群体大小的异常减少和异位发育肾单位的存在（箭头所示）。比例尺，100μm。
除了在,和，我们还表征了其他众所周知的肾脏发育调节因子的表达，如Six1型(奥利弗等, 1995;徐等, 2003),第8页(普拉乔夫等, 1990),Fgf8型(克罗斯利和马丁，1995年)、和Lim1型(藤饭等, 1994). 表达模式的变化Six1型,第8页,Fgf8型（未显示数据），以及Lim1型(补充图S4)与我们之前在使用识别相似细胞群的其他标记物（例如Pax2、Eya1、Wnt4）时观察到的结果一致。这些结果，以及这些基因功能失活导致的肾脏表型(肖洛特和贝林格，1995年;曼苏里等, 1998;臧等, 2000;布查德等, 2002;拉克利夫等, 2003;锂等, 2003;徐等, 2003;Grieshammer公司等, 2005;佩兰托尼等, 2005)，表示他们很可能没有参与Six2型-无效表型。此外，在表达Foxd1系列(哈蒂尼等, 1996)，虽然该细胞数量减少是因为Six2型-无肾(补充图S4). 总之，这些结果表明，UB和E10.5后肾母细胞之间的初级互易诱导在很大程度上不受影响Six2型-肾功能缺失，提示UB侵袭和MM诱导不需要Six2型活动。然而，去除Six2活性促进的早熟和异位肾发生导致间充质祖细胞/干细胞群耗竭，并失去持续肾脏生长所需的相互诱导作用。在发育后期（E14.5），大多数必要的间充质和输尿管基因（例如。，埃亚1,Pax2（帕克斯）,Ret公司)在突变肾中表达下调或缺失，而Wnt4仍存在于发育中的肾单位和基质标记物（例如。，Foxd1系列,第1部分,拉尔德2)保持不变(补充图S5和数据未显示）。
细胞凋亡导致Six2-全肾间充质祖细胞库的丢失
对早熟异位上皮小泡的检测表明，缺乏Six2的MM会发生早期肾发生，导致未诱导的间充质细胞数量迅速减少。MM标记物的分析也揭示了肾小泡出现之前E11.5 MM人群的大小减少埃亚1,Pax2（帕克斯）,Bmp7型，以及Gdnf公司(,和). 确认E11.5 MM人口减少并分析Six2型-无效肾脏，我们在相邻切片上使用了抗磷酸组蛋白H3和Pax2的抗体。定量Pax2阳性人群中PH3阳性细胞的数量表明，E10.5中MM的增殖率和大小没有改变Six2型-无肾(). 然而，尽管E11.5野生型和突变型肾脏的增殖速度相似，但MM群体的规模在Six2型-无肾(). 此外，TUNEL分析检测到的E11.5的MM和基质中的细胞死亡量显著增加Six2型-无肾(); 祖细胞池中细胞凋亡的增加也可能有助于观察到的两个群体在整个肾脏发育过程中的规模缩小。E10.5或E12.5处未检测到明显的凋亡变化(); 然而，细胞死亡从E14.5增加到E17.5(和数据未显示）。这些表型改变的结果是出生时肾脏严重发育不良和无功能。
Six2型−/−E11.5时肾脏出现凋亡增加。(A类,B类)E10.5中未测量到平均细胞总数（A）或平均增殖细胞百分比（B）的差异Six2型-空MM(C、 D类)在E11.5，Six2型−/−肾脏明显小于野生型（C；P（P）=0.006); 然而，增殖细胞的数量是相当的。(E、 F类)与它的野生型同胞相似，在E10.5中未检测到凋亡细胞Six2型-变异肾脏。显示UB（星号）和后肾芽基区（虚线）。(G公司,H（H）)凋亡细胞数量的异常增加在Six2型-在此阶段，围绕UB的空MM（箭头）。(一、 J型)E12.5时，野生型和野生型之间的凋亡细胞数量没有显著差异Six2型−/−肾脏。(K（K）,L（左）)与野生型对照组相比，突变肾中E17.5处的凋亡细胞数量再次增加（箭头所示）。比例尺，100μm。
这些结果表明Six2型-肾功能不全，MM迅速聚集，肾小泡在体外过早形成。这些事件，再加上异常凋亡的出现，耗尽了间充质祖细胞/干细胞群，而这些细胞并未得到补充。因此，至少在MM的一部分中，需要Six2活性来抑制上皮极化，从而允许未分化的间充质祖细胞随着器官生长而更新。Six2反对UB衍生的诱导信号促进的肾小管生成，因此保留了一部分处于未分化状态的间充质祖细胞/干细胞，以供将来的肾脏生成。
Six2异位表达抑制了器官培养系统中间充质细胞向上皮细胞的分化
为了进一步测试该工作模型，我们在小鼠肾脏器官培养物中，在鸡β-肌动蛋白启动子的控制下体外表达Six2。表达EGFP或FLAG-tagged Six2的质粒被导入在Transwell过滤器上生长的野生型E12.5肾脏中，使用之前发布的电穿孔协议的修改版本(高等, 2005). 在培养24小时后，EGFP的表达是稳定的，可以维持数天。培养48小时后，将电穿孔肾脏固定并切片，以确定EGFP和FLAG-Six2表达的分布。在对照培养基中(n个=8），在发育中肾脏的间充质成分和上皮成分中发现EGFP标记细胞的比例几乎相等(，以及). 与之前的结果一致，表明MM细胞可以并入UB上皮(乔等1995年)在分支上皮小管和发育中的肾单位中观察到EGFP阳性细胞；这两种上皮结构均为Pax2阳性()并且被含有层粘连蛋白的基底膜包围(). 相反，电穿孔Six2型表达载体(n个=8）导致FLAG-Six2标记水平高，几乎只在间充质细胞群中出现(，以及). FLAG-Six2阳性细胞定位于周围间质和间质细胞，如图所示Foxd1系列表达式(). FLAG-Six2在MM或UB上皮的上皮结构中很少检测到。因此，Six2的异位表达抑制了器官培养系统中间充质细胞向上皮细胞的分化。这些结果支持了Six2反对上皮极化的假设，并有助于维持未分化的肾母细胞群。
Six2在野生型肾器官培养中的过度表达。在微量注射和电穿孔EGFP或FLAG-Six2表达质粒48小时后，用Pax2（红色；A–D）、层粘连蛋白（红色；E–H）、EGFP（绿色）或FLAG-Six2（绿色。(A、 B类)EGFP和Pax2在上皮结构中共存（箭头），EGFP也在外周间质中表达（箭头）。(C、 D类)表达FLAG-Six2的细胞几乎只存在于与Pax2阳性细胞分离的外周和间质间质（箭头）中。(E、 F类)EGFP阳性细胞位于发育中的小管内（箭头所示），以含层粘连蛋白的基底膜为界，并位于外周间质内（箭头）。(G、 H（H）)FLAG-Six2表达细胞（箭头）没有被含有层粘连蛋白的基底膜包围，并表现出间充质表型。(I、 J)现场杂交Foxd1系列随后使用抗GFP（I）或抗FLAG（J）抗体进行免疫组化，结果表明表达FLAG-Six2的细胞主要位于间质基质中，而表达EGFP控制载体的细胞则存在于所有细胞群中。比例尺，100μm。
表1
| 矢量 | 层粘连蛋白（+） | 层粘连蛋白（−） | Pax2（+） | Pax2（−） | 单元格/节 |
|---|
| EGFP公司 | 7.6±4.0 | 13.8±7.9 | 9.7±5.2 | 11.3±6.4 | 21.2±7.6 (n个=24）一 |
| Fl-Six2层 | 0.44±0.89 | 18.8±12.4 | 1.2±1.4 | 20.4±4.5 | 20.6±12.6 (n个=32)一 |
| 一八种电穿孔培养物的切片数。 |
Six2活性保持肾母细胞处于未分化状态
在诱导之前，MM是几千个细胞的小集合。作为对诱导信号的响应，这些细胞协调精确的增殖和分化程序，以生成肾单位中的大多数上皮细胞。由于肾脏模式的连续性，随着肾脏的生长，新的肾单位在外围被诱导。因此，一些MM细胞在早期聚集并极化，而其他细胞增殖并保持间充质，在随后的阶段生成肾单位。我们的结果确定了Six2在维持和更新MM祖细胞未分化群体中的重要作用。虽然基因突变Pax2（帕克斯）,重量1,埃亚1,Six1型，以及销售1(克里德伯格等, 1993;托雷斯等, 1995;徐等, 1999,2003;西上村等, 2001)影响对诱导信号的反应，导致发育完全停滞和肾发育不全Six2型-突变表型是独特的，因为它表现出早期和异位上皮分化。最有可能的是，这些事件和MM发育早期检测到的异位凋亡耗尽了外周间充质祖细胞群，因此没有新的肾单位生成。此外，我们在突变肾脏中发现的互惠诱导相互作用的维持缺陷很可能导致UB分支阻滞和后期观察到的肾单位模式错误。此外，肾器官培养中的功能获得实验表明，Six2的持续表达抑制了间充质向上皮的转化。因此，必须下调间充质细胞中Six2的表达，才能使间充质管前聚集物上皮化。如前所述，有人建议Bmp7在肾脏发育过程中作为肾源性祖细胞池的存活因子(达德利等, 1995;罗等, 1995); 因此，Bmp7信号通路可能介导Six2功能。然而，在Bmp7型-E12.5前肾脏无效(达德利等, 1995;罗等, 1995;达德利和罗伯逊，1997年)，并且我们没有检测到Bmp7型在E11.5中Six2型−/−MM（毫米）(). 总之，这些结果表明，Bmp7很可能在Six2型−/−因此，在肾脏发育的早期阶段（即E10.5–E11.5），它不是维持间充质祖细胞池的关键因素。
值得强调的是，尽管早期肾小管生成是由于缺乏Six2活性所致，但基质群体的遗传标记没有发生显著变化。这一发现表明，Six2对上皮谱系中的祖细胞命运有不同的控制作用。这与在肾脏发育的早期阶段分别指定基质和肾脏谱系的假设一致(哈蒂尼等, 1996).
如我们的表达数据所示，Six2通过直接或间接抑制重量4和第2部分重要的是，尽管Six2及其密切相关的家族成员Six1在同一胚胎MM群体中表达，但其功能丧失表型表明，它们在功能上无冗余，并控制着肾脏发育的不同方面。基于这些结果，我们提出Six2通过抑制促进上皮分化的诱导信号和保持未分化状态下的可用芽细胞池来控制肾上皮祖细胞/干细胞群的命运。
