AIP1通过促进ASK1与其抑制剂14-3-3的分离，介导TNF-α诱导的ASK1活化

酵母双杂交筛选。

ASK1-ΔN诱饵用于筛选预转化的人类心脏cDNA文库（Clontech Laboratories Inc.）。根据制造商（Clontech Laboratories Inc.）的说明进行酵母双杂交筛选。简而言之，携带pAS–ASK1-ΔN的酵母菌株AH109与携带人类心脏cDNA文库的Y190进行交配。在缺乏Trp、Leu、His和Ade（QDO平板）的合成脱落琼脂平板上选择交配合子。酵母菌落转移到尼龙膜上，并使用β-半乳糖苷酶过滤试验进行处理。从阳性菌落中分离出质粒，并用pAS2.1或pAS-ASK1-ΔN重新转化到酵母菌株Y190中，以确认QDO上的生长和β-半乳糖苷酶的活性是ASK1-ΔN依赖性的。用染料终止循环测序试剂盒（罗切斯特大学核心设施）对真阳性克隆的cDNA插入物进行DNA测序。

细胞和细胞因子。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和牛主动脉内皮细胞（BAEC）购自Clonetics Corp.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。人类重组TNF-α来自R&D Systems Inc.（美国明尼苏达州明尼阿波利斯），使用浓度为10 ng/ml。

产生抗N末端AIP1的多克隆抗体。

通过Cocalico Biologicals Inc.（美国宾夕法尼亚州雷姆斯敦）用GST–AIP1-PH蛋白免疫兔子，产生兔多克隆抗体。

JNK和ASK1激酶分析。

如前所述进行JNK分析(6,7)使用含有c-的N末端80个氨基酸残基的GST–c-Jun 1-80，使用Jun融合蛋白作为底物。使用GST-MKK4作为底物进行ASK1分析。

转染和报告检测。

如前所述，通过DEAE-右旋糖酐法进行HUVEC转染(6,7). BAEC通过Lipofectamine 2000（Invitrogen Corp.，San Diego，California，USA）转染。使用Berthold光度计（美国马里兰州盖瑟斯堡EG&G Wallac）重复两次测量荧光素酶活性和肾素活性。所有数据均归一化为相对荧光素酶光单位/肾小球单位。

免疫沉淀和免疫印迹。

各种处理后的HUVEC或BAEC用冷PBS洗涤两次，并在1.5 ml冷裂解缓冲液中溶解（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl，0.1%Triton X-100，0.75%Brij 96，1 mM原钒酸钠，1 mM氟化钠，1 m M焦磷酸钠，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮氨酸肽，2 mM PMSF和1 mM EDTA）在冰上呆20分钟。为了分析体内蛋白质相互作用的免疫沉淀，细胞裂解物通过与正常兔血清和蛋白A/G琼脂糖（美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）在旋转器上在4°C下孵育过夜进行预处理。然后将裂解产物与第一个蛋白特异性抗血清（抗14-3-3；Santa Cruz Biotechnology Inc.）和50μl蛋白A/G琼脂糖孵育2小时。每次免疫沉淀后，通过在13000下离心收集免疫复合物克10分钟，然后用裂解缓冲液清洗三到五次。对免疫复合物进行SDS-PAGE，然后用ASK1（抗ASK1）特异的第二抗体进行免疫印迹（圣克鲁斯生物技术公司）。根据制造商（Amersham Life Sciences Inc.，Arlington Heights，Illinois，USA）的说明，使用ECL试剂盒检测化学发光。为了检测FLAG标记蛋白（AIP1和TRAF2），使用抗FLAG M2抗体（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）进行免疫印迹。为了检测HA标记的蛋白质（ASK1-WT），使用抗HA抗体（Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，Indiana，USA）进行免疫印迹。

共焦免疫荧光显微镜。

如前所述，对培养的HUVEC和BAEC进行固定、渗透和染色(16). 对于凋亡分析，细胞核用DAPI（2.5μg/ml）染色。使用奥林巴斯共焦显微镜进行共焦免疫荧光显微镜。

Shag-AIP1的RNA干扰结构。

用于产生pShag-AIP1的寡核苷酸序列为：AIP1-A1，5′-ACT CCT TCA GCC TCG GCA TCA GAT GGG AGC TTG TTC CGT CTG ATG AGG AAG GGG TCT TTT T；AIP1-A2，5′-GAT CAA AAA AGA GAC CCC TTC AGC CTC AGC ATC AGA CGG AAC CTT CTC CCA TCT GAT GCC GAG GAA GGA GTC G；AIP1-B1，5′-ATG TGC TCC ACA CGC CGG CTG TTG TCC TGA AGC AGG ATA GTC GGC TGG AGC ATA TCC TTT TTT T；AIP1-B2，5′-GAT CAA AAA AAG GAT ATG CTC CAC CCG ACT ATT ATC CTC AAG CTT CAG GAC AGC CGT GTG GAG CAC ATC G；AIP1-C1，5′-TCC ACC TCT GAC ATC AGG TCT GTC AGC AGC TTG TGA CGG ATC TGA TGT CGG AGG ATC GTT TTT T；和AIP-C2，5′-GAT CAA AAA ACG ATC CAC CTC CGA CAT CAG ATC CGT CAC AAG CTT ACA GAC CTG ATG ATG TCA GAG GTG GAC G。

寡核苷酸由Integrated DNA Technology Inc.（美国伊利诺伊州斯科蒂）合成，并退火/克隆到pShag载体中(17). AIP1短发夹RNA（shRNA）的表达受U6启动子的控制。

C2结构域内富含赖氨酸的簇，而不是AIP1的GAP活性，对ASK1结合至关重要。

C2结构域是磷脂酶、PKC和突触素等中存在的保守结构域。最初被鉴定为钙²⁺-天冬氨酸残基形成的结合基序和富含赖氨酸的簇形成的磷脂酰结合基序。然而，一些C2域不包含Ca2⁺-结合位点，但保留结合磷脂、肌醇多磷酸盐和细胞内蛋白质的能力。C2结构域内富含赖氨酸的簇对这些活动至关重要(19). 我们比较了AIP1的C2结构域和PKC的典型C2结构域，发现AIP1-C2不包含保守的Ca2⁺-结合残基，但有两个富含赖氨酸的簇（K104-106和K158-162；图​图2a）。2a） ●●●●。为了检查富含赖氨酸的簇是否与ASK1关联有关，将两个簇内的赖氨酸残基突变为丙氨酸，以生成三个AIP1-N突变体（AIP1-KA1在104–106位置K→A，AIP1-KA2在158–161位置K→B，以及KA1/2在两个簇上突变）。我们还在AIP-N的GAP结构域（AIP1-RL）中生成了一个R289突变的cDNA，该cDNA已被证明破坏了大鼠AIP1同源物DIP1/2的GAP活性(15). 用FLAG标记的AIP1-N构建体（AIP1-KA1、-KA2、-KA1/2或-RL）转染EC。AIP1-KA与ASK1的相关性通过抗ASK1共免疫沉淀试验和抗FLAG的Western blot检测。结果显示R289突变（AIP1-RL）对AIP1-N与ASK1的结合没有影响（图​（图2b），2b） 表明AIP1的GAP活性对ASK1结合并不重要。然而，AIP1 C2结构域内K154-161（AIP1-KA2或-KA1/2）的突变，但K104-106（KA1）的突变没有显著降低AIP1与ASK1的相关性。这些数据表明，AIP1 C2结构域中的K154-161残基对ASK1结合至关重要。

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图2

AIP1 C2结构域内富含赖氨酸的簇对ASK1结合至关重要。(一)AIP1 C2结构域和PKC保守C2结构域的序列比对。粗体中的氨基酸残基是Ca²⁺-结合位点。AIP1中的K簇加下划线，并突变为A以生成KA1、KA2和KA1/2（两个K簇的突变）。(b)第二个K簇的突变显著降低ASK1结合。将标记有FLAG的AIP1-N、KA1、KA2或KA1/2的ASK1-ΔN与内皮细胞中的ASK1共转染，用抗ASK1免疫沉淀法检测ASK1与AIP1-N或突变体的相互作用，然后用抗FLAG免疫印迹法检测其相互作用。

TNF-α诱导内皮细胞中AIP1与ASK1的关联。

在共免疫沉淀试验中，我们没有观察到全长AIP1（AIP1-F）与ASK1的相关性。因此，我们推断AIP1-F只有在被细胞外刺激激活后才能与ASK1结合。为了验证这一假设，我们检测了AIP1-F与ASK1对TNF-α（一种诱导内皮细胞ASK1激活的促炎细胞因子）的反应的相关性。用AIP1-F或AIP1-N转染内皮细胞，然后用TNF-α处理。用抗ASK1免疫沉淀法检测AIP1与内源性ASK1的相关性，然后用抗FLAG免疫印迹法检测其相关性。结果表明，TNF-α强烈诱导AIP1-F与ASK1的结合（图​（图3a）。三a） ●●●●。相反，AIP1-N与ASK1组成性结合，表明AIP1-C是一个阻断AIP1-ASK1相互作用的抑制域。

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图3

TNF-α诱导内皮细胞中AIP1与ASK1的关联。(一)用AIP1-F或AIP1-N转染BAEC，然后用TNF-α处理（10 ng/ml，15分钟）。细胞裂解物用抗ASK1免疫沉淀，免疫沉淀中的ASK1用抗AIP1免疫印迹法测定。(b)AIP1抗体的特异性。Cocalico Biologicals Inc.用GST–AIP1-PH免疫兔子，制备了抗AIP1的多克隆抗体。用表达FLAG标记的AIP1-F、-N和-C的293T细胞裂解物通过Western blot（1–3道）测定抗AIP1.的特异性。使用抗-FLAG作为对照（4-6车道）。(c（c）)AIP1在培养的内皮细胞中高度表达。通过Western blot和抗AIP1检测来自HUVEC、乳腺癌MCF-7细胞或前列腺癌细胞系LNCaP（每个样本20μg总蛋白）的细胞裂解液中AIP1的表达。(d日)TNF-α诱导AIP1与ASK1的关联，而它将14-3-3从ASK1中分离出来。HUVEC要么未经治疗，要么接受TNF-α治疗（10 ng/ml，15分钟）。用抗ASK1免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗AIP1或抗14-3-3进行蛋白质印迹。(e（电子）)TRAF2诱导AIP1与ASK1的关联。BAEC通过载体控制（VC）或FLAG-tagged TRAF2（TR2）转染。TRAF2或AIP1与ASK1的关联通过用抗ASK1进行免疫沉淀，然后用抗FLAG或抗AIP1进行蛋白质印迹来确定。(（f）)AIP1对TRAF2-ASK1复合物无影响。BAEC用载体对照或AIP1-N转染，然后用TNF-α处理（10ng/ml）。用抗TRAF2免疫沉淀法和抗ASK1免疫印迹法测定内源性TRAF2-ASK1复合物。免疫沉淀；IB免疫印迹。

为了确定内皮细胞中AIP1和ASK1的内源性结合是否也是TNF-α依赖性的，我们使用GST-AIP1-PH作为抗原（抗AIP1-N；见方法），生成了一种针对AIP1 N末端PH结构域的兔多克隆抗体。首先，我们使用含有FLAG标记的AIP1-F、AIP1-N和AIP1-C在293T细胞中过度表达的细胞裂解物（其中内源性AIP1的表达低于可检测水平）来确定抗体特异性。结果表明，AIP1-F和AIP1-N被抗-AIP1-N检测到，但AIP1-C没有检测到（图​（图3b）。三b） ●●●●。在对照实验中，抗FLAG检测到AIP1-F、AIP1-N和AIP1-C（图​（图3b）。三b） ●●●●。以前，我们用与大鼠DIP1/2的AAs 976–996对应的C末端序列免疫兔子，产生抗体，该序列与人类AIP1（抗AIP1-C）相同(14,15)，该抗体识别AIP1-F和AIP1-C（未显示）。这些数据证实了AIP1的抗AIP1-N和抗AIP1-C抗体的特异性。然后我们测定了内皮细胞内源性AIP1的表达。抗AIP1蛋白的Western blot表明AIP1在培养的HUVEC中高度表达（图​（图3c）三c） 和BAEC（未显示），但在一些肿瘤细胞中没有，包括前列腺细胞系LNCaP和乳腺癌细胞系MCF-7（图​（图3三c） ●●●●。

然后我们检查了内皮细胞内源性AIP1和ASK1的相关性。用TNF-α（10 ng/ml，持续15分钟）处理HUVEC，通过与抗ASK1共免疫沉淀，然后用抗AIP1或14-3-3进行Western blot检测EC中内源性AIP1-ASK1和ASK1-14-3-3复合物。TNF-α治疗并未显著改变内皮细胞ASK1、AIP1或14-3-3的表达（图​（图3c）。三c） ●●●●。然而，通过TNF-α治疗，AIP1与ASK1的关联性显著增加，这表明AIP1和ASK1之间的关联是TNF-β诱导的。相反，TNF-α减少了14-3-3与ASK1的关联，这与TNF-β通过分离ASK1与14-3-3部分激活ASK1这一模型一致（图​（图3d）。三d） ●●●●。在BAEC中也获得了类似的结果（未显示）。

TRAF2是介导TNF-α诱导ASK1活化的关键衔接蛋白(9,12)内皮细胞中TRAF2的过度表达激活了ASK1-JNK通路(6,7). 我们检测了TRAF2的过度表达是否诱导AIP1与ASK1的关联。用载体控制或FLAG标记的TRAF2转染BAEC，并测定内源性AIP1-ASK1复合物。结果表明，TRAF2显著增加了AIP1-ASK1复合物的形成（图​（图3e）。三e） ●●●●。我们还检测了AIP1对TRAF2-ASK1复合物的影响。用载体对照或AIP1-N转染BAEC，然后用TNF-α处理（10ng/ml），并通过用抗TRAF2免疫沉淀，然后用抗ASK1蛋白质印迹来测定内源性TRAF2-ASK1复合物。正如预期的那样，TRAF2-ASK1复合物的形成是由内皮细胞中的TNF-α诱导的。AIP1-N表达没有增加基础或TNF-α诱导的TRAF2-ASK1相互作用（图​（图3三f） ●●●●。

TNF-α揭示了AIP1的N-末端和C-末端之间的分子内相互作用。

TNF-α诱导的AIP1与ASK1的结合表明，AIP1由于分子内相互作用而处于非活性状态，TNF-。这首先得到了我们的发现的支持，即抗AIP1-N抗体（识别N-末端PH结构域），而不是抗AIP1-C抗体（识别C-末端结构域），可以有效地免疫沉淀AIP1-F（图​（图4a，4a、 车道3与车道5）。在AIP1-F存在的情况下，抗AIP1-N也能免疫沉淀AIP1-C，这表明AIP1-F和AIP1-C形成复合物（图​（图4a，4a、 车道3）。TNF-α治疗（10 ng/ml，持续15分钟）显著减少AIP1-F–AIP1-C复合物的形成（图​（图4a，4a、 车道4与车道3）。为了确定AIP1-C是否与AIP1-F的N末端结构域或C末端结构域结合（二聚化），我们检测了AIP1-N和AIP-C的相互作用。ECs与AIP1-C-和AIP1-N-共转染，然后进行TNF-α治疗（10 ng/ml，15分钟）。AIP1-C和AIP1-N的相关性通过免疫沉淀法和抗-AIP1-N测定，然后通过Western blot和抗-AIP1-C测定​（图4b）。4b） ●●●●。这些数据表明，TNF-α促进了AIP1 N端和C端之间分子内相互作用的破坏。

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图4

TNF-α破坏AIP1的N端和C端之间的分子内相互作用。(一)AIP1以封闭形式折叠。用AIP1-F和AIP1-C转染BAEC，然后用10 ng/ml TNF-α处理15分钟（+）或不处理（-）。用AIP1的抗AIP1-N或抗AIP1-C免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗FLAG免疫印迹。(b)TNF-α干扰AIP1-C和AIP1-N的相互作用。将AIP1-C-和AIP1-N转染内皮细胞，然后进行TNF-一(+). 免疫印迹法检测AIP1-C和AIP1-N的表达。用抗AIP1-N免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗AIP2-C免疫印迹（3–4道）。

AIP1破坏ASK1–14-3-3复合体。

数据表明AIP1和14-3-3与ASK1相互关联，这促使我们推断AIP1与14-3-3竞争ASK1结合以响应TNF-α。为了验证这一假设，用FLAG标记的14-3-3（1μg）表达质粒转染内皮细胞，并增加FLAG–AIP1-N（0-1μg）的数量。ASK1相关AIP1和14-3-3用抗ASK1免疫沉淀法测定，然后用抗FLAG免疫印迹法测定。AIP1-N的表达对ASK1和14-3-3的表达水平没有影响（图​（图5a）。5a） ●●●●。然而，14-3-3与ASK1的结合显著减少，同时ASK1–AIP1-N复合物形成增加（图​（图5a）。5a） ●●●●。为了排除AIP1-N与ASK1竞争14-3-3结合的可能性，我们在GST-14-3-3下拉分析中检测了AIP1-N-与14-3-3的相互作用。结果表明，14-3-3不与AIP1-N结合（图​（图5b）。5b） ●●●●。在对照实验中，ASK1如前所述与GST–14-3-3结合(6). 这些数据有力地表明，AIP1可以在体内从ASK1解离14-3-3。

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图5

EC中AIP1的过度表达从ASK1释放14-3-3。(一)AIP1使14-3-3与ASK1解离。用FLAG标记的14-3-3（1μg）表达质粒转染BAEC，转染不同数量的FLAG–AIP1-N DNA（0、0.1、0.25、0.5、0.75和1μg。AIP1和14-3-3与内源性ASK1的相关性通过用抗ASK1进行免疫沉淀，然后用抗FLAG进行蛋白质印迹来确定。免疫沉淀物中的ASK1用抗ASK1蛋白免疫印迹法测定。(b)AIP1-N不与14-3-3结合。表达AIP1-N的细胞裂解物用于GST-14-3-3下拉分析。免疫印迹法检测结合AIP1-N蛋白。ASK1被用作对照。

AIP1优先与Ser-967的去磷酸化ASK1结合。

之前我们已经证明14-3-3通过pSer-967与ASK1相关，TNF-α通过在Ser-967处去磷酸化ASK1部分激活ASK1，导致14-3-3的释放。为了确定AIP1如何介导TNF-α诱导的ASK1 14-3-3的释放，我们进行了一系列实验，以检查pSer-967在AIP结合中的作用。首先，我们检测了AIP1与ASK1-S967A的关联，如前所示，ASK1是一种在14-3-3结合中缺陷的突变型ASK1(6). 将AIP1-N与BAEC中的ASK1或ASK1-S967A共转染，用抗ASK1免疫沉淀法检测AIP1-N-与ASK1的关联性，然后用抗FLAG免疫印迹法检测其关联性。结果表明，AIP1与ASK1-WT和ASK1-S967A都有很强的相关性，其中ASK1-S977A更强（图​（图6a）。6a） ●●●●。这些数据表明ASK1的pSer-967对AIP1结合并不重要。

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图6

AIP1优先与Ser-967的去磷酸化ASK1结合。(一)ASK1中的14-3-3结合位点（pSer-967）对AIP1关联并不重要。AIP1与载体控制ASK1或ASK1-S967A共转染，后者是14-3-3结合缺陷的突变体。用抗ASK1免疫沉淀法检测AIP1和ASK1的相互作用，然后用抗FLAG免疫印迹法检测其相互作用。S/A，ASK1-S967A。(b)磷酸酶处理增加AIP1-ASK1复合物。将含有ASK1和AIP1-N的细胞裂解物与碱性磷酸酶（10 U PPase/40μg细胞裂解物）在室温下培养1小时。处理后的裂解产物通过抗ASK1的IP进行处理，然后通过抗FLAG的Western blot进行处理。GST–14-3-3下拉试验被用作磷酸酶治疗的对照。Western blot结合抗FLAG检测结合ASK1。(c（c）)肽特异性。在存在肽ASK1-S或ASK1-pS（0.3 mM）的情况下，ASK1用于GST-14-3-3下拉分析。Western blot结合抗FLAG检测结合ASK1。(d日)AIP1-ASK1相互作用的肽竞争分析。含有ASK1和AIP1-N的细胞裂解物用于免疫沉淀分析，如一在存在肽ASK1-S或ASK1-pS（0.3 mM）的情况下。用抗ASK1免疫沉淀法检测AIP1和ASK1的相互作用，然后用抗FLAG免疫印迹法检测其相互作用。

过度表达的ASK1-WT可能以磷酸化和去磷酸化形式存在于Ser-967位点。为了区分哪种形式的ASK1与AIP1相互作用，我们用碱性磷酸酶（PPase）处理ASK1。用PPase处理含有ASK1-WT和AIP1-N的细胞裂解液（室温下10 U PPase/40μg细胞裂解液1小时）显著增加AIP1-ASK1复合物的形成，如免疫沉淀分析所测（图​（图6b）。6b） ●●●●。相反，在GST-14-3-3下拉测定中，PPase处理显著降低了ASK1与14-3-3的结合（图​（图6b）。6b） ●●●●。这些数据表明，AIP1优先与去磷酸化的ASK1结合。

为了进一步确定ASK1的pSer-967在AIP1结合中的作用，我们使用ASK1 pSer-96715肽侧翼进行了肽竞争分析（AEYLRSIS公司⁹⁶⁷LPVPVLV）分为两种形式：非磷酸化肽（ASK1-S）和磷酸化肽。在存在0.3 mM ASK1-S或ASK1-pS的情况下，通过GST-14-3-3下拉试验首次确定了ASK1结合的肽特异性。正如预期的那样，ASK1-pS（而非ASK1-S）阻断了ASK1-与GST-14-3的结合，证实了14-3-3通过pSer-967与ASK1的结合（图​（图6c）。6c） ●●●●。然后我们检查了这些肽对AIP1-ASK1复合物形成的影响。AIP1和ASK1在内皮细胞中共表达，在ASK1-pS或ASK1-S存在下用抗ASK1免疫沉淀法测定AIP1-ASK1复合物。用抗FLAG免疫印迹法测定相关AIP1。与14-3-3下拉试验的结果相反，ASK1-S（而非ASK1-pS）破坏了AIP1-ASK1复合物（图​（图6d）。6d） ●●●●。这些数据表明，AIP1与围绕14-3-3结合位点的序列结合，优先于Ser-967处ASK1的去磷酸化形式。

AIP1增强TNF-α诱导的ASK1-JNK活化。

为了确定AIP1是否促进14-3-3从ASK1中分离，从而提高ASK1的生物活性，我们检测了AIP1对ASK1激酶活性、ASK1诱导的JNK激活和EC凋亡的影响。我们首先确定了AIP1对TNF-α诱导的ASK1-JNK活化的影响。在没有或存在TNF-α治疗（10 ng/ml，持续15分钟）的情况下，用AIP1构建物（AIP1-F、AIP1-N和AIP1-C）转染BAEC。AIP1的表达通过Western blot和抗FLAG测定（图​（图7a）。7a） ●●●●。ASK1蛋白由抗ASK1免疫沉淀，AIP1对免疫复合物中ASK1活性的影响通过以GST-MKK4（JNKK1）为底物的体外激酶分析测定。结果表明，AIP1-N显著增加ASK1活性，AIP1-F的增加幅度较小，但AIP1-C没有这种作用（图​（图7b，7b、 顶部面板）。这与AIP1与免疫复合物中ASK1相关的能力一致（见图​图1）。1). 用GST-c-Jun作为底物，通过体外激酶试验测定ASK1诱导的JNK活化。结果表明，仅AIP1的表达并没有显著激活JNK（图​（图7b，7b、 车道1-4）。然而，AIP1-F和AIP1-N（但不是AIP1-C）显著增强了TNF-α诱导的JNK激活（图​（图7b）。7b） ●●●●。AIP1-N表现出比AIP1-WT更强的增强ASK1活性的能力，这与其与ASK1的结合一致（图​（图7b）。7b） ●●●●。最后，我们测定了AIP1对ASK1诱导的EC凋亡的影响。在没有或存在ASK1的情况下，用AIP1构建物（AIP1-F、AIP1-N和AIP1-C）转染BAEC。转染48小时后，ECs用DAPI染色以检测凋亡细胞，在荧光显微镜下显示细胞核碎裂。结果显示，AIP1-N显著增加ASK1诱导的EC凋亡（增加2.8倍）（图​（图7c）。7c） ●●●●。AIP1-C的共表达抑制了AIP1-N的活性，这与AIP1-C-可以与AIP1-N形成复合物的事实一致（见图​图44).

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图7

AIP1增强TNF-α诱导的ASK1活性。(一和b)AIP1增强TNF-α诱导的ASK1和JNK活化。BAEC通过载体控制（–）或AIP1构建物（AIP1-F、-N或-C）转染。细胞裂解物用于通过抗FLAG的Western blot测定蛋白质表达(一)ASK1和JNK活化通过体外激酶分析测定(b). 每条车道下方显示了相对的ASK1和JNK活动（将TNF-α处理的病媒控制设置为1.0）。(c（c）)AIP1增强ASK1诱导的EC凋亡。在没有或存在ASK1的情况下，用载体控制（–）或AIP1构建物（AIP1-F、AIP1-N和AIP1-C）转染BAEC。转染48小时后，用DAPI对细胞进行染色，并在荧光显微镜下计数细胞核断裂的凋亡细胞。显示凋亡率。所提供的数据是三个独立实验的平均值。不适用，AIP1-N+AIP1-C(d日)AIP1抑制TNF-α诱导的ERK激活。用AIP1构建物转染内皮细胞，然后进行TNF-α刺激（10 ng/ml，15分钟）。用磷酸化-ERK抗体进行Western blot检测ERK激活。用抗ERK蛋白免疫印迹法测定总ERK。另外两个独立实验也得到了类似的结果。(e（电子）)AIP1增强的ASK1激活需要ASK1结合和AIP1的GAP活性。AIP1构建物在HA-tagged ASK1存在的情况下转染BAEC。蛋白表达通过Western blot和抗HA（ASK1）或抗FLAG（AIP1）测定。ASK1诱导的JNK活性测定如b。所示数据代表了三个类似实验。

我们进一步研究了ASK1结合基序和GAP活性在AIP1增强ASK1活性（JNK激活）中的作用。我们选择AIP1-KA2（ASK1结合缺陷）和AIP1-RL进行研究。我们之前发现AIP1同源物（大鼠DIP1/2）对Ras具有GAP活性，抑制EGF诱导的ERK激活；GAP域的点突变（R220L，相当于人类AIP1 R289L）降低了GAP活性(15). 我们首先研究了AIP1 GAP对TNF-α诱导的内皮细胞ERK激活的影响。使用脂质体2000用AIP1构建物（AIP1-F、-N、-KA1、-KA2和-RL）转染BAEC，通常获得90%的转染效率。如前所述，这种高转染效率使我们能够检测转基因对内源性蛋白质活性的影响(7,20). 将转染的内皮细胞进行血清饥饿处理，然后用TNF-α刺激（10 ng/ml，15分钟）。用磷酸化-ERK抗体进行Western blot检测ERK激活。结果表明，TNF-α显著诱导ERK激活（图​（图7c），7c） ，如前所述(21). AIP1-N在抑制TNF-α诱导的ERK激活方面比AIP1-F强得多，这表明AIP1-N是一种组成型活性形式（图​（图7d）。7d） ●●●●。C2结构域内赖氨酸簇1的突变（AIP1-KA1）对AIP1-N活性没有影响。然而，在ASK1结合（AIP1-KA2）或GAP活性（AIP1-RL）方面有缺陷的AIP1-N突变体抑制TNF-α诱导的ERK激活的能力显著降低（图​（图7d）。7d） ●●●●。这些数据表明，AIP1作为GAP发挥作用，抑制内皮细胞中TNF-α诱导的ERK，AIP1的ASK1结合活性和GAP活性对这种抑制活性至关重要。

然后我们检测了这些AIP1突变体对ASK1活性的影响。在存在HA标记的ASK1的情况下，用AIP1构建物（AIP1-F、-N、-KA1、-KA2和-RL）转染内皮细胞。我们使用HA-ASK1分离ASK1和AIP1-F，因为两者非常接近。如前所述，通过体外激酶测定测定ASK1诱导的JNK活化。结果表明，ASK1结合（AIP-KA2）或GAP活性（AIP1-RL）缺陷的突变体未能增强ASK1活性（图​（图7e），7e） 表明AIP1与ASK1的关联以及AIP1的GAP活性是AIP1诱导ASK1激活所必需的。

我们感谢Gregory J.Hannon（冷泉港实验室）提供的pShag载体。我们感谢Jeff W.Streb和Chad Kitchen在RNA干扰设计和RNA保护分析方面提供的技术援助。我们感谢布拉德福德·C·伯克对手稿的讨论和批判性阅读。这项工作得到了NIH拨款1R01 HL-65978-01（给W.Min）的支持。