美国国家科学院院刊。2000年3月28日；97(7): 3544–3549.
重组狂犬病病毒作为潜在的HIV-1活病毒疫苗
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马蒂亚斯·施奈尔
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
希瑟·D·福利
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
凯瑟琳·西勒
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
詹姆斯·麦盖蒂根
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
伯恩哈德·迪茨霍尔德
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
罗杰·波梅兰茨
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
*人类病毒学中心和†生物化学和分子药理学，§微生物学和免疫学，以及¶宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学杰斐逊医学院Dorrance H.Hamilton实验室医学部，邮编：19107
由宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Hilary Koprowski传达
收到日期：1999年10月18日；1999年12月21日接受。
摘要
从实验室适应型（CXCR4-tropic）和主要（双重）HIV-1分离物中表达HIV I型（HIV-1）包膜糖蛋白（gp160）的重组狂犬病病毒（RV）疫苗株基载体被开发出来。除其他RV蛋白外，RV基因组内的额外转录停止/启动单元用于表达HIV-1 gp160。人类T细胞株感染重组RV后融合表明，HIV-1 gp160蛋白稳定且功能性表达。用表达HIV-1 gp160的重组RV接种小鼠，在用重组HIV-1 gp120蛋白单次增强后，诱导了针对HIV-1包膜蛋白的强烈体液反应。此外，在小鼠血清中可以检测到高达1:800的抗HIV-1中和滴度。这些数据表明，表达HIV-1 gp160的活重组RV（一种弹状病毒）可作为HIV-1疫苗的有效载体。
关键词：弹状病毒，RNA，包膜，gp160
尽管在过去几年中，HIV-1感染的治疗取得了巨大成功(1,2)开发保护性HIV-1疫苗仍然是阻止HIV-1大流行的主要目标。大多数成功的病毒性疾病疫苗都是由杀死或减弱的病毒组成的（综述见参考文献。三). 这种方法似乎不适用于HIV-1，因为被杀死的HIV-1病毒只会产生较差的中和抗体反应，而不会产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。最近的报告表明，即使是减毒的猴免疫缺陷病毒（SIV）株也会在猴子身上引起艾滋病样疾病，因此使用减毒的HIV-1株可能是不可能的(4,5). 尽管如此，恒河猴接种活疫苗的发现，nef（奈夫）-被删除的SIV完全免受活的致病性SIV的攻击(6)强调了重组病毒是抗HIV-1活疫苗的最佳候选病毒的假设。最广泛使用的重组病毒载体是基于表达HIV-1基因的痘苗病毒或金丝雀花病毒，主要是HIV-1包膜蛋白gp160(7–10). 这些载体能够在包括人类在内的多种动物中诱导CTL反应和血清转化，但它们不能诱导针对HIV-1的高滴度中和抗体，也不能完全保护黑猩猩免受HIV-1的攻击(11).
狂犬病病毒（RV）是一种杆状病毒家族的负链RNA病毒，它拥有一个相对简单、模块化的基因组组织，编码五种结构蛋白(12). RV作为一种表达载体的适用性最近已被证明，并表明其作为病毒疫苗载体的潜在用途(13,14). 我们使用了一种基于RV疫苗株的载体，当口服或肌肉注射时，该载体对多种动物物种无致病性。由于几个原因，这种方法比其他病毒载体显示出优势。首先，它的模块化基因组组织使基因改造比大多数更复杂的DNA和加标记RNA病毒基因组更容易。其次，从RV基因组中表达的大型外源基因高度稳定(14). 第三，杆状病毒具有细胞质复制周期，没有证据表明重组和/或整合到宿主细胞基因组中(15). 与大多数其他病毒载体相比，人类对RV的血清阳性率微不足道，用基于RV的载体免疫HIV-1不会干扰对该载体本身的免疫。由于用RV疫苗株对RV进行口服免疫在黑猩猩中是成功的，并且是致敏的（J.Cox和U.Wulle，个人通讯），基于RV的载体也可能有希望诱导对HIV-1的粘膜免疫。此外，RV生长到高滴度（109病灶形成单位），而不会杀死细胞，这可能导致与细胞病变载体相比，HIV-1基因的表达时间更长。结果与nef（奈夫）-被删除的SIV可保护机体免受致命的SIV攻击，这表明HIV-1病毒基因的长期表达可能是诱导机体抵抗HIV-1感染的关键。
我们之前报道过将RV用作不同报告基因的表达载体(16). 在这里，我们测试了基于RV的载体诱导对HIV-1的免疫反应的能力。我们在RV转录停止/启动信号的控制下，在RV糖蛋白（G）和聚合酶（L）蛋白之间克隆了HIV-1 gp160（株NL4-3和89.6）的编码区。所得重组RV与其他RV蛋白一起表达HIV-1 gp160。在单个重组HIV-1蛋白增强后，HIV-1包膜蛋白稳定表达，并在免疫小鼠中引发强烈的体液免疫反应。
材料和方法
质粒构建。
在先前描述的RV cDNA pSAD L16中引入了两个单位点(17)G上游(Sma公司一） 和Ψ基因(Nhe公司一） 通过使用引物RP11 5′-CCTCAAAAACCGGGAAAGAGAGATGGTCCTCAG-3′和RP12 5′-GACTGTAGACYGGCTAGCTTCAACGAG-3′进行定点突变（GeneEditor，Promega），得到质粒pSN。pSN是用于引入新转录停止/启动序列以及单个Bsi公司WI站点使用PCR策略。首先，使用Vent聚合酶（New England Biolabs）和正向引物RP1 5′-TTTGCTAGCTAAAAGTGGTCATAAGC-3′或RP10 5′-CACTACAAGTCGAGACTTGGAGAGATC-3′从pSN中扩增出两个片段。反向引物为RP18 5′-TCTCGAGGTTCTCTCCAACAA-3′和RP17 5′-AAGCTAGC公司美国汽车协会CGTACG公司GGAGGGTGTTAGTTTTTCATG公司GACTTGGATCGTGAAAGGACG-3′。RP17包含RV转录停止/启动序列（带下划线）和Bsi公司WI和Nhe公司I站点（斜体）。PCR产物用Nhe公司I和连接，并从琼脂糖凝胶中洗脱3.5kb的条带。凝胶洗脱后，用克拉I/MluI并与之前的克拉I/MluI-消化pSN。质粒命名为pSBN。
用Vent聚合酶、前向引物5′-GGG对编码HIV-1毒株89.6和NL4-3包膜蛋白的HIV-1 gp160基因进行PCR扩增CTGCAGCTCGAGCGTACG公司AAAATGAGAGAGAGACAGG-3′，含Pst（磅/平方英尺）我/Xho公司I/BsiWI位点（斜体）和反向引物5′-CCTCTAGA公司TTATAGCAAAGCCCTTTCCAAG-3′包含Xba公司我（斜体）网站。PCR产物用Pst（磅/平方英尺）我和Xba公司I和被克隆到pBluescript II SK（+）（Stratagene）。在序列构象后，用Bsi公司WI和Xba公司我和被连接到pSBN，pSBN已被消化巴西WI和Nhe公司I.所得质粒命名为pSBN-89.6和pSBN-NL4-3。
从cDNA中回收感染性RV。
对于重组RV的救援实验，我们使用了前面描述的痘苗病毒无RV回收系统(18). 简而言之，BSR-T7细胞(19)稳定表达T7 RNA聚合酶（S.Finke和K.-K.Conzelmann慷慨捐赠，慕尼黑Genzentrum）的，除了编码RV N、P和L蛋白（分别为2.5、1.25和1.25μg）的质粒外，还使用Ca2人事军官4转染试剂盒（Stratagene），如供应商所示。转染三天后，将组织培养上清液转移到新鲜的BSR细胞上，三天后通过对RV N蛋白（Centocor）的免疫染色检测感染性RV。
一步增长曲线。
将BSR细胞（BHK-21克隆）置于60mm培养皿中，16小时后感染（7×10）6细胞），总体积为2 ml的SBN、SBN-89.6或SBN-NL4-3感染倍数（moi）为10。在37°C培养1小时后，取出接种物，并用PBS冲洗细胞四次，以清除任何未被吸收的病毒。再次加入3毫升完整培养基，并在感染后4、16、24和48小时去除100μl组织培养上清液。在BSR细胞上对病毒小份进行重复滴度。
免疫接种。
将从Jackson实验室获得的5只4-6周龄雌性BALB/c小鼠分为5组，分别接种在两个后脚垫的皮下，每组10只6形成SBN、SBN-89.6或10单位的病灶5在感染10μg重组gp41（IIIB，Intracel，Issaquah，WA）和10μg在100μl完全弗氏佐剂中的重组gp120（IIIB，Intracell）3个月后，每组5只小鼠中的3只腹腔内增强免疫。
酶联免疫吸附试验（ELISA）。
将重组HIV-1 gp120（IIIB株，Intracel）重新悬浮在涂层缓冲液（50 mM Na）中2一氧化碳三pH 9.6），浓度为200 ng/ml，并在每孔100μl的96周ELISA MaxiSorp板（Nunc）中进行电镀。在4°C下孵育过夜后，将平板洗涤三次（PBS，pH 7.4/0.1%Tween-20），在室温下用封闭缓冲液（PBS，pH 7.4/5%干奶粉）封闭30分钟，并与连续稀释的血清孵育1小时。盘子清洗三次，然后添加辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG（H+L）二级抗体（1:5000，Jackson ImmunoResearch）。在37°C下培养30分钟后，将平板清洗三次，并加入200μl OPD底物(哦-将苯二胺盐酸盐（Sigma）添加到每个孔中。通过添加50μl 3 M H停止反应2SO公司4每口井。在490 nm处测定光密度。
西方印迹法。
将人T淋巴细胞（Sup-T1）细胞感染2 moi达24小时，并将其重新悬浮在裂解缓冲液中[50 mM Tris，pH 7.4/150 mM NaCl/1%Nonide P-40/0.1%SDS/1×蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）]5分钟。将蛋白质悬浮液转移到微量离心管中，以10000×克用10%SDS/PAGE分离蛋白质并转移到PVDF-Plus膜上（Osmonics，Minnetonka，MN）。在封闭1小时【5%奶粉置于PBS（pH 7.4）中】后，在封闭缓冲液中用羊α-gp120抗体（ARRRP）（1:1000）或人α-狂犬病血清（1:500）孵育印迹1小时。添加山羊α-人或驴α-羊辣根过氧化物酶结合抗体（1:5000）的二级抗体（Jackson ImmunoResearch），并将印迹培养1小时。每次抗体孵育后，用WB-水缓冲液（PBS，pH 7.4/0.1%吐温-20）进行三次洗涤。按照制造商的指示进行化学发光（NEN）。
根据制造商的说明，使用商业Western blot试剂盒（马萨诸塞州剑桥市免疫科QualiCode HIV-1/2试剂盒）进行Western blot分析以检测抗HIV-1抗体，除小鼠血清外，α-人IgG结合物被1:5000稀释的碱性磷酸酶结合山羊抗鼠IgG（H+L）替代（Jackson ImmunoResearch）。
病毒中和试验。
在293T细胞上回收HIV-1菌株。病毒库在MT-2细胞（HIV-1 NL4-3）上扩增，在−75°C下冷冻，并在MT-2电池上滴度。根据Montefiori进行中和分析等。(20). 简言之，≈5000 TCID50HIV-1的NL4-3型与小鼠血清系列稀释液孵育1小时。添加MT-2细胞并在37°C、5%CO下培养2持续4-5天。将细胞（100μl）转移到聚-我-赖氨酸平板，用中性红染料（中性红，ICN）染色75分钟。用PBS清洗细胞，用酸性乙醇溶解，并在550 nm处使用色度计进行分析。据估计，保护作用至少为50%的病毒抑制作用。
结果
表达HIV-1包膜蛋白的重组RVs的构建。
为了产生表达HIV-1 gp160的RV重组病毒，我们基于前面描述的感染性RV cDNA克隆pSAD-L16构建了一个新的载体(13). 通过使用定点突变和PCR策略，从RV基因组中删除了ψ基因，并构建了一个新的转录单元，其中包含一个RV停止/启动信号和两个单位点(Bsi公司WI和Nhe公司一） ，被引入RV基因组。所得质粒命名为pSBN（图。). 通过标准方法回收SBN，并显示出与SAD-L16相同的生长特征和类似的病毒滴度，这表明Ψ基因的缺失或新的转录单位都不会影响RV载体（数据未显示）。将从SBN中表达的HIV-1包膜基因（NL4-3和89.6）通过PCR产生，并在巴西WI和Nhe公司I位点，产生质粒pSBN-NL4-3和pSBN-89.6（图。). 通过DNA测序检查所有结构。
重组RV基因组的构建。顶部显示了带有五个ORF的野生型RV基因组（SAD L16）。通过使用PCR策略和定点突变，删除了整个Ψ基因，并在G和L基因（SBN）之间引入了一个新的包含两个单位点的最小RV转录单元。编码HIV-1的cDNA序列89.6或HIV-1NL4-3型gp160是通过使用Bsi公司WI和Nhe公司产生质粒pSBN-89.6或pSBN-NL4-3的I位点（底部）。
表达HIV-1的重组RVNL4-3型或HIV-189.6通过转染稳定表达T7-RNA-聚合酶的细胞，以及编码RV N、P和L蛋白的质粒以及编码相应RV全长抗原RNA的质粒，可以恢复包膜蛋白。转染后3天，将转染细胞的上清液转移到新鲜细胞中，并在三天后通过间接免疫荧光显微镜分析HIV-1 gp160的表达。感染重组SBN-NL4-3和SBN-89.6的细胞中gp160的阳性信号证实了表达HIV-1包膜蛋白的重组RV的成功恢复（数据未显示）。
重组RV的生长特性。
与野生型SBN相比，SBN-NL4-3的滴度降低了3倍，SBN-89.6的滴度减少了10倍。为了详细检查病毒复制的差异，对重组RV进行了一步生长曲线分析。BSR细胞感染了10个moi，以允许所有细胞同步感染。用新鲜培养基替换病毒接种物后，在指定的时间点测定病毒滴度（图。). 与野生型RV相比，两种表达HIV-1 gp160的重组RV的复制速率仅略有降低，最终滴度降低2.3-（SBN-NL4-3）或8倍（SBN-89.6）。重组RV基因组长20%不能解释这些病毒生长较慢的原因。表达1.9-kb基因（萤火虫荧光素酶）的重组RV生长到野生型RV滴度(14). 以前曾有研究表明，对于另一种弹状病毒，即水泡性口炎病毒（VSV），VSV表达的某些糖蛋白，如HIV-1包膜蛋白，会降低这些病毒的滴度，而其他病毒则不会(21–23).
重组RV的一步生长曲线。用重组RV（SBN、SBN-89.6和SBN-NL4-3）感染BSR细胞，如材料和方法，并在指定的时间点重复测定病毒滴度。
重组RVs表达HIV-1 gp160。
为了确保重组病毒表达HIV-1 gp160，用针对RV的抗体通过Western免疫印迹分析重组RV感染细胞的细胞裂解物（图。 左侧)或HIV-1 gp120（图。 赖特). 在感染SBN-89.6或SBN-NL4-3的细胞的裂解液中检测到HIV-1 gp160和gp120的预期大小的两条带（图。 赖特但在模拟感染或SBN感染细胞的细胞裂解液中未观察到（图。,赖特，车道1和2）。用α-RV抗体进行的Western blot检测证实，所有病毒（图。 左侧，泳道2、3和4）感染了靶细胞。
表达HIV-1 gp160的重组RV的Western blot分析。用SBN、SBN-89.6或SBN-NL4-3感染Sup-T1细胞，24小时后进行裂解。蛋白质通过SDS/PAGE分离，并通过Western blotting进行分析。针对gp120的抗体在感染SBN-89.6或SBN-NL4-3的细胞裂解液中检测到预期大小的HIV-1 gp160和gp120两条带(赖特，车道3和4）。在模拟或SBN感染细胞中均未检测到信号(赖特，车道1和2）。用针对RV的多克隆抗体证实重组RV成功感染细胞(左侧，车道2、3和4）。
为了确定是否从RV中功能性表达HIV-1包膜蛋白，我们在人类T细胞系（Sup-T1）的融合试验中分析了重组RV。初步结果证实，野生型RV能够在人类T细胞系中感染和复制。由于野生型RV通过受体介导的内吞作用感染细胞，RV糖蛋白（G）只能在低pH值下引起感染细胞的融合(24). 与野生型RV相比，感染SBN-89.6或SBN-NL4-3 24小时后，在Sup-T1细胞中检测到大的合胞体形成（图。). 这些结果表明，表达的HIV-1包膜蛋白被正确折叠并运输到细胞表面，可以被HIV-1受体和共受体、CD4和CXCR4识别。
通过用SBN、SBN-89.6或SBN-NL4-3使用1的moi感染Sup-T1细胞。感染后24小时，在感染表达HIV-1 gp160的重组RV的细胞培养物中检测到合胞体形成(居中和赖特)，表示功能性HIV-1包膜蛋白的表达。在感染野生型RV的培养物中未检测到细胞融合(左侧).
如果与CD4和CCR5共表达，来自双向HIV-1株（89.6）的包膜蛋白应该能够诱导细胞融合，而NL4-3 gp160应该只能诱导表达CD4和HIV-1辅受体CXCR4的细胞融合。无论使用何种重组RV，表达人CD4的3T3小鼠细胞感染都不会导致细胞融合，而在感染SBN-NL4-3或SBN-89.6后，在表达CD4和CXCR4的3TT细胞中检测到合胞体形成。如预期，仅HIV-1表达89.63T3细胞中表达CD4和CCR5的包膜蛋白导致这些细胞融合（数据未显示）。
表达HIV-1 gp160的RV感染小鼠的抗-gp120抗体反应。
成功的HIV-1疫苗的一个可能要求是能够诱导对HIV-1蛋白gp160的强烈体液反应。为了确定重组RV表达的重组gp160蛋白是否能够诱导抗HIV-1免疫反应，将五组BALB/c小鼠接种在两个后足垫皮下，每组10只6SBN、SBN-89.6或10的焦点形成单元5焦点形成装置SBN-NL4-3。在首次感染RV后11、24和90天给小鼠放血，并用ELISA分析血清。在免疫动物的血清中未检测到对HIV-1包膜的反应，但使用RV糖蛋白而不是HIV-1 gp120作为抗原的ELISA证实了RV感染，并在感染后11天检测到高水平的RV抗体。对表达HIV-1 gp160的病毒载体的几项研究表明，为了诱导可检测到的针对HIV-1包膜蛋白的血清抗体反应，必须进行强化感染或使用重组蛋白进行强化。在RV ELISA中检测到的高抗体滴度表明，用重组RV进行额外感染是没有希望的；因此，我们用10μg含完全弗氏佐剂的重组gp120和gp41增强每组五只小鼠中的三只。亚单位增加12天后，对小鼠进行放血，并通过HIV-1 gp120 ELISA分析免疫反应。结果表明，仅在先前感染SBN-89.6或SBN-NL4-3的小鼠中，HIV-包膜亚单位增强激发了对HIV-1 gp120的强烈免疫反应（图。). 野生型RV（SBN）感染小鼠仅在增强后的最低血清稀释度（1:160）下反应。对HIV-1 gp41特异性的ELISA对所有小鼠血清都是阴性的，即使在用重组HIV-1 gp120/gp41增强后也是如此。
小鼠血清对HIV-1 gp120的ELISA反应性。分别用重组RV（SBN、SBN-89.6或SBN-NL4-3）免疫五只小鼠，并且在首次感染后3个月，每组三只小鼠用重组HIV-1 gp120和gp41（SBN*、SBN-88.6*或SBN-NS4-3*）进行增强。图表上的每个数据点表示每组小鼠在三个独立实验中的平均值。SBN-89.6组中的一只小鼠对升压注射没有反应，也没有出现在图表中。误差条表示标准偏差。
Western blot分析也证实了这些数据（图。). 只有感染SBN-89.6或SBN-NL4-3并随后用重组蛋白增强的小鼠的血清能够与gp120反应，而所有其他血清均未检测到任何HIV-1蛋白。即使进行了gp41亚单位免疫，也没有一份血清具有gp41特异性条带。
小鼠血清抗体对HIV-1抗原反应的Western blot分析。各组（SBN、SBN-89.6或SBN-NL4-3）中一只小鼠的血清，用RV（α-SBN、α-SBN-89.6或α-SBN-NL4-3）免疫，或免疫并注射重组gp120和gp41（α-SPN*、α-SPN-89.6*或α-SPN-NL4-3*），按1:100稀释液进行临床Western blot测试，如材料和方法使用高阳性和弱阳性人类对照血清检测HIV-1蛋白的位置。SC表示血清对照。
重组蛋白增强后的原发性病毒感染诱导了针对HIV-1的中和抗体。
通过使用HIV-1的活性染料染色法测定MT-2细胞中的HIV-1中和抗体（NA）滴度NL4-3型.小鼠血清能够中和组织培养实验室适应的HIV-1NL4-3型用SBN-NL4-3和包膜亚单位增强剂注射重组gp120（IIIB株）后，以1:800的血清稀释度对菌株进行免疫，而用SBN-NL4-3免疫不会诱导可检测到的中和抗体。这些结果在两个独立的实验中得到了证实。接受重组gp120增强的野生型RV（SBN）感染小鼠的血清显示只有1:50的极低中和抗体滴度（表). 这些结果表明，在用表达HIV-1 gp160的重组RV启动后，用重组gp120进行增强注射，对于激发高滴度的中和抗体至关重要。
表1
| 重组HIV-1 gp120/gp41增强注射免疫 | 艾滋病病毒1型NL4-3型中和抗体滴度
|
|---|
| 实验1 | 实验2 |
|---|
| SBN-NL4-3型 | <1∶50 | 1∶50 |
| SBN-NL4-3型* | 1∶800 | 1∶800 |
| SBN公司* | <1∶50 | <1∶50 |
讨论
本文提供的数据表明，可以产生表达全长HIV-1包膜蛋白的重组RV。该外源基因通过复制能力强的RV稳定表达，并在小鼠中诱导了对HIV-1的强烈体液反应NL4-3型用重组RV感染后的包膜蛋白和HIV-1 gp120蛋白的单一随后增强。证明了小鼠血清中和HIV-1株NL4-3的能力。
阻断HIV-1感染的一个要求是抗体必须与病毒表面糖蛋白结合。不幸的是，HIV-1病毒相关三聚体gp41/gp120似乎是免疫原性较低的糖蛋白形式。此外，有证据表明，在天然HIV-1感染中，体液反应主要针对病毒碎片，即未处理的HIV包膜蛋白，而不是针对病毒本身(25). 对未暴露于成熟HIV-1 gp41/gp120上的表位的初级强烈反应可能会阻碍后期对成熟HIV-1包膜蛋白中表位的反应，后者是中和抗体的靶点。这可能解释了为什么细胞致病性病毒载体，如痘苗或禽痘，只能诱导弱中和抗体(26). 然而，恒河猴接种SIV活疫苗的发现在nef（奈夫）对活的致病性SIV的攻击完全保护，表明重组病毒是抗HIV-1活疫苗的理想候选(27). 对于基于RV的载体，很可能会诱导HIV-1包膜蛋白的成熟低聚物，这可能是诱导强烈免疫反应所必需的(28–30). 错误折叠的蛋白质在细胞内被保留和降解(31)并且，在基于RV的载体的情况下，与诱导细胞病变的载体相反，它们不会被释放。RV感染大多数哺乳动物细胞，但在某些细胞系中仅引起非常轻微的细胞生成作用，如BHK-21 S13和鸡胚成纤维细胞(32,33). 一个安全问题可能是，表达HIV-1 gp160的RV载体将导致人类T细胞融合，如图所示。但这一过程甚至可能有助于暴露免疫系统通常看不到的HIV-1 gp160表位。
与其他表达HIV-1 gp160的病毒载体一样，我们在用重组RV初始启动后不能检测到针对gp120的体液反应，但在用重组HIV-1 gp120和gp41增强后检测到强烈的反应。临床Western blot或HIV-1 gp41 ELISA对HIV-1 gp41没有反应，可能是因为这些初始研究中使用的重组gp41降解。
SBN-NL4-3引物小鼠的血清能够中和HIV-1NL4-3型，进一步的实验将分析由RV载体表达的HIV-1 gp160是否诱导针对各种HIV-1毒株之间更保守的表位的抗体，从而能够诱导针对不同HIV-1菌株的交叉中和。交叉中和大量不同HIV-1毒株的不同多克隆血清通常针对CD4结合域(34). 进一步的实验将分析RV载体诱导的抗体是否也是如此。我们用野生型RV免疫并用重组HIV-1 gp120增强的小鼠血清检测到针对HIV-1的低中和抗体反应（1:50）。原因尚不清楚，但最近的一份报告表明，RV糖蛋白和HIV-1 gp120之间可能存在一些低水平的交叉反应抗体(35).
除了增加重组蛋白外，感染来自相同或不同HIV-1毒株的表达gp160的重组病毒可能会诱导更强的反应，尤其是对构象依赖性表位的反应。先前研究表明，腺病毒通过表达HIV-1包膜蛋白的异型腺病毒促进感染，显著增强了对HIV-1 gp160的体液反应(36). 我们目前正在构建表达HIV-1 gp160的重组RV，其中RV糖蛋白（G）被VSV G（血清型印第安纳州或新泽西州）取代。由于弹状病毒在其病毒上只有一个单一的表面蛋白，因此嵌合RV/VSV病毒不应被针对RV G的体液反应所中和，从而允许第二次生产性感染。与使用重组HIV-1 gp120相比，使用重组嵌合RV/VSV在感染细胞表面显示正确折叠的HIV-1包膜蛋白具有优势。此外，RV核蛋白的重复表达，之前已证明其为外源性超抗原(37,38)，可能有助于增强对HIV-1包膜的免疫反应。RV N蛋白是一种极好的免疫原，与猫免疫缺陷病毒表面糖蛋白结合使用时，可以增强对猫免疫缺陷病病毒的免疫反应(39).
本研究的目的是检测基于RV的载体是否能够诱导针对HIV-1 gp160的免疫反应。我们使用了一种基于疫苗株的RV载体，当口服或肌肉注射时，该载体对多种动物无致病性。目前，减毒活疫苗未用于人类免疫，但初步数据表明，表达HIV-1包膜蛋白的重组RV比载体本身的减毒效果更好。除RV-SAG等低毒力菌株的RV糖蛋白外2，可能导致基于RV的载体对人类安全使用。
本报告描述了表达HIV-1基因的非片段负链RNA病毒作为HIV-1疫苗的用途。涉及弹状病毒家族另一成员即VSV的研究表明，这些载体能够诱导对流感病毒的保护性免疫反应(40)，但对于先前构建的表达HIV-1 gp160的VSV，同样的方法是否有效尚待证明(22). 值得注意的是，表达流感病毒血凝素和核蛋白基因的重组复制缺陷痘苗病毒可保护小鼠免受流感攻击(41)，但表达HIV-1 gp160的重组痘苗病毒未能保护黑猩猩对抗HIV-1(11).
我们的结果表明，重组RV是B细胞启动的良好载体。RV也能诱导强烈的CTL反应(42,43). 初步数据表明，表达HIV-1包膜蛋白的重组RV诱导了针对HIV-1的特异性CTL反应NL4-3型进一步的实验将分析是否可能对表达的外源蛋白（如HIV-1 gp160或Gag）产生类似的B细胞和CTL反应，并将分析表达多种HIV-1抗原的重组RV是否是更有效的活病毒载体。
致谢
我们感谢D.C.Montefiori博士提供了一份出色的HIV/SIV中和方案，并对HIV中和试验提出了有益的建议；S.Finke博士和K.-K.Conzelmann博士提供T7-RNA聚合酶表达的BSR细胞系；J.Kulkosky博士、M.B.Bouhamdan博士和M.Mukhtar博士提供HIV-1NL4-3型和HIV-189.6; G.Dornadula博士和F.Shaheen博士首次协助HIV-1滴定；以及B.Gordon女士和R.Victor女士的出色秘书协助。H.D.F.和J.P.M.获得了托马斯·杰斐逊大学研究生院校友奖学金的部分支持。α-gp120抗体是通过美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所艾滋病司艾滋病研究和参考试剂项目（ARRRP）获得的。这项研究得到了美国国立卫生研究院R211AI44340拨款、托马斯·杰斐逊大学对M.J.S.的内部资金和人类病毒学中心的支持。
缩写
| CTL公司 | 细胞毒性T淋巴细胞 |
| SIV公司 | 猴免疫缺陷病毒 |
| RV汽车 | 狂犬病病毒 |
| 莫伊 | 感染的多重性 |
| VSV公司 | 水疱性口炎病毒 |
脚注
印刷前在网上发表的文章：Proc。国家。阿卡德。科学。美国，10.1073/pnas.050589197。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.050589197
工具书类
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