瘦素和脂联素的作用

动物模型在体内研究

四周大fa/fa这些老鼠及其瘦小的室友是从Charles River Laboratories（马萨诸塞州威明顿）购买的。动物在12:12小时光照：暗循环的温度控制环境（20至22°C）中再饲养4周，并喂食随意Purina Laboratory Chow（密苏里州圣路易斯Ralston Purina）和水。胆管结扎（BDL）方案得到了埃默里大学动物护理和使用委员会的批准。将大鼠分为四组(n个=10）：BDL（贫，或LLB），BDL(fa/fa，或FFB）(n个=10）、混合操作（精益，LLN）和混合操作(fa/fa或FFN）。如别处所述进行BDL或假手术。30

手术后21天，我们对大鼠进行麻醉，通过右心房建立静脉通路，并使用16号静脉导管建立门静脉通路。为了计算每只大鼠的瘦素浓度，在结扎腔静脉后，从门静脉采集1ml全血，从右心房采集1ml肝静脉血。进行全肝切除，并对动物进行放血。对采集的肝脏进行称重，将部分肝脏在液氮中进行snap冷冻，或放置在福尔马林固定剂和石蜡包埋物中进行染色和免疫组织化学分析。用全血血清测定碱性磷酸酶、总胆红素、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶。血清化学由埃默里大学兽医资源系的系列多通道分析仪进行。

瘦素和脂联素免疫分析

使用乙二胺四乙酸作为抗凝剂收集血浆。制造商提供的对照品与样品同时运行。所有分析均按照Linco Research（密苏里州圣查尔斯）的标准重复进行三次。制造商还协助进行了这些测定。

α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的苦味酸红染色和免疫组织化学染色

如其他地方所述，使用Picrosirius红染色来检测胶原原纤维。31石蜡包埋组织在6μm处切片。将脱蜡切片置于95%乙醇中，并在双蒸馏水中彻底冲洗。用抗α-SMA（1:800）在4°C的密闭湿度室中进行初步培养36至48小时。

幻灯片使用尼康E1000M显微镜（纽约州梅尔维尔）观看，并使用Cool Snap彩色数码相机（德国Roper Scientific GmbH）拍摄。通过形态计量分析对Picrosius染色或α-SMA染色的肝脏切片中的胶原蛋白进行定量分析。所有图像均使用Image-ProPlus 4.5版进行量化，该版本是Media Cybernetics（马里兰州Silver Spring）的商用软件包。使用为每个显微镜物镜校准的Image Pro Plus微距自动对组织切片进行成像。

所有切片均由同一人检查，每个肝脏切片检查10个随机感兴趣的区域，这些区域通过计算机生成的现场识别进行识别。执行胶原蛋白定量分析的操作员无法识别所检查的各个载玻片。每个治疗组至少对5只动物的15个不同肝脏切片进行检查。幻灯片上的组织切片使用预先选择的阈值进行自动扫描，从而将捕获的亮场图像数字化为一系列图像元素（像素）。从每张幻灯片的特定部分中选择感兴趣的区域，并根据幻灯片标签中的计数记录组织部分的位置。然后在随后的每张幻灯片上分析类似的部分，并保存图像以供分析。存储背景图像并从每个感兴趣的捕获区域中减去。胶原蛋白和α-SMA的数据均表示为组织切片中肝脏总面积的平均百分比：总染色面积除以玻片总面积（μm²)并乘以100得出染色面积的百分比。该计算结果确定了胶原蛋白纤维的染色面积百分比，从而在连续尺度上提供了定量值。在使用抗α-SMA抗体染色的6μm切片上进行相同的图像分析。

α-SMA阳性细胞检测瘦素的免疫组织化学

石蜡包埋组织在6μm处切片并脱蜡。将脱石蜡切片置于95%乙醇中，并在双蒸馏水中彻底冲洗。为了检测瘦素，将载玻片在10 mmol/L柠檬酸钠（pH 6.0）中煮沸5分钟，然后再冷却20分钟。3%的H溶液₂O（运行）₂在KPBS（磷酸钾缓冲盐水；Sigma）中制备，用于玻片培养10分钟，用于随后的清洗。用亲和素试剂孵育载玻片15分钟，然后清洗，然后用生物素孵育15分钟，再清洗。在4°C的密闭湿度室中，用抗α-SMA（1:800）初步培养36至48小时。

在室温下使用生物素化二级抗体（1:600）1小时，并将载玻片与单独的四氯化二氨基联苯胺（DAB）或硫酸镍-DAB（NiDAB）孵育20分钟。如前所述，监测载玻片的颜色沉淀物和抗瘦素（1:200），对组织进行染色，以检测抗α-SMA。用Nova Red底物代替DAB或NiDAB底物检测瘦素。随后在苏木精中对载玻片进行复染，在酸中进行脱色，并准备进行检查。幻灯片由尼康E1000M显微镜观看，并由Cool Snap彩色数码相机（Roper Scientific）拍摄。IPLab（Scanalytics，Fairfax，VA）用于图像分析。

BDL后全肝实时定量逆转录酶聚合酶链反应（RT-qPCR）检测胶原蛋白、瘦素和α-SMA

使用Trizol试剂（Invitrogen）从BDL损伤大鼠的整个肝脏或HSC中获得总RNA。如前所述，使用寡核苷酸和随机六聚体引物以及Maloney小鼠白血病病毒逆转录酶制备cDNA模板。32在逆转录反应后，通过聚合酶链反应扩增cDNA模板塔克聚合酶（Invitrogen）。下列基因如表1进行实时RT-PCR分析，并根据18srRNA对其丰度进行标准化表1跨越两个内含子以防止基因组DNA扩增。

为了区分特异性PCR产物与非特异性产物和引物二聚体，使用了熔融曲线分析。33,34因为不同的DNA产物在不同的温度下熔化，所以有可能区分真正的产物与引物二聚体或非特异性产物。事实上，PCR引物的使用非常谨慎，因为它只产生一个产物，这是一个经验过程，通常需要设计几个引物对。所有PCR产物均通过测序染料终止技术进行验证；产品在1%琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色，并用紫外线照射拍照。为了定量，我们使用实时RT-PCR（LightCycler；Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany），使用SYBR绿色作为荧光团（Moleculator Probes，Eugene，OR）。

原代HSC的分离和培养

如别处所述，分离出静止的星状细胞。35Sprague-Dawley大鼠购自（马萨诸塞州波士顿Charles River）。所有大鼠都接受了人道护理，埃默里大学动物护理和使用委员会批准了HSC隔离方案。简言之，就地用20mg/dl的Pronase（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）灌注肝脏，然后用胶原酶（Creecent Chemical，Hauppauge，NY）灌注，分散的细胞悬浮液在8.2%和15.6%Accudenz（Accurate Chemical and Scientific，Westbury，NY）的不连续密度梯度上分层。由此产生的上层由95%以上的HSC组成。将细胞置于含有20%FBS的改良培养基199 OR中（伊利诺伊州纳珀维尔Flow Laboratories）。通过α-SMA在单层中的免疫定位以及固有自体荧光来评估细胞纯度。所有细胞的生存能力通过相控显微镜进行验证，以及排除碘化丙啶的能力。用于实验的培养物的细胞存活率大于95%。分离后7至10天，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养物中的次级流入活化细胞（75%）两次，并用0.1%FBS和1%青霉素在Dulbecco改良Eagle's培养基中饥饿血清16小时。

静态和活化星形细胞中瘦素和脂联素的免疫印迹分析

培养激活的HSC和静止的HSC，在肝脏灌注后立即采集，在PBS中洗涤，并在冰镇RIPA缓冲液（10μmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L-乙二胺四乙酸，1%Nonide P-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，和蛋白酶抑制剂混合物，10μL/ml；Sigma）中再次悬浮30分钟。HSC裂解物在4°C下以14000 rpm离心30分钟。采集上清液，并使用Bradford试剂（Sigma）测定蛋白质浓度。36蛋白质在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（50μg/lane）上被分解，并被转印到硝化纤维素膜上。37用Ponceau S（0.1%）对膜进行染色，以验证蛋白质的均匀负载和转移。用1%牛血清白蛋白在TBS-Tween 20（20 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5），137 mmol/L-NaCl，0.05%Tween-20）中封闭后，在室温下将膜与一级抗体孵育3小时。用相应的辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:5000）检测特异性抗体结合（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。通过β-肌动蛋白免疫印迹（稀释，1:2000）控制等蛋白负荷。为了验证HSC在静止表型方面的激活，还进行了α-SMA的免疫印迹（稀释，1:2000）。为了检测AdipoR1和AdipoR2，除了在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上加载100μg/条蛋白质，然后按照前述方法转移外，完全按照上述方法进行免疫印迹分析。37使用SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒（Pierce，Rockford，IL）显示免疫反应蛋白，然后暴露于X射线胶片（Kodak，Rochester，NY）。

用表达FLAG-标记全长脂联素（fAd）的哺乳动物表达载体转染HSC

表达载体pcDNA-Ad-F（中国香港大学徐爱民博士赠送）编码全长脂联素，其C末端带有FLAG表位标签，转染到HSC和COS-7（如其他地方所述，用作脂联素生成的阳性对照）29)使用LipofectAMINE Plus（Invitrogen）。约60%的融合HSC转染了4μg质粒DNA。观察到细胞在48小时后将脂联素分泌到无血清培养基（SF）中。从转染细胞培养物中获取培养基，用于联合免疫沉淀。用4μl抗FLAG培养基培养，混合物在4°C下旋转8小时，然后添加20μl（填充体积）抗FLAG-M₂-琼脂糖珠在4°C下培养过夜。通过离心收集珠子，并用1.5 ml冰镇RIPA缓冲液和市售蛋白酶抑制剂混合物洗涤两次。如前所述，通过免疫印迹证实了该蛋白的身份。

免疫印迹法检测脂联素存在下溴脱氧尿苷（BrdU）掺入对DNA/细胞增殖的定量及脂联素作用下α-SMA和PCNA的表达

使用酶联免疫吸附试验（BrdU细胞增殖试验；加州圣地亚哥Calbiochem）进行BrdU掺入分析。约5×10²将HSC培养在96个平板中，转染0.1μg/孔质粒DNA（pcmAdF或pcDNA3.1作为载体对照）3小时。HSC可以在完全培养基（含10%FBS）中生长24小时。生长24小时后，HSC接受血清饥饿（SF培养基，0.1%FBS），作为增殖的阴性对照。一些HSC用血清（含10%FBS的完全培养基）处理，作为增殖的阳性对照。添加BrdU，并使用制造商提供的抗BrdU抗体进行免疫检测。通过分光光度法（AD340，Beckman-Colter）对所得免疫复合物进行定量。颜色强度根据增殖细胞的数量进行标准化。进行了相同的实验，以从100 mm^三PCNA和α-SMA免疫检测板。

脂联素诱导HSC凋亡程度的免疫细胞化学研究

培养激活的HSC以2×10的密度生长^三，并转染1.0μg pcmAdF或pcDNA3.1或pEGFP-N1（以评估转染效率和用于载体控制的活HSC）。HSC在完全培养基中生长48小时，然后固定HSC。用10%的正常驴血清在含0.2%Triton X-100的Tris缓冲盐水（TBS）中在25°C下封闭固定HSC 1小时。随后，将载玻片与抗FLAG（脂联素标记有FLAG）、兔多克隆抗体（1:200）在1%的正常驴血清中与吐温（TBST）或抗α-SMA（1:200小鼠单克隆抗体）在4°C下孵育过夜。二级抗体处理后，在25°C下用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（1:500）孵育1小时，用酪氨酸酶信号放大（TSA）-Plus试剂孵育带有FLAG标记的载玻片，并用氰（红染色）系统标记；并且，按照制造商的说明，将α-SMA标记的载玻片与标记有荧光素（绿色染色）的TSA-Plus试剂在25°C下孵育15分钟。最后，在25°C下用Hoechst（2.5 mg/ml）对载玻片染色3分钟，38安装，并在荧光显微镜下检查。使用Hoechst和绿色荧光（GFP阳性）细胞数量（用于载体控制）和红色荧光（FLAG阳性）细胞（用于pcmAdF）对所有转染细胞的细胞存活率或凋亡百分比进行评分。利用每个转染样品10个微区的数据计算转染效率，在三次独立测定中发现转染效率为18±1.2%。FLAG-阳性HSC与10个微区的凋亡细胞（Hoechst-阳性）共定位，计算凋亡率，并观察α-SMA阳性染色。

基质胶对造血干细胞静止的维持及全长脂联素（fAd）和球蛋白脂联素（gAd）对造血干细胞的治疗

新鲜分离的HSC首先通过塑料培养激活2天到1周，然后在胰蛋白酶化后再悬浮。通过离心法回收细胞，在含有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中洗涤两次，然后如其他地方详细描述的那样，在生长因子诱导的Matrigel（Becton Dickinson，加利福尼亚州山景城39初始密度为1×10⁶/ml，并保持在37°C。在Matrigel上培养静止的HSC，以及在塑料上培养激活的HSC。在SF-Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养16小时，以阻止细胞生长。用10μg/ml的重组fAd或gAd处理血清饥饿的静止和活化的HSC 48小时。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和裂解半胱氨酸蛋白酶3（p19）的免疫印迹分析

HSC生长在Matrigel或塑料上，在无血清（SF）培养基中无血清培养16小时，然后进行脂联素或如上所述的血清治疗。通过用橡胶细胞刮板破坏细胞单层，然后用Dispase（10 mg/ml，Sigma，37°C）处理15分钟，从Matrigel中回收HSC。回收的HSC重新悬浮在含有商用蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的100μl细胞裂解缓冲液（cell Signaling，Beverly，MA）中。如前所述，对来自不同处理的等量HSC蛋白裂解物（100μg/条）进行电泳和转印。使用抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和裂解半胱天冬酶3的多克隆抗体（1:1000）进行免疫印迹，免疫检测如文中所述。

gAd或fAd存在下的细胞活力测定

使用商用试剂（罗氏试剂）估算XTT[2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四氮唑-5-羧基苯胺]的还原量，并根据制造商的说明进行细胞活性分析。在塑料上生长的三天龄HSC以及培养激活的初级HSC（从隔离时算起的第二代）在塑料或Matrigel-to保持静止的状态下进行电镀，初始密度为2×10^三细胞/孔，血清饥饿过夜，然后在SF条件下单独治疗，10%FBS，gAd或fAd（10μg/ml）在SF培养基中48小时。将XTT标记试剂添加到每个培养孔中，以达到0.3 mg/ml的最终浓度。在37°C下暴露4小时后，使用96 well平板阅读器（PowerwaveX 340；新泽西州Summit的Bio-Tek Instruments）在450和690 nm处测量吸光度。初步实验证实，所有实验中使用的细胞密度均在XTT分析的线性范围内。使用1×10的细胞密度绘制标准曲线^三至1×10⁶，并且相对于细胞的数量来计算结果。

瘦动物，但不包括fa/fa大鼠，在受到BDL影响时有大量胶原纤维和桥接纤维化

图1显示21天BDL期后代表性肝脏切片的天狼星红染色。正如预期的那样，假手术对照组的胶原纤维局限于门静脉三联体或中央静脉(图1，A和B; 黑色箭头）。BDL-operated中的类似发现fa/fa老鼠如图所示图1C相反，接受BDL治疗的瘦鼠有明显的纤维化（图1D），包括门户-门户桥接(图1D，蓝色箭头），随着结节的发展，如图所示。这些数据代表了每组10只动物，其中每个治疗组的5只动物在一系列实验中进行了定量组织形态计量学检查，如图1E.

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图1

成熟胶原蛋白的Picrosius红色染色显示瘦肉中有显著沉积，但不是fa/fa，大鼠接受BDL。苦味酸红染色显示主要在支撑结构周围发现胶原沉积(A类–C类,黑色箭头).医生：显示胶原蛋白沉积的典型图像(黑色箭头)以及广泛的桥接性纤维化(蓝色箭头)过渡到肝硬化。电子邮箱：直方图，表示扫描的胶原纤维平均百分比/载玻片总面积的图像定量，单位为μm²±根据材料和方法中的描述确定的SEM*P（P）<0.05，比较了贫BDL与非正常运行或fa/faBDL大鼠。原始放大倍数，×10(D类).

BDL-Operated Lean，但非fa/fa肝切片的免疫组织化学显示显著的α-SMA染色

图2、A、B、C和E，显示最小的α-SMA染色，正如预期的那样，仅限于肝血管的支撑结构。图2，低功率（图2D）在高功率下（图2F），显示肝小叶中富含α-SMA，其模式类似于图1D其中存在显著的桥接性纤维化。图2G是一个代表性的定量组织形态计量直方图，用于对各个治疗组的肝脏切片进行α-SMA免疫染色，这证实了与所有其他治疗组相比，α-SMA显著增加。

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图2

低倍和高倍放大免疫组化分析瘦肉和fa/faBDL大鼠。A类和B类：Shamoperated的代表性显微照片fa/fa瘦小的窝友在血管支撑结构附近显示α-SMA染色。C类和电子邮箱：BDL操作的代表性显微照片fa/fa低倍放大的大鼠(C类)和高倍放大(E类)显示与上述两种情况相似的染色模式fa/fa治疗组。D类和传真：BDL手术的瘦动物免疫组织化学染色的代表性显微照片。低功率(D类)和高功率(F类)α-SMA可见明显的小叶染色。德国：α-SMA阳性细胞的平均定量百分比/扫描的总载玻片面积，单位为μm²±各动物组的SEM，如材料和方法所述*P（P）<0.05，比较了贫BDL与非正常运行或fa/faBDL动物。原始放大倍数：×10(A–D); ×20 (E类,F类).

BDL-Operated Lean大鼠肝静脉中瘦素（而非脂联素）升高

图3是从BDL-operated lean和fa/fa大鼠平均瘦素水平（图3A）和脂联素（图3B）处死前所有受检动物的肝静脉（HV）和门静脉（PV）中的浓度。中显示的数据图3A提示瘦素在BDL诱导的肝纤维化中的来源是损伤的肝脏。计算平均循环瘦素浓度，以排除门静脉循环中人为高浓度的瘦素，从而确定肝脏本身在暴露于慢性损伤时是否会产生瘦素。虽然预计fa/fa干扰了信号传递能力的大鼠，也会从外周脂肪生成中产生高循环瘦素，我们未能检测到BDL操作的肝静脉中显著升高的瘦素水平法/比较fa大鼠门脉循环中瘦素的平均浓度。然而，与瘦BDL队列的门静脉平均瘦素浓度相比，从瘦BDL手术大鼠肝静脉测得的瘦素平均浓度显著升高。与门静脉浓度相比，BDL组瘦动物肝静脉中的瘦素增加了1.5倍(*P（P）< 0.05). 瘦肉组和非瘦肉组的循环瘦素或脂联素浓度无显著差异fa/fa假手术动物（数据未显示）。与这些大鼠门静脉的平均脂联素浓度相比，瘦BDL大鼠肝静脉脂联素的浓度也没有显著差异（图3B）。尽管fa/faBDL操作的脂联素肝静脉浓度似乎在门静脉上方增加，这些数据没有达到统计学意义(P（P）= 0.06,图3B). 这些数据表明，肝脏可能是肝损伤中瘦素生成的重要来源，这些数据与图4和图5.

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图3

BDL手术后肝静脉中瘦素而非脂联素释放的百分比增加fa/fa以及它们的瘦弱的同窝伙伴。如材料和方法所述，采用放射免疫分析法测定瘦素和脂联素。在处死前对门静脉（PV）和肝静脉（HV）进行测量，并计算平均差值以评估平均循环瘦素和脂联素浓度。这里显示的是肝静脉中瘦素和脂联素浓度相对于门静脉瘦素或脂联素水平增加的百分数，取100%。与PV相比，只有接受BDL治疗的瘦弱窝友的HV瘦素水平显著增加1.5倍(*P（P）< 0.01). HV和PV的瘦素浓度差异在fa/faBDL组大鼠。脂联素也是如此，如图4B，瘦肉型BDL和fa/faBDL大鼠组(P（P）= 0.06;n个=每个治疗组10，瘦素浓度（单位：ng/ml）。所有来自fa/fa瘦肉组或瘦肉组进行了假手术，瘦素和脂联素在HV和PV上无差异（此处未显示数据）。

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图4

瘦素和α-SMA的免疫组化。如材料和方法中所述，使用双标记技术对瘦素和α-SMA进行免疫整合。α-SMA（在显微照片中标记为“肌动蛋白”）呈黑色（镍二氨基联苯胺底物），瘦素呈砖红色（新星红）。苏木精计数器染色（天蓝色）。具有代表性放大倍数的实验条件副标题的图形：FFN，fa/fa操作不当的(A类); FFB、，fa/fa胆管结扎(B类); LLN，精益半成品(C类); LLB，瘦胆管结扎(D–E型).E类演示(红色箭头瘦素；蓝色箭头，α-SMA）瘦素与α-SMA细胞的共同定位，在图5具有实时RT-PCR和图3A瘦素的酶联免疫吸附测定（见正文）。G公司和高：分别来自LLB和LLN肝切片的无一级抗体的生物素化二级抗体。原始放大倍数，×40(G公司,H（H）).

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图5

RT-qPCR分析四个治疗组全肝中α1（1）胶原、α2（1）胶原蛋白、α-SMA、TGF-β1和瘦素的表达。如条形图所示，四个治疗组中每个治疗组与肝纤维化相关的关键基因的表达。从肝组织中提取的总RNA用于通过实时RT-PCR测定α1（1）胶原、α2（1）胶原蛋白、α-SMA、TGF-β1和瘦素的mRNA表达，如材料和方法中所述。观察到的瘦弱的室友的mRNA表达水平为对照组的100%。结果为平均值±标准偏差，代表每个分析基因在每个治疗条件下的12个反应*P（P）与精益半操作（对照）值相比，<0.05。

受BDL影响的fa/fa大鼠瘦素和α-SMA共定位

免疫组化结果显示瘦素和α-SMA是否会在同一细胞中共存图4.单独使用时，α-SMA会染黑，如图所示图4、A、B和C仅限于支持血管结构。相比之下，无论是病态手术组还是fa/faBDL操作大鼠。这些显微照片是典型的肝脏切片，fa/fa虚假操作，以及fa/faBDL手术大鼠的α-SMA染色有限，无瘦素染色（用红色表示）。图4、D和E，包括低（×100，图4D)和高功率（×400，图4E)放大倍数。在图4E（×400）瘦素染色和α-SMA染色似乎在同一细胞中共存，RT-qPCR证实了这一点图5并且还支持中提供的数据图2这表明，大量活化的HSC不仅是胶原蛋白生成的潜在来源，而且可以增加BDL操作的瘦鼠肝静脉中的瘦素生成。图4、G和H，表示生物素化二级抗体，没有瘦素或肌动蛋白的一级抗体，是低倍的对照，分别显示缺乏砖红色或天蓝色染色。

RT-qPCR显示HSC激活和肝纤维化相关基因的上调

图5表示基因的RT-qPCR数据，这些基因包括α1（I）胶原、α2（I）胶原蛋白、α-SMA、转化生长因子（TGF）-β1和瘦素，这些基因来自于在上述四种治疗条件下从全肝RNA合成的cDNA。在四种治疗条件下，分别从三个完整肝脏的三个样本中获得数据。对瘦BDL手术动物肝脏的RT-qPCR分析表明，与瘦sham-operated大鼠相比，α2（I）胶原基因表达增加2.5倍，α1（I）胶原蛋白基因表达增加3.5倍，α-SMA基因表达增加1.5倍，瘦素基因表达增加1.4倍。所有其他治疗组与瘦肉型假手术对照组相比，这些分子的表达没有显著增加。尽管TGF-β1在肝纤维化发展中的重要性，42我们没有检测到瘦BDL操作动物TGF-β1 mRNA表达的显著增加；并且，TGF-β1的表达在所有四个治疗组之间没有显著差异。

静态和培养激活HSC中脂联素和瘦素的表达及脂联素受体的表达水平揭示了不同的表达模式

我们推断，如果HSC作为脂肪储存细胞，在损伤或培养激活时产生瘦素，那么在静止状态下，这些细胞不仅不能这样做，而且可能会产生脂联素，脂联素可以促进或维持HSC的静止。事实上，从中可以看出图6A脂联素mRNA表达在培养激活的HSC中显著抑制，但脂联素在静止表型中大量存在。更引人注目的是，通过免疫印迹法评估活化的HSC中缺乏脂联素（图6B）.图6A代表对静止和培养激活HSC中瘦素、脂联素和α-SMA表达的RT-qPCR分析。与静止HSC相比，激活HSC中的瘦素和α-SMA分别增加19倍和55倍。另一方面，激活的HSC表型导致脂联素mRNA显著低于静止细胞。免疫印迹研究表明，瘦素和α-SMA存在于活化的HSC中，但并非如预期的那样存在于静止的HSC；而脂联素似乎只存在于静止的HSC中（图6B）因此，虽然激活的HSC合成瘦素，但有趣的是，静止的HSC（而非激活的HSCs）合成脂联素。

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图6

脂联素、α-SMA和瘦素mRNA的表达和各自的蛋白生成揭示了静止和培养激活HSC中的差异表达。答：按照文中所述进行RT-qPCR。将静止HSC中观察到的mRNA表达水平设为对照。结果为平均值±SE，代表星状细胞表型和基因分析的六个反应*P（P）与相应条件下的静止HSC相比，<0.05。B类：静止和激活HSC中脂联素、α-SMA和瘦素的免疫印迹分析。使用新鲜分离的静止和培养激活的HSC制备裂解物，并对脂联素、α-SMA和瘦素进行免疫印迹。β-肌动蛋白作为负荷控制。这些数据代表了多项独立实验。

脂联素受体AdipoR1和AdipoR2均存在于静止和培养激活的HSC中，然而RT-qPCR显示，与静止HSC相比，激活HSC中AR1的mRNA表达减少了近50%（图7A）AdipoR2的表达没有改变（图7A）在两种HSC表型中。AdipoR1和AdipoR2的免疫印迹显示在静止和活化的HSC中都存在这两种受体亚型（图7B）这些结果与HSC应对gAd和fAd的能力一致。25

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图7

AdipoR1和AdipoR2均在静止和激活的HSC中表达。答：按照材料和方法部分所述进行RT-qPCR。与静止细胞相比，AdipoR2的表达水平没有差异。B类：AdipoR1和AdipoR2的免疫印迹分析证实，在静止（Q）和激活的HSC（A）中都存在各自亚型的蛋白质。所有研究均使用单独的HSC裂解物进行三次，一式三份。β-肌动蛋白作为负荷控制。

脂联素导致培养活化的HSC-BrdU掺入减少、PCNA表达减少以及α-SMA减少

为了确定脂联素是否可以干扰活化的HSC活性，我们首先通过转染pcmAdF、，图8是一种典型的免疫印迹法，表明HSC裂解物和分泌的脂联素都是由在SF培养基（pcmAdF-U）中转染pcmAdF所致。在SF条件下转染对照载体（pcDNA3.1-U）或存在具有10%FBS的对照载体均未在HSC裂解物或培养基中产生显著的脂联素。当转染pcDNA3.1的HSC暴露于10%的FBS时，培养基中存在少量脂联素，然而，这可能是由于血清中存在一些脂联素。然而，在相同条件下，HSC裂解液中存在的脂联素却不存在。

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图8

脂联素表达载体（pcmAdF）的转染导致HSC产生脂联素。用三种载体中的一种进行对照实验，以证明脂联素过度表达的后果和相应的对照：pcmAdF（编码全长脂联素的表位）、pcDNA3.1-U（SF条件下的空载体，0.1%）和pcDNA3.2-S（存在10%FBS的空载体）。向量、实验条件和命名也用于后续研究，如图9免疫印迹法检测HSC和培养基中脂联素的表达，以确保HSC的表达和脂联素分泌，如图所示车道1在没有血清的情况下过表达pcDNA3.1-U的HSC中(车道2)在含有10%FBS的HSC中转染pcDNA3.1后，细胞和培养液中均未检测到脂联素，而脂联素表达极低(车道3). 分别显示了三个独立实验的密度测定法，一式三份；β-actin作为负荷控制。

鉴于pcmAdF转染检测到有效的脂联素过度表达，我们使用相同的实验设计来确定脂联素表达是否会改变BrdU掺入，结果显示图9ASF条件下激活的HSC（pcmAdF-U）中脂联素的过度表达导致HSC增殖显著降低，而HSC转染仅使用载体控制（pcDNA3.1-U）。脂联素过度表达可将HSC增殖显著降低至10%，而在含有10%FBS（pcDNA3.1-S）的情况下，转染载体控制的HSC的增殖率高出7倍（图9A）PCNA是另一种细胞增殖标记物，通过pcmAdF转染活化的HSC可显著降低PCNA，α-SMA的表达也显著降低（图9B）; 后者是HSC激活的重要标志。转染对照HSC中缺乏血清确实导致PCNA和α-SMA的减少，但未能实现脂联素转染诱导的显著减少。

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图9

活化HSC中脂联素过度表达显著降低活化HSC增殖和α-SMA含量。答：脂联素表达载体pcmAdF（编码全长脂联素的表位）按照图8并发现减少活化HSC-BrdU掺入。将HSC培养在96 well平板中，每孔转染0.1μg质粒DNA：pcmAdF（编码全长脂联素的表位）、pcDNA3.1-U（SF条件下的空载体）或pcDNA3.3-S（10%FBS存在下的空质粒）。转染24小时后加入BrdU，HSC在有无血清的情况下再生长48小时。如材料和方法中所述，对新合成DNA中BrdU的掺入进行免疫检测，并用分光光度法测定颜色络合物的强度。热量测定结果按照细胞数量进行标准化，并在此绘制为三次独立实验的平均值±SE。脂联素过度表达显著降低HSC增殖至10%，而在10%FBS（pcDNA3.1-S）存在下转染载体控制的HSC的增殖率显著升高*P（P）与转染对照载体（pcDNA3.1-U）的未经处理的HSC相比，<0.01。B类：脂联素载体转染HSC的SF-条件（pcmAdF-U）可降低α-SMA和PCNA的蛋白表达水平。为了确定脂联素对α-SMA和PCNA表达的影响，将HSC增殖标记物、4μg质粒DNA、pcmAdF（编码全长脂联素的表位）或pcDNA3.1（载体控制）转染到100 mm的HSC中^三盘子。48小时后，制备HSC裂解物，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对总蛋白进行定量和解析，然后用α-SMA和PCNA抗体进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷控制。所示为相同的代表性免疫印迹以及结果的密度测定分析。

脂联素不仅降低α-SMA的表达，而且通过免疫细胞化学和Hoechst染色评估其诱导HSC凋亡

我们还研究了脂联素过度表达是否会导致激活的HSC凋亡。免疫染色FLAG标记HSC的荧光显微镜（转染pcmAdF以检测脂联素）（图10A）Hoechst染色显示脂联素过度表达导致细胞凋亡（图10、B和C）.这些数据是量化的（图10E）HSC凋亡百分比除以多个微区转染HSC的总数。具有代表性的图像（图10D）显示α-SMA阳性和FLAG标记HSC的共同定位。来自同一微场的显微照片是三个独立实验的代表，其中每个实验使用10个微场进行定量测定。

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图10

脂联素过度表达诱导α-SMA阳性细胞中HSC凋亡。如文中所述，将培养物激活的HSC生长在室载玻片上，并如前所述转染图8和9.pcmAdF，编码全长脂联素的表位；pcDNA3.1，矢量控制。答：用荧光显微镜观察HSC，以鉴定脂联素和α-SMA阳性细胞；Hoechst染色检测细胞凋亡。38 B类：HSC的代表性荧光显微照片显示存在脂联素阳性细胞，pcmAdF的转染效率为18±1.2%；Hoechst染色显示HSC凋亡小体。抄送：脂联素阳性HSC与Hoechst阳性HSC的共放大。医生：FLAG标记的脂联素阳性细胞也与α-SMA阳性细胞共定位。所有显示的面板来自相同的微场和相同的单元(白色箭头). 条形图中显示的凋亡HSC百分比计算为凋亡细胞数/FLAG标记的脂联素阳性细胞总数，并与成功转染载体对照的凋亡细胞/HSC数（9.4%）进行比较(*P（P）< 0.01). 凋亡HSC的百分比表示三次独立实验的10个高功率场的平均值±SE。原始放大倍数，×400(A类).

我们感谢Donna Suresch女士出色的组织准备和分析。