引言
线粒体神经胃肠道脑肌病（MNGIE）的临床特征是发病于第二至第五个十年，上睑下垂，进行性外眼压，胃肠动力障碍，恶病质，周围神经病变，肌病和白质脑病(1,2). 该病与线粒体DNA（mtDNA）的多重缺失和缺失有关，线粒体DNA的缺失和缺失被归因于细胞核和线粒体之间的基因组间通讯缺陷(1,三,4). 我们将该疾病位点定位于染色体22q13.32qter(5)并确定编码胸苷磷酸化酶（TP；E.C.2.4.2.4）基因的功能丧失突变是MNGIE的原因(6). 患者棕黄色皮毛样本中的TP活性低于对照平均值的10%，表明TP的功能丧失突变导致了疾病(6).
TP缺乏改变胸苷（脱氧胸苷，dThd）的代谢(7)脱氧尿苷（dUrd）；因此，我们假设dThd和dUrd水平升高会导致线粒体核苷酸库失衡，进而导致线粒体DNA异常。支持我们假设的观察结果是，骨骼肌中存在线粒体改变；然而，这种组织不表达TP(1). 这种“肌肉悖论”表明，TP缺乏通过异常核苷代谢间接导致线粒体DNA改变。
方法
患者。
我们之前在13名来自不同种族的MNGIE患者（6个家庭）中发现了纯合或复合恒生TP基因突变(6)包括德裔犹太人（MNGIE家族1[MN1]）、德裔美国人（MNGEE家族2[MN2]）(2)波多黎各（MNGIE家族3[MN3]）、非裔美国人（MNGEE家族4[MN4]）、波多黎各人（MNGIEC家族6[MN6]）和欧洲混血儿（MNGIE家族7[MN7]）。MN后面的数字指的是一个家族；个体由第二个数字识别（例如，MN1-1）。
细胞培养。
我们培养了6名MNGIE患者和6名年龄匹配的对照组的皮肤成纤维细胞。我们镀了10个5每名患者或对照组的成纤维细胞置于培养皿中（直径10 cm），10 ml MEM（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根公司）加15%FBS、1 mM丙酮酸、100μM非必需氨基酸、2 mML（左）-谷氨酰胺和1×MEM维生素溶液（Invitrogen公司）。我们在37°C和5%CO中培养细胞2从第三代（MN4-2和MN7-2）、第四代（MN2-2、MN4-3、MN7-1和MN2）或第五代（MN1-4和MN3-1）细胞中纯化DNA。
细胞色素c氧化酶和柠檬酸合成酶的测定。
在上述条件下培养6名患者和3名对照的皮肤成纤维细胞。将汇合细胞进行胰蛋白酶化并用PBS洗涤，将颗粒重新悬浮在反应缓冲液（50 mM磷酸钾，pH 7.0）中。细胞通过一个冷冻和解冻周期进行裂解。细胞色素前用1.3 mM月桂基麦芽糖苷处理细胞裂解物c（c）在测定柠檬酸合成酶之前，用0.5%Triton X-100进行氧化酶（COX）测量。已建立的方法用于测量COX和柠檬酸合成酶的活性(8). 蛋白质含量是用双茚四酮酸法测定的(9).
dUrd的测量。
血浆dUrd使用之前描述的经修改的HPLC方法测量(10,11). 用高氯酸（0.5 M最终浓度）处理血浆并离心以去除沉淀蛋白。使用Alltima反相色谱柱（C18 NUC，100Å，5μm，250×4.6 mm）和Alltima保护色谱柱（C1 8，5μm，7.5×4.6mm）（Alltech Associates Inc.，Deerfield，Illinois，USA）将50微升上清液注入Waters Corp.（美国马萨诸塞州米尔福德）的Alliance HPLC仪器中。注入的样品通过缓冲甲醇-颗粒流动相洗脱110分钟。洗脱液A为20mM磷酸钾，pH 5.6，洗脱液B为20mM磷酸钾和60%甲醇，pH 5.6。洗脱以1.5 ml/min的恒定流速进行，如下所示：时间0至5分钟，100%洗脱液a；5分钟至92分钟，100%至0%洗脱液A；92分钟至93分钟，0至100%洗脱液A；93分钟至110分钟，恒定100%洗脱液A。在267nm处测量洗脱液的吸收。dUrd的定量基于外部标准。峰的鉴定基于保留时间，并始终通过用大量过量纯化TP（美国威斯康星州密尔沃基Sigma-Aldrich）处理每一样品的第二等分样品以消除dUrd来确认。
DNA分析。
通过标准程序从外周血白细胞、培养的皮肤成纤维细胞和尸检组织中提取总DNA。首先在线粒体DNA中包含22个tRNA基因，然后在ABI Prism 310遗传分析仪中使用Big Dye Terminator Cycle Sequenting Reaction Kits（Perkin-Elmer Applied Biosystems，Foster City，California，USA）使用标准程序直接对一系列PCR扩增的DNA片段进行测序(12). 对外周血白细胞、培养的皮肤成纤维细胞和尸检组织的DNA进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
克隆PCR扩增的高变片段。
人类mtDNA非编码控制区中存在高变片段（HVS），这在许多人类mtDNA变异分析中得到了很好的证明，HVS1和HVS2被认为是突变热点(13–15). 筛选HVS 1和HVS 2，包含15975到635个核苷酸的片段(16)使用正向引物（核苷酸15975–15994）、反向引物（核酸635–616）和铂Taq DNA聚合酶高保真（Invitrogen Corp.）从纯化DNA样本中通过PCR扩增。PCR循环条件为：94°C下一个循环2分钟；在94°C下进行30次循环，持续1分钟，在55°C下持续1分钟和在72°C下保持1分钟；以及在72°C下延长7分钟。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中通过电泳分离。使用QIAquick凝胶提取试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN公司）从凝胶中提取1229-bp条带。PCR产物连接到pCRII-TOPO载体，并使用TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen Corp.）在含有氨苄西林（Invit罗gen Corp）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β的LB板中进行亚克隆-D类-半乳糖苷。单独的白色菌落在含有氨苄西林的TB培养基中独立培养。使用高纯度质粒分离试剂盒（美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏诊断公司）纯化了大约100个克隆质粒，并按照标准程序在ABI Prism 3700遗传分析仪（Perkin-Elmer Applied Biosystems）中直接测序(12).
RFLP分析。
对外周血白细胞、培养的皮肤成纤维细胞和尸检组织的DNA进行RFLP分析。对于第5814页线粒体DNA突变(A5814G型在编码重链）中，使用正向错配引物（5′-AGGCGGGAAGCCCGGCAGGTTTGAAGCTTCTT）从总DNA样本中扩增出一个98-bp的mtDNA片段，该片段跨越核苷酸5752到5849一个G-3′）（核苷酸5752–5791，错配核苷酸下划线）和一个反向错配引物（5′-CAGGGTTAGGCCTTTTACCACTCGAG总费用G-3′）（核苷酸5849–5815）(16). 突变的mtDNA引入了塔克通过RFLP分析检测到I限制位点。这种酶切割野生型98-bp片段，产生两个片段（64 bp和34 bp）；然而，核苷酸5814的T-to-C突变消除了限制位点。在12%的非变性丙烯酰胺凝胶中电泳消化的PCR产物，并在分子成像系统GS-363（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Read Laboratories Inc.）中进行分析，以量化突变百分比。我们还使用RFLP分析鉴定了其他七个T到C点突变（核苷酸616、3386、4370、10221、12310、15956和16172）和一个核苷酸5628处的T到A点突变。对于T616C型突变，使用正向引物（5′-CTCAAAGCATACACTGAAA）（核苷酸595-614）和反向错配引物（5'-ACCTATTTTATGGGTGTGAGCCCGTC）从总DNA样本中扩增出一个跨越核苷酸595-654的60 bp mtDNA片段G公司一个G公司A-3′）（核苷酸654-618）。突变的mtDNA引入了英国标准协会BI限制站点。对于T3386C型突变后，使用正向引物（5′-TCGCAATGCATTCCTATAGCTTACCGAACG-3′）（核苷酸3350–3380）和反向错配引物C类G-3′）（核苷酸3427-3388）。突变的mtDNA引入了艾娃我限制网站。对于T4370C型突变，使用正向引物（5′-GGAGCTTAAACCCTTTATT）（核苷酸4308–4327）和反向错配引物（5'-CTGACTTTAGTGATGGGTGTGGCACCGCG）从总DNA样本中扩增出跨越核苷酸4308至4412的105-bp mtDNA片段一个A-3′）（核苷酸4412-4373）。突变的mtDNA引入了耳朵我限制网站。对于T10221C型突变，使用正向引物（5′-AGTGCGCTTCGACCCTATA-3′）（核苷酸10171–10190）和反向引物（5′-CGTTGTAGGGCTCATGGTAG-3′）（核苷酸10300–10281）从总DNA样本中扩增出跨越核苷酸10171至10300的130bp mtDNA片段。突变的mtDNA引入了耳朵我限制网站。对于T12310C型突变，使用正向引物（5′-ATAACAGCTATCCATGGTCTTAGG）（核苷酸12277–12301）和反向错配引物燃气轮机A-3′）（核苷酸12346–12311）。突变的mtDNA引入了Sca公司我限制网站。对于t15956厘米突变，使用正向错配引物（5′-TGTAAC）从总DNA样本中扩增出一个跨越核苷酸15919到15996的78-bp mtDNA片段G公司GGAGATGAAAACCTTTCCAAGG）（核苷酸15919–15950）和反向错配引物（5′-GCTTGGGTGCTATGGTGAGACTTTCTCTCTCC类G-3′）（核苷酸15996-15957）。突变的mtDNA引入了消息传递程序我限制网站。要检测T16172C型转换时，使用正向引物（5′-TACTTGACCACCTGTAGACATAAACCCA）（核苷酸16140–16170）和反向错配引物（5'-CTTTGTAAGCATGGAGGGGGTTTGAT）从总DNA样本中扩增出跨越核苷酸16140到16208的69-bp mtDNA片段科科斯群岛GG-3′）（核苷酸16208至16173，错配核苷酸下划线）(16). 突变的mtDNA引入了Nci公司我限制网站。对于T5628A型突变，使用正向引物（5′-GCCTCAGTAAGTTGCAATA）（核苷酸5549至5568）和反向错配引物（5'-CACATTGCTAGTAGTAAGGCTAAGTTAAAGTG）从总DNA样本中扩增出一个跨越核苷酸5549到5668的120-bp mtDNA片段C类C类一个G-3′）（核苷酸5668–5629）。突变的mtDNA引入了英国标准普尔我限制网站。
统计方法。
我们使用了Mann-WhitneyU型评估皮肤成纤维细胞生物化学活性差异的非参数检验(n个< 10).
结果
皮肤成纤维细胞中的COX。
与对照细胞相比，MNGIE患者皮肤成纤维细胞系中COX活性降低(P（P）=0.04）（表). COX活性正常的皮肤成纤维细胞来自轻度受累个体（MN1-4）。与COX相比，两组中柠檬酸合成酶（线粒体基质酶和线粒体质量测量）的活性相似（表). 当COX活性归一化为柠檬酸合成酶时，患者皮肤成纤维细胞中COX活性的缺陷更加明显(P（P）=0.02）（表).
表1
MNGIE患者和对照组皮肤成纤维细胞的线粒体酶活性
MNGIE患者的dUrd水平。
在对照组中未检测到dUrd的血浆水平(n个=20）和杂合TP突变携带者(n个=14）（即浓度低于0.05μM），但在所有分析的患者中显著升高（14.2μM±4.4μM，平均值±SD；范围5.5–24.4；n个= 25).
MNGIE患者的mtDNA点突变。
根据我们的观察，TP缺乏的皮肤成纤维细胞降低了COX活性（表)但Southern blot分析没有显示mtDNA缺失或多重缺失（数据未显示），我们怀疑MNGIE患者的细胞中可能存在mtDNA点突变。因此，我们对来自6名MNGIE患者（MN1-4、MN3-1、MN4-2、MS4-3、MN7-1和MN7-2）培养的皮肤成纤维细胞DNA中22个mtDNA-编码的tRNA基因进行了测序。我们确定了三个T到C的转换：tRNA中的4370核苷酸格林，tRNA中核苷酸5814赛斯和tRNA中的核苷酸15956赞成(16). 有趣的是，所有三个突变之前都有三个A残基（即5′-AAAT到5′-AAA）。
此外，我们对两名MNGIE患者（MN4-2和MN7-2）骨骼肌和培养的皮肤成纤维细胞的整个线粒体DNA进行了测序。为了确定母系遗传多态性，我们还对两名患者母亲的外周血白细胞mtDNA进行了测序。我们在患者的骨骼肌线粒体DNA中没有发现任何突变。相反，我们在两名MNGIE患者的培养皮肤成纤维细胞中发现了22个额外的mtDNA点突变（表). 有趣的是，其中18个点突变（82%）（核苷酸1040、2233、3653、4028、5517、5628、7055、7440、8108、8367、9110、9758、10432、11324、11781、13879、14166和15831）是T到C的转换。在这18个T到C转换中，有15个（83%）之前有至少一个A残基（表)和七个跃迁（39%）之前至少有三个A残基。
为了定量mtDNA突变水平并识别额外的5′-AAAT到5′-AAA转换，对从6个培养的皮肤成纤维细胞系、13个外周血白细胞样本和4个MNGIE患者尸检组织样本中提取的DNA进行了RFLP分析。在线粒体DNA的203个5′-AAT位点中，筛选出8个适合RFLP分析的位点和1个5′AAT位点。我们在皮肤成纤维细胞mtDNA中发现了另外六种异质性突变：四种是位于tRNA第616核苷酸的5′-AAAT到5′-AAA突变苯丙氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶-1亚单位1的3386核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶-3的10221核苷酸和tRNA的12310核苷酸亮氨酸（CUN）第五个突变是置换环（D-loop）中核苷酸16172处的5′-AAT到5′-AAC的转换。我们通过RFLP分析确定的第六个突变是tRNA中5628核苷酸的5′-AAAT到5′-AAA的异质性突变阿拉来自6名患者的皮肤成纤维细胞、外周血白细胞和组织mtDNA（表).T5628C型在一个母系遗传的进行性外眼肌麻痹家族中被鉴定为致病性突变(17).
总之，在RFLP分析筛选出的9个突变中，至少一半患者的皮肤成纤维细胞中鉴定出7个（核苷酸3386、4370、5628、5814、10221、15956和16172），所有6个细胞系中均存在3个（核苷酸5814、10241和15956），异质性水平在2%到81%之间（表). 此外，通过RFLP分析，在白细胞和患者尸检组织（MN2-1、MN3-1、MN4-2和MN7-2）中检测到五种突变（核苷酸3386、5814、10221、15956和16172），异质性水平不超过63%（表和表). 值得注意的是，来自13名受试患者的所有组织和细胞样本都含有核苷酸5814突变。第5814页被鉴定为致病性突变(A5814G型线粒体脑病患者的编码重链）(18,19)或线粒体肌病和心肌病(20).
表4
RFLP分析筛查MNGIE患者尸检组织mtDNA点突变
来自22名个体的33份对照样品（6份培养的皮肤成纤维细胞系、11份大脑、4份小肠、6份肾脏和6份肝脏）和未受影响的TP突变携带者（23份外周血白细胞样品）中均未发现所有突变（数据未显示）。
为了确定MNGIE患者的核DNA中是否存在类似突变，我们对7个基因组5′-AAAT位点进行了RFLP筛选分析，其中一个位于TP基因本身，三个位于18S核糖体RNA基因(21)人β-actin基因中有三个(22)使用来自6个皮肤成纤维细胞系、13个外周血白细胞样本和来自13名MNGIE患者的32个组织的总DNA。未检测到突变（数据未显示）。
通过PCR克隆测序检测MNGIE患者HVS中的mtDNA点突变。
为了筛查非5′-AAAT位点的突变，我们对线粒体DNA D-loop中的HVS1和HVS2进行了测序，这两个位点被认为是突变的热点(13–15). 我们亚克隆了来自两名患者（MN4-3和MN7-1）和两名对照的培养皮肤成纤维细胞mtDNA的PCR-扩增HVS，并对每个PCR片段的84到92个克隆进行了测序。我们在核苷酸291、292、16043和16352（表). 此外，我们还鉴定了其他四种非5′-AAAT到5′-AAA的突变：核苷酸16247处的5′-GGAGT到5′-GAGC，核苷酸291处的5’-AAAT至5′-AAAA，核苷酸291-290处的5'-AAATT到5’-AAA，以及5′-AATATTT处的T缺失（表). HVS 1和HVS 2中的4个5′-AAAT位点（位于核苷酸16094–16091、16137–16140、16325–16322和159–156）未显示突变。来自两个对照皮肤成纤维细胞系的DNA在D环中没有显示任何突变。
讨论
在MNGIE中，TP突变导致患者血液中dThd水平升高(7). 我们假设，在这种疾病中，异常的核苷代谢导致线粒体脱氧核苷5′-三磷酸（dNTP）池的改变，进而导致线粒体DNA异常，如缺失和多重缺失(6,7). dThd途径的改变似乎对线粒体中的dNTP池的影响比细胞核中的更严重。这种对线粒体DNA的选择性作用可能由三个因素解释。首先，线粒体dNTP池在物理上是分开的，并且是独立调节的(23–25). 其次，线粒体核苷酸库可能比核核苷酸库更容易受到过量dThd的毒性影响，因为线粒体DNA比核DNA更依赖dThd回收，而核DNA依赖dThd-的从头合成(24,26). 第三，人类线粒体可能缺乏有效的错配修复系统(27). 虽然线粒体DNA在MNGIE中明显受到影响，但我们不能排除核DNA也受到影响的可能性。
在本报告中，我们在MNGIE患者的细胞中发现了36个mtDNA点突变、一个TT到AA的取代和一个单核苷酸缺失（表). 这是首次报道常染色体线粒体疾病中的多个线粒体DNA点突变。这些突变的几个特征值得注意。首先，在所有检查的MNGIE患者中检测到mtDNA的点突变（表)，并且每个组织都至少有一个mtDNA点突变（表). 其次，我们没有在任何未受影响的TP突变携带者中发现这些突变，这意味着线粒体DNA的改变是体细胞点突变，而不是母体遗传。第三，测序确定的绝大多数点突变（22个中的18个，或82%）是T到C的转换。第四，测序确定的22个mtDNA点突变中，有18个（82%）之前有至少一个A残基，22个中有10个（45%）之前有5′-AAA序列（表). 与5′-at（1897个位点中的2个，即0.1%）位点相比，T-C突变在5′-AAT（139个位点中有4个，即2.9%）和5′-AAT5个位点（506个位点，即1.2%）发生的频率更高。
目前尚不清楚MNGIE中mtDNA点突变是如何产生的，但基于这些突变的序列特异性，我们提出了两种机制：“next-nucleotide效应”导致错误核苷酸的高度直接错误整合(28)和“错位突变”(29)（图). 研究表明，模板胸腺嘧啶残基（T·dGMP）对面的脱氧鸟苷单磷酸（dGMP(30,31). 错误掺入后，MNGIE细胞线粒体中的高浓度脱氧胸腺嘧啶三磷酸（dTTP）可能会加速5′-AA模板区域的聚合酶活性，从而破坏错配T·dGMP核苷酸的mtDNA聚合酶γ（polγ）外切酶去除（图a） ●●●●。在体外，细菌和哺乳动物聚合酶具有核酸外切酶活性，包括mtDNA polγ，可以观察到这种next-nucleotide效应(28,32,33). 此外，线粒体DNA polγ外切酶活性可被dThd增加引起的脱氧胸苷单磷酸（dTMP）水平升高所抑制(33,34). 因此，在MNGIE细胞中，dThd增加导致的dTMP和dTTP升高可能有助于抑制mtDNA-polγ外切酶活性。在随后一轮线粒体DNA复制后，T·G错误整合将导致T到C突变。
(一)错误合并和下一核苷酸效应模型。(b条)具有次核苷酸效应的位错机制模型。
功能失调的线粒体呼吸链酶产生的活性氧增加可能有助于T-C转换的积累。具体来说，鸟嘌呤残基氧化为8-氧鸟嘌呤的过程具有诱变性，因为它会导致与as的错配，并导致G-to-T颠倒（互补链上的C-to-A）(35); 然而，我们观察到的绝大多数突变是T到C的转换（互补链上的A到G）。此外，在MNGIE的早期阶段，核苷（可能还有核苷酸）的不平衡必须先于线粒体DNA的改变和呼吸链缺陷。因此，活性氧不太可能在MNGIE中mtDNA点突变的产生中起主要作用。
dUrd水平升高也可能导致MNGIE中mtDNA点突变的产生。事实上，患者的血浆dUrd水平高于dThd。与dThd一样，dUrd可以通过dThd挽救途径磷酸化，导致线粒体中脱氧尿苷三磷酸（dUTP）浓度异常高，从而在线粒体DNA复制中取代dTTP(36). 因此，除了dTTP增加外，dUTP水平升高也会放大下一核苷酸效应。
其他因素可能会导致特定的5′-AAT位点（例如。，T5814C型)更容易发生点突变。然而，D-loop中的39个5′-AAT位点没有发现点突变，这表明并非所有5′-ART位点都容易发生替换。
与5′-AAT到5′-AAC转变的错误结合机制相反，位错突变模型可以解释在291–290核苷酸处观察到的T到a、TT到AA和T缺失突变（图b）(29). 根据这一提出的机制，突变是由模板DNA中的瞬时单核苷酸错配产生的。例如，在一段六个T残基（核苷酸285–291）中，与模板倒数第二个碱基相对的脱氧腺苷一磷酸（dAMP）被并入后，均聚区内的T残基循环流出，导致与相邻a残基相对的dTMP被并入（图b、 “滑倒”下方的步骤）。如果在螺旋外T重新排列之前并入后续核苷酸，则会导致单个T缺失。为了支持这一机制，一项体外实验证明，polγ在均聚T序列中经常产生单T缺失(29,30). 或者，如果在引入下一个核苷酸之前发生螺旋外T残基的重排（图b、 则子股的3′端T将与模板T不适当对齐(29). 随后，next-nucleotide效应可能会加速mtDNA polγ聚合并抑制错配核苷酸的外切酶修复。在这种情况下，T·T错位不是由直接误诊形成的，而是由瞬时错位形成的，并导致体外mtDNA polγ药物试验中观察到的T到a颠倒(29)（图). 值得注意的是，对不同人群中已发表的HVS1和HVS2多态性的分析表明，位错突变有助于碱基替换的产生，特别是在核苷酸的单调序列中(15). 与我们在MNGIE患者中的观察结果相反，之前对mtDNA polγ在体外产生的突变的研究没有发现短时间同聚物运行中的点突变增强；然而，这些研究使用了平衡的核苷酸库(29).
MNGIE的线粒体DNA点突变可能通过导致呼吸链酶缺乏而导致疾病发病。其中许多突变的水平太低，不具有功能意义，大多数可能是中性多态性。然而，如前所述，核苷酸5628和5814的两个T-C转换被描述为线粒体脑肌病患者的主要致病性线粒体DNA突变(17–20)可能与线粒体功能障碍有关。患者组织中这些mtDNA突变的异质性水平低于产生生化表型所需的典型80-90%阈值。然而，单个线粒体DNA点突变水平极高的局部积累可能是单个细胞或骨骼肌细胞片段的致病因素。事实上，在常染色体显性遗传进行性外眼肌麻痹患者的COX缺乏骨骼肌中已发现致病性mtDNA缺失的局部积聚(37)和包涵体肌病(38).
MNGIE中三种形式的mtDNA异常的相对致病性贡献（即缺失、多重缺失和点突变）可能因组织而异。例如，在皮肤成纤维细胞中，我们只检测到点突变，而没有检测到线粒体DNA的缺失或多重缺失。相反，在骨骼肌中，线粒体DNA的缺失和多重缺失可能比线粒体DNA点突变具有更大的致病意义，而线粒体DNA的点突变没有通过完整的线粒体DNA测序检测到（表)RFLP分析显示，仅在低水平（≤2%）下存在（表和表). 培养的成纤维细胞中mtDNA点突变水平相对较高，这可能是由于细胞主要使用厌氧糖酵解而不是氧化磷酸化来产生ATP。因此，在缺乏针对呼吸链缺陷细胞或线粒体的选择性压力的情况下，不平衡的线粒体核苷酸库可能会产生高水平的线粒体DNA点突变。
线粒体DNA缺失连接的测序并未揭示与5′-AAT位点的关系(1,39). 然而，D-loop中的点突变可能会改变mtDNA复制，导致mtDNA耗竭。然而，检测这种突变可能很困难，因为这种复制能力不强的分子的水平很低。我们已经确定的D-loop中的mtDNA突变可能不会损害复制，因为它们不会影响对mtDNA复制很重要的保守序列块或终止关联序列等序列(40).
随着至少一种dNTP物种的升高，产生脱氧核苷酸库失衡的其他条件可能会导致mtDNA或核DNA中的位点特异性点突变。例如，脱氧核苷酸酶-2（dNT-2）的功能丧失突变，使线粒体中的dTMP和dUTP去磷酸化，也可能增加线粒体中的d TTP和d UTP池，导致线粒体DNA发生类似于MNGIE的改变(41). 相比之下，细胞溶质酶dNT-1编码基因的功能丧失突变可能产生核DNA突变(41).
总之，我们在患有功能丧失TP突变的MNGIE患者的组织、外周血白细胞和培养的皮肤成纤维细胞中发现了38种不同的mtDNA突变。患者未受影响的母系亲属中没有突变，表明突变发生在体组织中。大多数点突变是位点特异性的；36个中有25个是T到C的转换，之前至少有两个A残基。我们之前的研究已经证实了MNGIE患者的dThd和dUrd代谢的改变(7)并导致我们假设，两个核苷水平的升高会导致线粒体中的核苷酸库失衡，导致点突变、多重缺失的积累和线粒体DNA的缺失。需要测量线粒体、细胞核和细胞质中的核苷酸库来证明这一假设，但在技术上具有挑战性。核苷代谢的改变导致序列特异性点突变可能是人类一种重要的新疾病机制。
