跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
生物工程在线。2003; 2: 13.
2003年5月17日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1475-925X-2-13
PMCID公司：项目经理161784
PMID：12801419

ScanImage：操作激光扫描显微镜的灵活软件

托马斯·波洛格鲁托,1,2 贝尔纳多·萨巴蒂尼,1,三和卡罗·斯弗波达通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

激光扫描显微镜是分析生物标本结构和功能的有力工具。虽然有许多商用激光扫描显微镜，但一些更有趣和更具挑战性的应用需要定制设计。定制设计的一个主要障碍是难以构建定制数据采集硬件和编写运行激光扫描显微镜所需的复杂软件。

结果

我们描述了一种简单的基于软件的方法来操作激光扫描显微镜，而无需定制数据采集硬件。激光扫描的数据采集和控制通过标准数据采集板实现。信号集成和图像处理的全部负担都放在计算机的CPU上。我们量化了我们的数据采集和信号调节算法在各种条件下的有效性。我们在开源软件包中实现我们的方法(扫描图像)并描述其功能。

结论

我们现在扫描图像，运行灵活激光扫描显微镜的软件，可轻松进行自定义设计。

背景

激光扫描显微镜（LSM）包括生物学中一些最重要的成像设备。例如，共焦激光扫描显微镜（CLSM）是培养和固定组织制备中高分辨率荧光显微镜的首选工具[1-三]. 双光子激发激光扫描显微镜（2PLSM）是散射介质中荧光显微镜的理想选择，例如活体皮肤和脑组织[4,5].

从历史上看，激光扫描显微镜的新发展和应用主要受到新硬件可用性的限制。合适的激光光源和运行在台式计算机上的强大数据采集系统的开发使CLSM实现[三]. 在2PLSM的情况下，在红色和近红外光谱范围内工作的锁模脉冲光源的开发[6]使之实用[5].

有多条商用CLSM和2PLSM线路可用。制造商通常会提供一个主要型号，并允许客户在不同版本和选项之间进行选择。基本上，在光学和软件方面，提供了单一通用设计。然而，令人兴奋的应用需要专门的设计。这些应用通常包括一些最有希望的实验发展。目前，CLSM和2PLSM的大多数硬件组件（激光器、光学器件、扫描镜、探测器和计算机）都很成熟，很容易获得。使用定制设计开发尖端应用程序通常受到控制激光扫描显微镜的合适软件可用性的限制。

在我们的实验室中，我们编写了灵活的软件来控制LSM(扫描图像). 在LSM中，当聚焦激光束扫描样品时，检测到信号（通常为荧光）。从许多微小的相邻区域（称为像素）内发出的信号[三,7]在短时间间隔（像素时间，T型第页). 集成信号被转换为数字像素值，从扫描区域收集所有像素定义图像。图像中像素的位置由采集时激光器的位置决定。因此，激光束位置和信号采集的同步对于成像至关重要。

为了精确地进行时间扫描和采集，并在信噪比、在线平均和实时图像刷新方面实现高性能，许多商用激光扫描显微镜（例如，奥林巴斯Fluoview™、奥林巴斯美国公司、纽约州梅尔维尔；Bio-Rad Radiance 2100™、加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Laboratories）使用专用信号调节电子设备和数据采集板。商业系统适用于许多应用，也已针对特定的实验需求进行了定制[4,8-10]. 然而，完整的定制设计通常更具优势和成本效益[11-13]. 定制设计的两个主要障碍是激光扫描显微镜所需的专用软件和硬件。

这里我们展示了一个名为扫描图像用于收集高水平运行的激光扫描图像，无需复杂的定制硬件[14,15]. 其关键思想是使用快速数据采集板和基于CPU的数字计算来执行DSP板和模拟积分器在典型商业系统中完成的大部分任务。因此扫描图像简化了定制显微镜的设计和构造。另一个优点是扫描图像是用MATLAB（6.1版或更高版本；MathWorks Inc.，Natick，MA）编写的，因此已经完全集成到高级图像分析环境中。

结果和讨论

ScanImage的说明

扫描图像控制激光扫描显微镜（图​（图1A）。1安培). 它完全用MATLAB编写，使用标准多功能板（例如德克萨斯州奥斯汀的National Instruments）进行数据采集和扫描控制。该软件生成模拟电压波形以驱动扫描镜，从光电倍增管（PMT）获取原始数据，并处理这些信号以产生图像。扫描图像同时控制三个输入通道（每个12位），编写的软件易于扩展到数据采集（DAQ）板支持的最大通道数，并且CPU可以有效处理。计算机总线速度决定了在输入缓冲区发生溢出之前可以采集的样本数，而CPU速度和总线速度结合起来决定了数据处理速度，并最终决定了屏幕上图像的刷新速度。扫描镜运动或数据采集几乎不需要定制数据采集硬件。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-1.jpg

接线图和性能基准扫描图像A）显微镜运行的典型接线图扫描图像扫描、数据采集和激光快门由单个数据采集板（PCI 6110，National Instruments）完成。舞台和Z聚焦电机通过Sutter三轴电机控制器（Sutter MP285）控制，该控制器通过串行通信（COM）端口编程。B）的性能扫描图像。我们计算了实时分数作为平均时间扫描图像处理和显示采集的数据（即条带；见图​图2）2)归一化为该部分数据的采集时间。在每个配置中采集的20帧中平均值。实时分数是使用具有512 MB RAM的800 MHz Pentium III计算机计算的。实时分数高于1表示软件能够实时运行（即。扫描图像在完全获取下一部分数据之前，已完成处理和显示所有先前收集的数据）。对于小于1的实时分数，显示滞后于采集，但没有数据丢失。在多个通道上采集每帧16行数据时，实时性较低，这表明我们正在接近图形更新的基本速度限制。

生物激光扫描显微镜中的典型像素时间>2μs（像素时间取决于每行像素和每行时间；见图​图22有关图像构建算法的更多信息）。我们已经进行了基准测试扫描图像同时采集三个通道，像素时间约为3μs（图​（图1B）。1B年). 在这些苛刻的条件下，扫描图像更新并保存图像，从实际获得图像的时间起延迟最小（图​（图1B）。1B年). 图像的实际大小（以微米为单位）取决于显微镜光学和扫描镜的角度。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-2.jpg

图像构造和信号处理扫描图像A）图像创建算法示意图扫描图像像素是通过对像素时间T上的PMT电压求和来构造的第页。为了实现快速（即实时）刷新率，我们将图像采集分解为一组连续采集和显示的条纹。条纹被连接起来形成整个图像。B）有关图像构建的更多详细信息，请参见扫描图像.a）后视镜位置信号由扫描图像（蓝色轨迹）和两条采集线的实际镜像位置（红色轨迹）（PMT电压以灰色显示）。b）采集参数的定义。采集的PMT信号的反激（紫色）和线延迟（红色）区域从最终图像数据中丢弃，这只保留PMT电压的填充分数（蓝色）用于图像构建。由于扫描镜具有惯性，因此其实际位置滞后于设置位置约7%的扫描周期，并通过尖点延迟（绿色）进行校正。c）扫描图像保留扫描线性部分期间获取的数据（蓝色），并丢弃干预数据（红色）。d）将样本相加，形成最终图像中的像素。

我们选择MATLAB作为我们的开发环境，因为它具有强大的数值操作能力和数据采集（DAQ）引擎。DAQ引擎直接与采集板通信，并提供了一个灵活的面向对象环境，在该环境中可以构建DAQ软件。在许多科学和工程界，MATLAB已经成为桌面数字计算的主导语言[16]. 对于MATLAB中的新手程序员来说，集成定制的分析函数和合并附加软件更容易处理，从而简化了许多实验设计过程。

ScanImage中的数据采集

来自探测器（通常是PMT）的信号是一种电流，需要在采集之前转换为电压。这种转换可以用标准放大器完成[17]（参见加利福尼亚州森尼维尔斯坦福研究系统公司的示例）配备了低通滤波器。滤波器的滚动频率必须<0.5（f）秒，其中（f）秒是对检测器信号进行采样的速率。在扫描图像我们在信号采样有限导致的信噪比下降和较高采样率下CPU上增加的计算负载之间进行折衷。

我们使用当前的计算机硬件进行操作扫描图像具有（f）秒=1.25兆赫。该采样频率允许在短至3μs的像素时间内进行近乎理想的成像（就表观量子效率和像素间的漏光而言，如下所述）。适当的滚降频率应为~300–500 kHz。未来，更快的计算机架构将允许更快的采样和数字处理，从而缩短像素时间。采样数据流式传输到内存。图像构建算法概述扫描图像如图所示​图2A2安培.

采样数据在像素时间内实时汇总。一旦收集到数据，就将其与扫描镜的输出信号进行比较。扫描镜的位置决定了像素在最终图像中的位置。后视镜驱动器电子元件（参见马萨诸塞州剑桥市剑桥科技公司的示例）和DAQ板向驱动器输出的命令电压决定了后视镜的位置。在镜子运动循环期间，仅当镜子以恒定速度移动时（即线性电压与时间范围；见图​图2B）。2B型). 当后视镜转动或飞回其起始位置（回飞）时采集的数据被删除（图​（图2B；2B型; 详细信息请参见图标题）。

图像形成的定时要求镜像扫描表格和数据采集引擎同步。这是通过使用DAQ板生成的TTL触发器（即在软件面板的控制下）触发数据采集和数据输出来实现的。这种触发机制还允许扫描图像由来自其他应用程序或硬件设备的TTL外部触发。适当的采样率和输出率是硬编码的扫描图像而许多其他采集参数可以根据特定应用的需求进行选择。

ScanImage采集的图像质量

我们评估了信号调节方法的性能（图​（图22&三). 我们将模拟PMT信号积分的可变性与在固定采样率下计算的信号和的可变性进行了比较，如扫描图像（见图​图2B2B型详细信息）。在模拟中，PMT电压被建模为平均光子速率为0.5光子/μs的泊松过程。每个单光子脉冲均为高斯脉冲，单位振幅和2.35μs全宽-半高值（FWHM）[18]. 每个模拟脉冲都是在500 MHz下构建的。通过对泊松分布脉冲求和并将其划分为2000个像素间隔（持续时间10μs）来创建20 ms波形。每一个间隔都构成了下文所述变异性分析中的一项试验。试验在200 kHz至5 MHz的频率下以100 kHz的步长进行采样。以不同速率取样的典型试验如插图所示​图3A3A级.

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-3.jpg

中的图像质量扫描图像A）作为采样率函数的表观量子效率扫描图像对于具有2.35μs半宽和单位振幅的单光子脉冲。红色轨迹表示表观量子效率(保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif)通过数字积分确定的信号（见插图）。黑色痕迹显示保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif以200 kHz至5 MHz的频率采样。保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif当采样率接近1 MHz时，接近1。蓝色点是由恒定光源照明的实际PMT的归一化表观量子效率（数据预过滤为330 kHz）。扫描图像使用1.25 MHz的采样率（箭头），产生几乎理想的信噪比保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif≈ 1. 该分析仅适用于持续时间至少为2.35μs的脉冲。插图：20μs脉冲间隔由以不同速率采样的2.35μs事件组成。B）像素间隔（条）和泊松拟合（线）中事件的直方图。C）相邻像素的光子泄漏模型。以宽度为2至10μs的像素间隔随机放置一个半高宽为2.5μs的单光子脉冲。每个像素间隔的试验次数为10000次。通过率等于100*（1-IPP/IEP），其中IEP是整个脉冲的积分，IPP是像素间隔内脉冲区域的积分。所示为相对于脉冲宽度（像素间隔/脉冲宽度）归一化的每个像素时间的泄放百分比的平均值。误差线（SEM）小于标记点，因此被省略。

信噪比如何随采样频率变化？信号质量的一个有用度量是方差系数（CV年). 个人简历年是标准偏差的比率（σ年)中庸之道(保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i2.gif)在像素间隔上求和的信号(年). 个人简历年与表观量子效率有关(保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif)采集系统和每个像素间隔的平均脉冲数(保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i3.gif)由方程式1:

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i4.gif

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif除了光源固有的散粒噪声和可变脉冲幅度分布产生的乘性噪声外，与信号调节引入的噪声成反比[19]. 对于均匀脉冲幅度的最佳采样，保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif将为1，因为保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i5.gif=保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i2.gif=保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i3.gif（请参见方程式1); 这可以通过信号的直接积分来实现（图​（图3A，3A级，红线）。因此，我们可以解释保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif随着系统信噪比（SNR）的降低，从1开始。

我们通过将事件数（N）的直方图拟合到泊松模型（图​（图3B）。第3页). 该分析得出了保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i3.gif=4.96±.09（p<0.05）光子/像素间隔（10μs持续时间），如预期。然后，我们分析了在不同频率下采样的试验，以确定有限采样频率对保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif.通过将脉冲幅度分布与我们的模型卷积，可以直接模拟脉冲幅度的变化，但不会改变最佳信号准则；它只是减少了保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif值小于1[18].

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif根据模拟脉冲的每个采样率计算（图​（图3A）。3A级). 注意，数字积分器显示出近乎理想的性能(保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif≈ 1). 如预期，对于低采样频率保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif很小，反映出采样方案遗漏了数据（单光子事件）。保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif随着采样率的增加，直到接近1 MHz的奈奎斯特极限（即，因为我们用2.35μs脉冲模拟了PMT电压）。我们用实际PMT在330 KHz（图中蓝色点）下过滤的数据重复了该分析​图3A）。3A级). 较低的滤波频率使脉冲变宽（3–4μs FWHM），从而提高了我们算法在较低采样率下的性能。1.25 MHz时，图像基本上是理想的保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-i1.gif.

我们还对来自相邻像素的光子的预期泄漏进行了建模（图​（图3C）。3厘米). 将半高宽2.5μs的模拟测试脉冲随机放置在宽度为2至10μs的像素间隔中。粗略地计算出的百分比是脉冲的面积在放置它的像素间隔之外的百分比。我们发现，建议的最短像素时间（~3.0μs）的漏光率为~10%。正常成像条件下更长的像素时间（像素间隔/脉冲宽度~2）只能产生~6%的漏气。

目前扫描图像在1.25 MHz的采集速率和330 kHz的滤波器频率下表现良好（图中的蓝色点和箭头​图3A）3A级)取决于应用程序。如前所述，使用1.25 MHz以上的采样率（连同更高的滤波器频率）目前是总线和CPU速度的问题。可以在软件中手动将采样率调整为1.25 MHz（例如2.5 MHz）的倍数，而不会损坏图像质量。这产生了2–3μs的有效像素时间范围。低至2μs的像素时间是可行的，500 kHz滤波器以每行1 ms的速度采集。

结论

我们已经证明，我们的算法可以创建具有近理想噪声特性和实时刷新率的数字图像。

ScanImage功能

我们现在简要介绍一下我们创建的将数据采集算法转化为完整图像采集程序的软件。这里介绍的功能可以通过MATLAB接口轻松扩展。LSM的接线图使用扫描图像如图所示​图1A1安培.

多通道采集

许多应用，包括定量钙成像，可能涉及使用两种光谱特性不同的染料（例如，绿色钙敏感型、Fluo-4和红色钙不敏感型、Alexa Fluor-594）[15]. 光学元件可以很容易地设计成在不同的通道中分离并同时收集两个发射波长。我们集成了对独立处理3个单独荧光通道的支持扫描图像数据实时采集、处理和显示（图​（图1B1B年).

三维图像采集

显微镜焦点由扫描图像允许从不同焦平面自动收集图像堆栈。这些堆栈可以很容易地设置和收集在扫描图像使用任何配置。为了降低噪声，可以在每个焦平面上实现卡尔曼滤波。

采集数据的结构

扫描图像将数据存储在TIF文件中，以便于移植和兼容。TIF文件可以包含多个帧，用于在同一文件中存储三维、多通道和时间序列数据。像素强度保存为16位无符号整数，利用检测器和DAQ板的全动态范围。不同的采集通道相互交错。实验细节被写入头字符串中，该头字符串被放入图像描述通用TIF标头的字段，并且可以通过包括MATLAB在内的所有图像处理程序中包含的标准标头读取模块进行访问。

舞台控制自动化

LSM通常涉及在复杂的大型标本中找到感兴趣的区域（ROI）。选择和保存ROI的能力有助于复杂成像实验的设计。扫描图像允许用户定义任意数量的ROI进行成像。扫描图像使用其对阶段和焦点的控制来自动收集焦点数据堆栈以及保存和检索ROI。通过一个实验循环系统，可以选择多个ROI，并以选定的重复率连续多次成像。

焦点界面

在数据采集之前，需要定位要成像的结构。为此，需要一种快速采集模式，用户可以在样本和焦点位置移动时实时观察图像。扫描图像包括一个焦点模式来实现这一点。在对焦模式下看到的图像与将要采集的图像相同。可以实时同时聚焦多个频道。图像缩放和旋转是通过改变后视镜的信号输出在对焦模式下完成的。

ScanImage的模块化设计：用户功能

其主要优势之一是扫描图像是一个用户友好的开发环境，MATLAB。用户可以轻松地离线开发和测试数据分析功能，并将其纳入软件中，而无需担心干扰数据采集。流程图扫描图像从编程角度来看，如图所示​图4A4A级软件的屏幕截图如图所示​图4B4B类.

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1475-925X-2-13-4.jpg

的流程图和屏幕截图扫描图像A）扫描图像使用一系列文本文件来记住不同显微镜、用户和实验配置的配置。软件和相关文件的每个方面都在扫描图像手册。B）的屏幕截图扫描图像同时从2个通道采集数据。

任何MATLAB函数都可以在获取图像后自动执行，以帮助在进行实验时进行分析（请参见扫描图像手册了解详细信息）。除了MATLAB函数外，程序员还可以编译C和Fortran代码，并在同一用户函数中使用MATLAB调用运行它。

ScanImage的模块化设计：控制附加设备

从编程的角度来看，该代码允许生成可轻松合并到扫描图像（见图​图4A）。4A级). 例如，可能需要集成额外的串行端口来运行其他光学设备。GUI可以用自己的初始化文件构建，并与扫描图像（请参见扫描图像手册了解详细信息）。此GUI可以使用与处理GUI相同的方便工具扫描图像使用，同时在设计和开发中为程序员提供灵活性。

可用性和分发

扫描图像作为OSI认证的开源软件免费提供。许可证可以在扫描图像ScanImageLicense.txt文件中的文件夹。许可证的所有条款，包括有关引用的详细信息扫描图像在已发布的报告中，使用时必须遵循扫描图像.

软件和安装文档可从以下网站获得：http://svobadalab.cshl.edu/software_main.html.

有关软件的任何问题或建议，请发送电子邮件至ude.lhsc@egaminacs

方法

编程

所有编程和基准测试都是在运行在Windows 2000 Professional PC上的MATLAB 6.1中完成的，该PC具有800 MHz Pentium III处理器和512 MB RAM。

缩写词表

2PLSM双光子激发激光扫描显微镜

共焦激光扫描显微镜

DAQ数据采集

CPU中央处理器

TTL晶体管-晶体管逻辑

PMT光电倍增管

GUI图形用户界面

信噪比

LUT查找表

DSP数字信号处理

COM通信端口

半高宽全宽最大值

SEM平均值标准误差

随机存取存储器

作者的贡献

BLS和KS构思并规划了这个项目。TAP和BLS编写了大部分代码，KS提供了贡献。利用TAP和KS进行了模拟和实验。TAP和KS起草了手稿。

致谢

我们感谢Brian Chen、Karen Zito和Josh Trachtenberg对早期版本的扫描图像.我们感谢安田良惠对分析的有益评论。我们感谢戈登·谢泼德（Gordon Shepherd）、凯伦·齐托（Karen Zito）和托马斯·奥尔特纳（Thomas Oertner）对手稿的有益评论。

这项工作的部分资金来自美国国立卫生研究院的拨款（拨款号R01 EB01464-01）。

工具书类

  • White EL，Keller A.涉及小鼠Sm1皮层皮质丘脑投射细胞局部轴突侧支的内在电路。《计算机神经学杂志》。1987;1987:13–26.[公共医学][谷歌学者]
  • Goldstein SR，Hubin T，Smith TG。一种改进的无运动部件视频共焦显微镜。《显微镜与显微镜学报》。1992;23:437–442. doi:10.1016/0739-6260（92）90019-A。[交叉参考][谷歌学者]
  • Pawley JB编辑。阻燃出版社：纽约。3 1995. 生物共焦显微镜手册。[谷歌学者]
  • Denk W、Strickler JH、Webb WW。双光子激光扫描显微镜。科学。1990;248:73–76.[公共医学][谷歌学者]
  • Denk W，Svoboda K。光子胜人一筹：为什么多光子成像不仅仅是一个噱头。神经元。1997;18:351–357. doi:10.1016/S0896-6273（00）81237-4。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Gosnell TR、Taylor AJ主编超快激光技术论文集。里程碑系列SPIE出版社：华盛顿州贝灵汉。1991
  • 帕利JBaCV。实用激光扫描共焦光学显微镜：从您的仪器获得最佳性能。收件人：Celis JE，编辑。《细胞生物学：实验室手册》。学术出版社：纽约；1994年，第44-64页。[谷歌学者]
  • Majewska A，Yiu G，Yuste R.一种定制的双光子显微镜和反褶积系统。Pflugers架构。2000;441:398–408.[公共医学][谷歌学者]
  • Lechleiter法学博士。Sienert I.使用声光偏转器的多光子激光扫描显微镜。生物物理杂志。2002;83:2292–2299. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Denk W等。使用双光子激光扫描显微镜对神经元进行解剖和功能成像。神经科学方法杂志。1994;54:151–162. doi:10.1016/0165-0270（94）90189-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lichtman JW，Sunderland WJ，Wilkinson RS。用简单共焦显微镜对突触结构进行高分辨率成像。新生物。1989;1:75–82.[公共医学][谷歌学者]
  • Tsai PS等。用于体外和体内研究的双光子扫描显微镜的原理、设计和构造。摘自：弗罗斯蒂格·R，编辑。体内光学成像方法。CRC出版社；2002年，第113-171页。[谷歌学者]
  • Mainen ZF等。活体脑切片的双光子成像。方法。1999;18:231–239. doi:10.1006/meth.1999.0776。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Trachtenberg JT等。成年皮层经验依赖性突触可塑性的长期体内成像。自然。2002;420:788–94. doi:10.1038/nature01273。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Oertner TG等。用光学量子分析探讨单突触的促进作用。自然神经科学。2002;5:657–664.[公共医学][谷歌学者]
  • Trefethen E等人。MultiMatlab:多处理器上的MATLAB。康奈尔理论中心。1996年，第96-239页。
  • Horowitz P，Hill W。剑桥：剑桥大学出版社。2. 1989. 电子艺术；第1125页。[谷歌学者]
  • Jones R，OIiver CJ，Pike ER。光强的光子计数和电流测量的实验和理论比较。应用选项。1970;10:1673–1680.[公共医学][谷歌学者]
  • Tan YP等。简单双光子显微镜中的快速扫描和高效光电检测。神经科学方法杂志。1999;92:123–35. doi:10.1016/S0165-0270（99）00103-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自生物医学工程在线由提供BMC公司