分裂酵母中微管解聚可驱动染色体极性运动

MT聚合后，分离的动粒返回极点并成为双向的

被捕时数据采集3将细胞恢复到32°C，其MT在几分钟内聚合；然后SPB分离，细胞进行有丝分裂(平冈等, 1984;神户等, 1990). 为了研究纺锤形线粒体“恢复”“丢失的”动粒的过程，我们通过免疫染色分析了这些细胞在有丝分裂过程中的进展(图1). 动粒丢失率迅速下降（τ_1/2～10分钟），从最初的81%(图1A和B). 伴随着动粒-SPB的重新结合，位于SPB之间的动粒百分比暂时增加(图1C和E). 在移到32°C大约6分钟后，细胞开始退出有丝分裂（τ_1/2～19分钟），根据染色体密集聚集的细胞百分比下降判断(图1D). 到40分钟时，80%以上的细胞已经退出有丝分裂，并成功回收分离的动粒。因此，MT聚合开始后，丢失的动粒首先被拉到分离的极点(图1E（b–d）); 然后它们是双向的，然后进入后期(图1E（e–g）)，行为与正常脊椎动物有丝分裂中发现的行为惊人相似。

通过观察带有GFP标记的中心体和着丝粒的活细胞中2号染色体的两极和动粒，验证了这一结论（见材料和方法）。在限制温度下，分离的SPB和动粒经历了看似随机的运动(补充视频1). 动粒经常一分为二，这表明姐妹染色单体的短暂分离，可能是由于热运动和染色质粘弹性。在转换到允许温度后，SPB在2.9±0.3分钟内分离(N个=41). 约7.0±1.7分钟后(N个=30），标记的动粒被拉向其中一个极点(图1F). 双定向（定义为动粒第一次大致位于SPB之间的中间位置）发生6.9±0.7 min(N个=17）动粒到达SPB后。在到达极点之前，动粒经常从其方向旋转，使其现在面向相反的极点。到换班后30分钟，约2/3的细胞出现后期反应。因此，实时成像和免疫荧光的结果完全一致。它们共同证明，失去的动粒可以成功地向两极和双向移动。据推测，在正常有丝分裂过程中也会发生类似的运动，尽管距离更短。

动粒-MT附着的稳定性和随后运动的过程性提高了动粒检索的效率

然后我们询问了这个动粒检索过程的有效性。随着分离的动粒和两极之间距离的增加，回收时间略有增加(补充图2A，红色曲线）；在与裂变酵母细胞核直径相当的距离上，回收的动粒较少(补充图2B). 然而，约80%的“丢失”动粒在15分钟内被拉到极点，只要它们分散在极点<1.6μm处。因此，MT捕获和动粒检索在这些距离上是有效的。

将SPB与可回收的动粒连接起来的MT很短，无论是通过抗管蛋白的免疫荧光还是在含有微管蛋白-GFP的活细胞中，都很难对其进行可视化（补充）。为了避免这些困难并获得更多关于动粒检索动力学的信息，我们收集了两极和动粒的三维（3D）坐标。使用自定义计算机程序分析所得数据（见材料和方法）。例如，图2A以2D图像的形式显示相对于极点（绿色圆圈）的连续动粒位置（红色X与线相连），显示在包含这三个对象的平面中。在寒冷（红线）时，动粒运动呈现随机性(补充视频2); 其位置在平均值附近波动，标准偏差（s.d.）为0.318μm。移到32°C大约6分钟后，动粒的运动朝向其中一个极点(图2A，蓝线）。拟合到这部分轨迹的直线的标准差为0.077μm，明显小于根据相同数据拟合到连续随机运动假设（0.544μm）而确定的标准差；这一阶段的运动基本上是线性的。

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图2

初始染色体与MT相互作用的动力学和结构。(A、 B类)在两个对照细胞中，温度变化到32°C之前（红线）和之后（蓝线）的动粒运动轨迹。这些图像显示了包含动粒（红色X）和两个纺锤极的平面内的运动（参见材料和方法）。蓝色箭头指向将这些动粒带到极点的最后运动的开始。紫色箭头表示暂停。动粒和极点的最终位置分别显示为红色和绿色圆圈。网格方格为0.5μm。(C类)层析照片上的切片，由数据采集3细胞在纺锤体形成的早期阶段被冷冻。(D类–F类)三个主轴的重建（转移到32°C后冻结3-7分钟），其中一个如（C）所示。从不同极点成核的MT为绿色和红色，纺锤体极点为黄色，核膜为灰色。负号以橙色圆点表示，加号以紫色圆点表示；位于截面之间的端部没有标记。有时，在重建路段以外还有地铁；它们最远端（正端）用绿点标记。棒材：0.1μm。

我们使用这种数据格式来分析动粒-MT附着的持续性和动粒P移动的过程性。如果动粒经常捕获并丢失从相反两极生长的MT，人们会认为动粒的轨迹由向不同两极的分段运动组成。然而，所有持续运动都只指向其中一个极点(图2B). 它们以0.6±0.1μm/min的平均速率发生（范围0.2–2.8μm/min，N个=8），他们很有进取心。动粒连续移动1.0±0.1μm(N个=12），最长不间断运行1.5μm。暂停(图2A和B; 紫色箭头）持续了124±30秒，这可能是由于运动停滞或动粒-MT分离，然后重新捕获造成的。

pombe链球菌的P运动通过起源于极的MT发生，并由动粒依赖机制驱动

我们测量了动粒最终轨迹方向与纺锤轴之间的角度。其范围很广（82±25°；M±s.d。，N个=28），表明在早中期，SPB在广泛的方向上使MT成核，其宽度足以覆盖细胞核中的大多数极近端区域。这一观点不同于已发表的对更成熟的中期纺锤体的描述，后者由一小束MT组成(丁等, 1993). 因此，我们使用电子断层扫描（ET）来检查成形主轴中的MT分布。早中期复制的SPB进入核膜的窗孔(丁等, 1997;乌扎瓦等, 2004). 随着纺锤的生长数据采集3从冷区恢复的细胞，SPB最初几乎彼此平行(图2C和D). 他们的分离可能是由少数几个斜向SPB核表面的重叠MT驱动的(补充视频3). 其他MT以不同的方向投射到核质中，这将最大限度地增加它们遇到动粒的机会(仙人掌等, 2003). 随着纺锤体的成熟和长度的增加，两极相互对峙，重叠的MT数量增加。然而，仍有许多不同长度的MT向不同方向生长，令人想起脊椎动物纺锤(图2E;补充视频4). 我们没有发现来自两极的MT指向核的同一个极远区域的例子，正如人们在亚甲基四氢叶酸染色体连接期间所预期的那样(马亚托等, 2004). 这与丢失的动粒最初只附着在一个极点上的说法一致（在单倍体或合胞体构型中）。然而，由于EM中酵母动粒的对比不足，无法确定确切的附着模式。虽然靠近MTs+末端的一些区域具有结构特征，使其成为动粒候选区域，但这些特征难以量化(补充图3A). 所有这些区域都位于高度张开的MT+末端，这意味着动粒与聚合物末端相互作用，而不是与MT的侧表面相互作用。

在ET重建的所有主轴中(N个=24），每个MT减去末端位于SPB附近（平均距离86±5 nm，N个=70) (补充图3B). 我们没有发现像在某些系统中发生的那样，在动粒启动MT的证据(科德贾科夫等, 2003). 至少91%的负端(N个=483）被大致锥形结构覆盖(补充图3C)它类似于芽殖酵母和线虫纺锤体中的γ-微管蛋白环复合体(奥图尔等, 1999,2003). 这些结果表明，负MT端与SPB的连接稳定，这与该端MT动力学的明显缺乏一致(马尔拉瓦拉布等, 1999). 因此，极相关的驱动蛋白不太可能在S.pombe公司通过破坏MT负端的稳定性，导致P移动(罗杰斯等, 2004). 我们得出结论，裂变酵母中的动粒P运动是由MT依赖、动粒相关、负端定向马达和/或MT正端解聚产生的力引起的。

正常动粒回收不需要动力蛋白或Pkl1p

我们用这个实验系统来检验不同负端定向电机的贡献。缺乏Dhc1p、Pkl1p或Klpp基因的菌株数据采集3后台）已按上述方式同步。通过固定细胞的免疫荧光，所有菌株的阻滞总参数相似，表明这些缺失均不影响细胞周期阻滞或动粒散射(图1A). 在动力蛋白缺失菌株中，动粒恢复和双向定向的动力学与对照菌株没有统计学差异(图1B-D). 活细胞成像也显示该菌株的动粒恢复正常(N个=23），尽管平均检索时间略长于对照细胞(补充图4A).

Pkl1p是一个S.pombe公司驱动蛋白14家族的运动；通常沿着主轴发现，在SPB富集(皮杜等, 1996). 在有丝分裂进展的初始阶段pkl1系列Δ培养（<5min），动粒恢复、双向定向和有丝分裂退出的动力学与对照菌株没有区别(图1B-D). 然而，在pkl1系列Δ早中期和中期细胞比例过早下降(图1C)这导致后期（5-15分钟；图1B). 有丝分裂退出的轻微进展表明出现了早熟的后期发作(图1D); 显然动粒在pkl1系列Δ细胞，但有丝分裂后期存在缺陷（Grishchuk和McIntosh，准备中的手稿）。

我们已经追踪了5个动粒和极点的三维坐标pkl1系列Δ和6dhc1型Δ单元。极性定向动粒运动的轨迹与对照细胞的轨迹无显著差异(补充图4B和C). 在这些基因型中，动粒向极点移动的开始及其速度的差异几乎与基因型之间的差异一样大(图3A). 我们的结论是，在没有动力蛋白或Pkl1p的情况下，可以发生正常的P运动。

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图3

活细胞染色体检索过程中的运动。(A类,B类)移到32°C后动粒到极点距离随时间变化的轨迹示例（另请参见补充图6). (C类)最后动粒方法斜率的比较千帕2Δ电池1(补充视频5),千帕2Δdhc1型Δ电池(补充视频12)，一个控制单元和4个pkl1系列Δ千帕2Δdhc1型Δ单元。

由于动粒运动动力学的异质性增加，Klp2的缺失导致动粒回收延迟

S.pombe公司Klpip是kinesin-14家族的另一个成员；它是已知唯一定位于有丝分裂动粒的负端定向运动(特罗塞尔等, 2001).Nda3公司缺乏Klpp的细胞失去动粒的百分比有可复制的增加，这表明Klpp有助于正常的动粒-极附着(图1A). 在这些细胞恢复到32°C后，它们的动粒与SPB重新建立联系的速度明显慢于其他三种基因型的细胞（τ_1/220分钟；图1B). 前中期和中期的动粒积累也有延迟(图1C)和减慢的有丝分裂出口（τ_1/235分钟；图1D)，表明有丝分裂检查点运行正常。

通过跟踪活的有丝分裂klp2型Δ电池(N个=30），我们确定了导致动粒恢复较慢的两个因素。第一，千帕2Δ细胞比对照细胞获得更少的远距离动粒（距离极点1.2μm）(补充图2B). 其次，从较短距离恢复动粒所需的平均时间增加了：11.8±2.9 min千帕2Δ细胞与对照组6.8±1.1分钟(补充图4A). 由于Klp2马达定位于动粒，它可能直接促进P运动。人们会认为，动粒恢复的平均速度较慢是由于动粒运动较慢。然而，动粒运动的直接可视化显示情况并非如此：千帕2Δ动粒得到有效恢复，并以我们观察到的最高速度移动（～3μm/min；补充视频5). 其他动粒的运动被大大延迟，尽管它们最初靠近两极(补充视频6). 因此，在没有Klpp的情况下，动粒细胞仍然可以快速移动，但恢复速度较慢的可能性增加。自从千帕2⁺基因从这些细胞中被删除(特罗塞尔等, 2001)，这种行为不能归因于Klpp水平的变化。因此，我们探讨了其他可能性。

Klpp通过刺激动粒纤维缩短和/或阻止其伸长来促进动粒运动的过程性

分析导致运动异质性的机制千帕2Δ细胞，我们追踪了动粒-极距离随时间的变化。一些记录显示了距离不变甚至增加的时期（例如，单元格2-5英寸图3B). 这表明klp2型Δ动粒在MT附着中有缺陷并随机移动，直到出现新的捕获，或者它们的P运动频繁停滞甚至反转。为了区分这些可能性，我们研究了2D动粒轨迹。例如，细胞3中动粒的检索路径可以分为两段(图4A). 最初，轨迹类似于一个圆心位于右极点的圆弧。该模型可通过符合该假设的数据的标准差（0.141μm）进行评估，而基于随机运动的模型的标准差为0.410。如果动粒的运动受到靠近核膜的限制，这种运动可能会在一定程度上发生。或者，动粒可能连接到一个或多个来自右极点的稳定MT。路径的后面部分很好地拟合了一条直接指向该极点的直线（s.d.0.128μm，对于随机拟合0.422，s.d.），与后一个模型一致。然而，这些运动并不是循序渐进的；动粒前后移动，最后到达极点(补充视频7). 这种向后运动可能是由于染色质在其动粒与相关MT分离后反冲造成的，但明显缺乏随机动粒运动，这可能是分离染色体的结果，这表明在提取过程中千帕2Δ动粒与动粒MT保持稳定的附着。通过对来自nda3 klp2Δ细胞有丝分裂进程延迟。所有这些都包含1–2个MT线束，这些线束从主轴轴线分叉，每个线束由2–3个MT（a蓬贝动粒结合2-4MT(丁等, 1993;图4B和C;补充视频8). 虽然在这些断层图中无法定位单个动粒，但这些束中MT加端的位置（通过ET识别）与动粒在提取过程中的位置相似千帕2Δ细胞，通过实时成像观察。总之，这些结果表明千帕2Δ动粒在移到32°C后的早期捕获MT，但它们在P运动中暂停，并经常离开极点。

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图4

Klpp有助于动粒检索。(A类)细胞3动粒恢复的二维轨迹。框架1–50的最佳拟合圆弧（洋红色）(补充视频7); 第51帧至第96帧的最佳线性拟合（蓝色）。层析切片(B类)和3D模型(C类)第页，共页nda3klp2Δ细胞在前中期延迟（移到32°C后冻结15分钟）。（B）中的箭头指向从右极生长的两个MT束中的一个MT。棒：100纳米。(D类)用于控制的每个主轴极的平均MT数数据采集3电池（4极），nda3dhc1型Δ (10),nda3pkl1Δ（6）和延迟nda3klp2Δ电池（6）。(E类)MT加端的ET切片。前五幅图像是从一个控件中采集的数据采集3细胞；其余的都是六点的klp2型Δ单元。正常细胞和突变细胞的正末端的外观都有很大的差异，这使得很难量化差异。通常，正MT端张开（上排），但klp2型Δ细胞通常包含闭塞物（红色箭头）。中间一行的图像可能代表导致聚合行为改变的“疤痕”MT的中间体；最下面的一行显示了一种可能的途径，可以在MT异常时拯救快速缩短，然后再进行MT聚合。条形：100 nm。(F类)MT流明内显示较暗“条”的MT加端的百分比。检查的末端数量：对照68，千帕2Δ 239. (G公司)从nda3 klp2Δdhc1型Δ电池处于后期A.Bar：2μm。

这些细胞无法维持P运动，并且其染色体倾向于转向远离极点的运动，这似乎是其染色体检索延迟的主要原因。例如，细胞4中的动粒(图3B)最初靠近未分离的磁极。在移到32°C后，该动粒立即开始以0.5μm/min的速度离开极点，然后再次移动并双向移动(补充视频9). 在单元格5中(图3B)动粒开始向极点移动，然后突然改变方向并离开(补充视频10). 延迟性心肌病纺锤体的超微结构分析千帕2Δ细胞显示，相对于野生型，每极生长的MT数量略有增加(图4D). 这种差异可能是由于在有丝分裂中花费的时间较长，或者这些细胞中的MT可能表现出MT动力学的改变(Troxell公司等, 2001). 对该菌株MT末端的仔细检查表明，它们的原丝倾向于比其他菌株的少张开(图4E). 许多MTs显示闭塞，例如，管腔上的暗“条状物”(图4F). 这些结构可能代表蛋白质物质，可能是困在不断增长的MT中的原丝片段(图4E，灰色箭头）。这种不规则性可能在正常MT动力学过程中出现，形成“疤痕”MT，其解聚受到部分阻碍。当解聚遇到这种异常时，可能需要Klpip来缩短MT；在没有它的情况下，解聚拯救和随后的动粒MT伸长可能更常见。

实时成像

使用cen2-GFP构造(补充表1)由A Yamamoto提供(山本和平冈，2003年). 免疫定位cen2-GFP动粒组分Mis12-HA的标记和总是共存或紧邻（例如，参见补充图1g). 用Pcp1p-GFP可视化主轴极(弗洛里等, 2002). 将显微镜载物台预冷至14°C，在浸油×100 NeoFluar物镜和浸油冷凝器周围包裹一个定制的金属管水套。将水套管道从14°C切换至32°C浴槽后，1–2分钟内发生温度变化。通过变形金刚（Universal Imaging）控制的Photometrics Cascade 650 CCD相机（Roper Scientific）每15秒采集7–12个平面（步长0.25μm，曝光150 ms）的叠加图像。视频是手动对齐的平均XY投影，以最小化温度突变带来的图像漂移。在除视频1外的所有视频中，在第三帧之后，温度都变为32°C。自S.pombe公司核/纺锤经常围绕随机定向的轴旋转，这些2D投影中物体之间视距离的变化不一定反映分离的实际变化，需要进行额外的图像处理以获得图像中物体之间的准确距离。

图像分析

所有计算机程序都是使用MatLab 6.5定制编写的。简单地说，已标记动粒的XYZ坐标和每个时间点的两个极点的XYZ坐标（通过选择每个堆栈中最亮信号的视中心手动收集）被转换，因此其中一个极点始终位于笛卡尔坐标系的中心。The direction of theX（X）-选择轴线穿过第二个极；这个Y（Y）-轴位于包含所有三个对象的平面上。生成的图像显示真实的三维距离。该程序还消除了由阶段漂移或主轴旋转引起的移动。在轨迹中，这些点是四个连续点的移动平均值。

ET在Boulder实验室进行，用于细胞的3D EM，并得到RR000592 to JRM的支持。M Morphew制备EM样品，并获取细胞的TEM图像数据采集3电池温度为18°C；E O’Toole和该实验室的其他成员帮助进行了数据采集和重建。光学显微镜的温度控制由V Sarbash和F Ataullakhanov建立。菌株和试剂由I Hagan博士、P Silver博士、K Gull博士、Y Hiraoka博士、M Yanagida博士和T Davis博士提供。我们感谢I Spiridonov提供的技术援助，J Becerril帮助我们收集3D坐标，感谢M Molodtsov和F Ataullakhanov提供的用于分析动粒轨迹的软件，感谢M Winey提供的有益讨论。这项工作得到了JRM的GM33787的部分支持。