虽然结直肠癌中发生的分子遗传事件已经知道很多年了，但这些突变所带来的选择性优势仍不清楚(1,2). 在这些突变中，Apc失活是最常见的，似乎是引发结直肠癌的关键早期事件(三). 最近体内利用诱导性基因缺失的研究已经确定了成人肠道中Apc的确切功能(4). 这些研究表明，Apc在促进肿瘤抑制方面有两个主要功能，即控制分化和迁移。
K（K）-ras（拉斯维加斯）在致癌过程的相对早期阶段，约40–50%的大肠肿瘤发生突变，尽管进行了广泛的研究，但这种高频率的主要原因仍不清楚(5). Ras蛋白是原型小GTPase，作为分子开关，将信号从细胞表面（从受体和非受体酪氨酸激酶以及G蛋白偶联受体）传递到细胞核(5). 研究最多的下游效应器途径是有丝分裂Raf-MEK-ERK途径和存活磷脂酰肌醇3-激酶途径。体外研究表明致癌K-ras（拉斯维加斯）是结直肠癌细胞增殖、细胞骨架组织、粘附、运动和侵袭所必需的。在这些研究中，下游Raf-MEK-ERK通路的激活已经被证明，并且该通路的抑制剂已经被证明可以抑制致癌K诱导的表型-ras（拉斯维加斯）(6).
探讨致癌K的作用-体内ras，已经使用了一些策略。大多数依赖于致癌K的转基因过表达-ras（拉斯维加斯）突变体(7). 解释这些研究的一个关键困难是K-ras（拉斯维加斯）通常是突变的，但在肿瘤中不过度表达。因此，致癌K的过度表达-ras（拉斯维加斯）对于简单突变，可能产生非常不同的表型。当绒毛启动子过度表达时，小鼠从8个月大时就发生肿瘤，尽管对正常上皮细胞没有影响(7). 与相同在体外在研究中，在正常和腺瘤组织中都观察到Raf-MEK-ERK的激活。相反，致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）在猴病毒40 T抗原转基因的背景下，脂肪酸结合蛋白启动子仅导致促凋亡表型。在这项研究中，缺乏表型反映了无法看到Raf-MEK-ERK信号上调(8).
设计了更复杂的小鼠模型，其中突变等位基因被敲入内源性基因座。此外，这些突变等位基因已被设计成可以使用组织特异性Cre和诱导性Cre转基因菌株以空间和时间方式控制其表达。其中一个模型涉及致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）漂浮STOP转录盒控制的等位基因(9,10). 这个致癌k-ras（拉斯维加斯）等位基因在转录上保持沉默，直到STOP被Cre重组酶移除。这些模型不仅提供了控制所需敲除突变表达的优势，而且提供了条件敲除等位基因从其内源性启动子表达的事实(9,10).
这些模型用于证明内源性K-ras（拉斯维加斯）癌基因在胚胎或出生后发育的不同组织和不同时间被激活，可在包括肺、胰腺和卵巢在内的各种组织中诱发骨髓增生性疾病和癌(9–12). 到目前为止，还没有关于内源性钾的作用的报告-ras（拉斯维加斯）肠或结肠肿瘤中的致癌基因。亚太区最小值携带致癌K的小鼠-ras（拉斯维加斯）表达需要自发重组的等位基因未能显示与Apc显著不同的任何表型最小值应变，应变(9). 这些观察是否是由于Apc和K之间缺乏协同作用所致-ras（拉斯维加斯）突变或表达致癌K的细胞百分比低-ras（拉斯维加斯）等位基因无法确定。
这里，我们定义了内源性K的作用-ras（拉斯维加斯）通过诱导性cre-lox方法在成人肠道中发现癌基因。我们发现，尽管致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）等位基因对Apc失去K后肠道内稳态或即刻表型几乎没有影响-ras（拉斯维加斯）癌基因确实加速肿瘤的形成和侵袭。重要的是，我们还表明内源性K的表达-ras（拉斯维加斯）肾细胞中的癌基因在肾上皮细胞失去Apc后加速肾癌（RCs）的形成。
结果和讨论
K的激活-ras（拉斯维加斯）不会改变肠道平衡。
我们研究了致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因会改变肠道内稳态。为此，我们交叉了K-ras（拉斯维加斯）(+/LSLV12型)携带条件敲除K的小鼠-ras（拉斯维加斯）V12版本表达需要C介导STOP转录盒消除的等位基因(10) (A类)携带细胞色素p450诱导的AhCre转基因小鼠(13). 在用β-萘黄酮诱导后，AhCre转基因在肠和肝中提供了非常高的外显率Cre介导的重组，随后致癌K-ras（拉斯维加斯）V12版本这些组织中的等位基因。该靶向等位基因还携带IRES-betageo序列，可通过LacZ活性监测Cre介导的重组成功。因此，为了确认STOP盒的切除，我们对整个肠道进行了β-半乳糖染色( B类和C类). 几乎所有肠细胞LacZ染色均呈阳性，表明敲除蛋白K的重组成功-ras（拉斯维加斯）V12版本肠内的等位基因。
致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本对肠道内稳态没有影响。(A类)条件K的转录本示意图-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因。(B类和C类)β-半乳糖在全肠中的表达AhCre公司+/T型;K-ras公司+/+（重量）(B类)以及AhCre公司+/T型;K-ras公司+/LSLV12级（K-Ras）(C类). 注意，肠道从AhCre公司+/T型;K-ras公司+/LSLV12级小鼠几乎完全由LacZ阳性细胞组成，表明Cre介导的K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。(D类和E类)H&E染色部分来自AhCre公司+/T型;K-ras公司+/+（重量）(D类)以及AhCre公司+/T型;K-ras基因+/LSLV12级（K-Ras）(E类)肠。这些样品之间未观察到明显变化。(F类–H（H）)图中显示，两组间的窝大小、有丝分裂和凋亡指数没有改变AhCre公司+/T型;K-ras公司+/+（WT）（填充钢筋）和AhCre公司+/T型;K-ras公司+/LSLV12级（K-Ras）（空栏）肠。上述所有研究均在Cre诱导3天后进行。(我)致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本不影响迁移或S相标记。用BrdU处理小鼠，然后在重组后第3天和第5天分别在2小时或48小时后扑杀。然后对标记细胞相对于地穴底部的位置进行评分，并生成累积分布图。AhCre公司+/T型;K-ras公司+/+（WT）小鼠用黑线表示，并且AhCre公司+/T型;K-ras公司+/LSLV12级（K-Ras）小鼠用红线表示。实线，2小时。虚线，48小时。在任何一个时间点，两种基因型之间都没有观察到差异(P（P）=0.5，Kolmorov–Smirnov）。然而，在实验的48小时内，在两种基因型中均观察到显著的肠上皮细胞迁移(P（P）>0.01科尔莫洛夫-斯米尔诺夫）。(J型和K（K）)对杯状细胞进行阿尔西安蓝染色AhCre公司+/T型;K-ras公司+/+（重量）(J型)以及AhCre公司+/T型;K-ras公司+/LSLV12级（K-Ras）(K（K）)肠。基因型间无显著差异(P（P）=0.4 Mann–Whitney）。（放大倍数：×40。）
接下来，我们描述了表达致癌K的后果-ras（拉斯维加斯）V12版本小肠中的等位基因。组织学分析显示，Cre诱导后3天，隐窝绒毛轴的结构没有发生重大变化。从这些切片中对窝大小、有丝分裂指数和凋亡水平进行评分，发现在诱导后第3天（PI），实验组织和对照组织之间没有显著差异。对于所有比较n个≥3和Mann–Whitney UP（P）值≥0.40( F类–H（H）). 凋亡水平也通过免疫组织化学（IHC）染色活性caspase 3独立确认(14)（未显示数据）。在Cre诱导后的180天内，一直在小鼠中观察到这种未能观察到表型变化的现象。
鉴于先前的数据表明K-ras的致癌激活可能会改变细胞的迁移，我们确定了表达致癌K的细胞是否-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因能够沿着隐窝绒毛轴正常迁移。这种“迁移”是指肠上皮细胞向上迁移，因此与经典的细胞迁移不同。在第3天PI时向小鼠注射BrdU，并在2或48小时后处死。通过比较BrdU阳性细胞沿轴的分布，可以评估沿隐窝-绒毛轴的移动程度。如所示我，表达K的细胞-ras（拉斯维加斯）V12版本与对照组相比（Kolmogorov-Smirnov试验，P（P）= 0.5). 上述2-h BrdU标记实验表明，表达致癌K的细胞-ras（拉斯维加斯）V12版本增殖正常，且隐窝内增殖室的位置和大小与对照组无差异(P（P）=0.4，Kolmogorov-Smirnov）。
通过使用特定染色剂或IHC对照分化细胞类型的标记物，确认所有分化肠细胞系的存在和正确定位。杯状细胞的阿尔西安蓝染色显示杯状细胞数量相似( H（H）–J型); Grimelius染色显示肠内分泌细胞的数量没有显著变化（所有比较n个≥3和Mann–WhitneyU型 P（P）值≥0.39）。paneth细胞的抗溶菌酶染色和绒毛肠上皮细胞的抗病毒染色也显示这些细胞类型的数量或定位没有明显变化（数据未显示）。
K的激活-ras（拉斯维加斯）不会改变Apc丢失后的增殖或凋亡水平。
在结直肠癌中，K-ras（拉斯维加斯）突变发生在亚太区因此我们接下来检查了Cre是否介导致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本影响Apc缺乏症的直接表型。这是通过交叉AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级动物与亚太区飞行/飞行侧面携带loxP的小鼠亚太区580等位基因(15). 产生的结果AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行然后用β-萘黄酮诱导小鼠。
组织学分析显示K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达对先前报道的亚太区不足(4)（图4B类和C类，作为支持信息发布在PNAS网站上）。与WT小鼠相比，窝大小、有丝分裂指数和凋亡水平均增加，但与亚太区-缺陷小鼠（所有比较n个≥3和Mann–WhitneyU型 P（P）值≥0.40）（图4D类–F类). BrdU和Ki67的IHC显示K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达并没有增加细胞周转水平，两种基因型的增殖与位置无关。同样，K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达没有显著改变肠内分泌细胞的数量、paneth细胞的定位错误或Apc丢失后绒毛蛋白表达的减少（数据未显示）。然而，在这之后，杯状细胞的数量得到了显著的拯救亚太区损失[34±14(亚太区飞行/飞行)对113±10(K-ras公司(+/LSLV12级),亚太区飞行/飞行),P（P）=0.04 Mann–Whitney，n个=3]（图4我–J型). 综合起来，这些数据表明亚太区仅损失就足以引起肿瘤早期发生的绝大多数变化，而K-ras（拉斯维加斯）V12版本在这些阶段的表达几乎没有额外的表型。
癌基因K表达后Raf-MEK-ERK和Wnt信号通路未发生失调-ras（拉斯维加斯）V12版本.
鉴于我们未能观察到致癌K表达后的任何表型变化-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因，我们接下来研究Raf-MEK-ERK通路是否被激活。P-MEK和P-ERK的IHC表明，这些磷酸蛋白通常存在于肠上皮细胞的细胞质中，并且致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本单独或在亚太区缺乏，不会影响这些蛋白质的水平或定位（图5一 A类–我，作为支持信息发布在PNAS网站上）。这些观察为我们在K激活后未能看到表型变化提供了分子解释-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。这些数据也反驳了Apc抑制Raf-MEK-ERK通路激活的观点体内，正如最近建议的那样(16). 有趣的是，在杯状细胞细胞核中观察到核P-MEK和P-ERK，这表明该途径可能与杯状细胞分化有关（图5空军). 这也可以解释杯状细胞丢失的部分挽救，我们在亚太区-表达致癌K的缺陷细胞-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因。
接下来我们研究了细胞周期蛋白cyclin D1和p21的表达，也有报道称，在K表达后，这些蛋白表达上调-ras（拉斯维加斯）致癌基因(12). 然而，在K-ras激活后，IHC显示p21或cyclin D1的定位或表达没有变化（数据未显示）。以前的研究表明致癌K-ras（拉斯维加斯）也可能激活Wnt信号(17). 在肠隐窝内，Wnt信号水平对建立细胞定位、分化和增殖至关重要(4). 因此，我们检测了Cre介导的致癌K表达后β-catenin的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本其他正常上皮中的等位基因。在表达致癌K的细胞中，β-catenin的水平或位置均未观察到变化-ras（拉斯维加斯）V12版本由IHC确定（图5一 K（K）–L（左）). 这些数据，再加上未能观察到隐窝动力学的变化或Wnt靶点CD44和C-Myc的上调（WT vs。K-ras公司(+/LSLV12型)Mann–Whitney，定量RT-PCR（qRT-PCR）分别为1.31倍和0.83倍P（P）>0.4），认为Wnt信号没有改变，尽管致癌K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。
我们还确定了K-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因在Apc基因缺失后改变Wnt信号传导。不考虑K-ras（拉斯维加斯）V12版本β-catenin转位到细胞核的表达状态（图5一 M（M）和N个)，导致典型Wnt靶基因CD44和C-Myc的转录激活（WT vs。亚太区飞行/飞行，6.72倍，1.88倍，WT与。K-ras公司(+/LSLV12型),亚太区飞行/飞行qRT-PCR分别为5.33倍和2.72倍。Wnt信号在K后没有增强-ras（拉斯维加斯）V12版本Apc-缺陷细胞中的表达与CD44和C-Myc诱导水平保持不变（qRT-PCR、Mann-Whitney分别为0.79倍和1.46倍变化P（P）> 0.2).
上调Raf-MEK-ERK信号负调控因子。
之前我们已经证明，在Apc丢失后，许多负反馈回路被激活体内(4). 因此，我们观察到Apc丢失后Axin-2、Wisp1、Wif-1和Frizzled 6的上调。然而，在缺乏Apc的情况下，这些蛋白无法阻止Wnt信号的失调(2)（图5是). 在癌基因K表达后存在不同的情况-ras（拉斯维加斯）V12版本许多研究表明，Ras信号通路的激活可以通过降低下游蛋白Raf-MEK-ERK的磷酸化状态而减弱(18). 重要的是，这是开发Raf激酶抑制剂和Ras信号的许多其他下游效应器的理论基础。
进一步探讨致癌钾的分子后果-ras（拉斯维加斯）V12版本表达，我们使用MOE430_2芯片进行微阵列实验，比较对照组和AhCre公司+，K-ras（拉斯维加斯）(+/LSLV12级)肠。通过微阵列分析的显著性分析和5%的错误发现率，我们确定了K的少量特异性变化-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。其中，许多之前与Ras或G蛋白受体信号相关（表1，作为PNAS网站上的支持信息发布）。G蛋白信号传导调节因子-5（RGS5）是Ras信号传导的潜在负调节因子，在阵列中上调，并通过qRT-PCR证实在Cre介导的K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。该蛋白最初是在G蛋白信号调节器的筛选中确定的，并且已经证明可以减弱ERK的激活体内(19,20).
Raf-MEK-ERK途径中研究最多的磷酸酶是Dusp/MKP磷酸酶。我们之前对Apc缺陷肠的微阵列分析表明，在Apc缺失后，Dusp4/Mkp2和Dusp9/Mkp4都上调。为了研究这一点，我们在Apc丧失后对Dusp4进行了IHC，并证实Dusp4在Apc失去后立即上调，并且与K无关-ras（拉斯维加斯）状态（图6，作为PNAS网站上的支持信息发布）。我们还使用qRT-PCR证实了Apc丢失后Dusp9的5倍上调，这与K无关-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。以前的研究表明，K-ras（拉斯维加斯）-胰腺细胞的介导转化在体外可以通过与含有Dusp4的载体共转染来抑制(21). 因此，对Dusp4和Dusp9的放松调控提供了一种现成的机制来解释K后我们所看到的额外表型的缺乏-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。
K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本加速肿瘤发生并导致肿瘤侵袭亚太区损失。
确定K后-ras（拉斯维加斯）V12版本表达对亚太区我们接下来研究了这种致癌等位基因的表达是否会加速腺瘤的出现。的队列(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/+), (AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区+/+), (AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/佛罗里达州)、和(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州)小鼠断奶时用β-萘黄酮（3×80mg/kgβ-萘酚黄酮静脉注射）诱导。该方案有效地使动物WT或构成杂合子亚太区从断奶开始，另外还有WT或K激活-ras。队列老化，直到出现肠道肿瘤症状（贫血、脚苍白、驼背和腹部肿胀）。A类和B类显示肠道内AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12型,亚太区+/佛罗里达州诱导Cre表达后150天，对小鼠进行β-gal活性染色。在整个肠道的正常组织和腺瘤组织中均观察到LacZ染色，这与Cre诱导的条件K的高水平表达一致-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因。所有腺瘤均以核β-catenin为特征，这强烈暗示了其余Apc等位基因的丢失( D类和E类).
内源性K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本加速肿瘤在肠道内的生长和侵袭。(A类)β-半乳糖在全肠中的表达AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州Cre诱导150天后。(B类)特写显示LacZ阳性的蓝色肠道腺瘤。(C类)卡普兰-迈耶曲线显示AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州（红色虚线）和AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州Cre诱导后（蓝线）。致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本快速加速肿瘤发生。(D类和E类)β-catenin重新定位到所有腺瘤细胞的细胞核AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12型,亚太区+/佛罗里达州肿瘤，表明Wnt通路被解除调控。(F类)腺瘤的H&E染色切片AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州鼠标。注意没有任何入侵迹象。(G公司)腺瘤来自AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州肠外表面出现疤痕（用箭头表示），这在AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州小鼠，但未在对照组中看到AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州老鼠。在人类，肿瘤下方的这种外部（浆膜）增厚通常与腺癌而非腺瘤有关。(H（H）和我)腺癌来自AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州显示侵入肌壁（如图中箭头所示我). (J型和K（K）)腺瘤的P-Mek染色AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州鼠标(J型)和aAhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州鼠标(K（K）). 注意，腺瘤中的细胞质P-Mek染色更为强烈AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州小鼠（黑色箭头）与周围正常粘膜（红色箭头）比较。但在AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州腺瘤(J型). (L（左）–N个)前列腺腺瘤的P-ERK 1/2染色AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州(L（左）)以及AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12型,亚太区+/佛罗里达州(M（M）和N个). 注意，核P-ERK 1/2在来自AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州小鼠甚至在大腺瘤中(L（左）). 然而，核染色在一些来自AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州老鼠(M（M）和N个). 黑色箭头显示腺瘤细胞核染色。Wt代表AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区+/佛罗里达州K-Ras表示AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州（放大倍数：D类–N个, ×400.)
C类显示了K的表达式-ras（拉斯维加斯）V12版本术后快速加速肠道肿瘤发生亚太区损失。到165天，21天中有17天（81%）AhCre公司+/T型,K-ras基因+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州动物已成为疾病的症状，并因多发性肠道肿瘤的发展而被淘汰。相反，20人中只有2人（10%）AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/佛罗里达州小鼠有相似的表型（χ2=20.739，df=1，P（P）= 0.0001). 死亡时，肿瘤数量或大小没有显著差异（Mann–WhitneyP（P）>0.4,n个=18和n个=6），表明当小鼠有类似的肿瘤负担时，它们被淘汰。
作为K-ras（拉斯维加斯）癌基因以前与结直肠癌细胞流动性增加有关在体外(6)，我们调查了肿瘤的侵袭状态是否在AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州老鼠。年分析的100个肿瘤中未发现腺癌AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/佛罗里达州老鼠。这些数据整合了Apc中的数据+/分钟小鼠，即使有，也很少进展为腺癌，并且不显示K-ras（拉斯维加斯）突变。然而，100个肿瘤中有17个发生于AhCre公司+/T型,K-ras基因+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州双突变小鼠表现出侵犯平滑肌的形态学证据，被归类为腺癌( F类–我). 侵袭性显著增加（χ2=18.579，df=1，P（P）=0.001）。
接下来我们研究了这种肿瘤发生的增加是否与Raf-MEK-ERK通路的激活有关。以前的研究体内在K-ras（拉斯维加斯）癌基因表达，甚至在肿瘤内(9,12). 虽然我们没有在所有肠腺瘤中发现Raf-MEK-ERK信号的显著激活，但我们确实观察到，在小肠腺瘤（≈10%）中，P-MEK水平较高，偶尔核呈P-ERK阳性AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区+/佛罗里达州老鼠。在AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/佛罗里达州队列。Akt信号通路也没有明显激活，P-Akt的表达模式和水平相似序列-473及其下游效应器mTor序列2448和S6激酶421号线，424号线（未显示数据）。这些数据表明，Raf-MEK-ERK通路的相对低水平激活足以介导K-ras（拉斯维加斯）V12版本致癌基因或其他途径是导致这一结果的原因。
K系列-ras（拉斯维加斯）V12版本癌基因通过同时激活Raf-MEK-ERK和Akt信号通路加速RC。
这个AhCre公司转基因还驱动肾上皮中Cre重组酶的组成型表达，而不会引起亚太区肠内流失。此属性用于驱动纯合子删除亚太区在里面AhCre公司+,亚太区飞行/飞行动物。事实上，这些小鼠在12个月大时会自发发生RC，发病率为30%。这些肿瘤总是显示两者的丧失亚太区等位基因。尽管Cre介导的重组水平较高，但肿瘤发生率相对较低，似乎反映了大多数Apc缺陷细胞以p53依赖性的方式自发缺失(22).
研究K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本癌基因加速了这些小鼠的RC，我们首先检测了来自(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/+), (AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区+/+), (AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区飞行/飞行)、和(AhCre公司+/T型,K-ras基因+/LSLV12级,亚太区佛罗里达州/佛罗里达州)2个月大的小鼠(n个= 12). 此时，在(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区+/+), (AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区+/+)，或(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区飞行/飞行)动物。然而，所有漂浮的Apc小鼠表达K-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行小鼠）除了许多较小的病变外，还表现为RC(A类). 为了进一步分析RC的发病情况，我们对以下人群进行了年龄分组(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区飞行/飞行)和(AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12型,亚太区飞行/飞行)小鼠(n个=10）直到他们出现疾病症状（肿胀、尿血、贫血）。到4个月大时，所有双突变体AhCre公司+/T型,K-ras公司+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行动物生病并被确认患有RC( B类和C类). 此时，在AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区飞行/飞行队列。分子分析显示每个肾脏病变中都有核β-catenin，这意味着WT-Apc等位基因的丢失( D类和E类). P21和cyclin D1在大多数病变中也上调(L（左）和数据未显示）。至关重要的是，我们观察到P-MEK和核P-ERK的上调，表明Raf-MEK-ERK通路在这些肿瘤中被激活( F类–我). 我们还观察到P-Akt上调473系列和下游效应器mTOR2448和S6激酶421号序列/424号序列( J型和K（K）). 由于结节性硬化症抑癌基因的缺失，Akt信号尤其是mTOR的上调先前与RC相关(TSC1类或TSC2系统) (23).
致癌K-ras（拉斯维加斯）V12版本快速加速Apc缺乏引起的肾细胞癌。(A类)肾脏H&E染色切片AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12型,亚太区飞行/飞行2个月大时。注意存在多个肾脏损伤。(B类)宏观图像显示肾形态发生了明显改变AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行3个月大时。(C类)卡普兰-迈耶曲线显示AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12型,亚太区飞行/飞行（虚线）和AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区飞行/飞行Cre诱导后（实线）（对数秩P（P）= 0.001,n个= 10). 全部AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行由于肾脏肿瘤负担，必须在4个月大时淘汰。在这个阶段没有AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/+,亚太区飞行/飞行小鼠出现任何明显的疾病迹象或出现肾肿瘤。(D类和E类)β-catenin上调并重新定位到所有肾脏病变的细胞核AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行老鼠。(F类和G公司)细胞质P-MEK上调，在所有肾脏病变中都观察到。(H（H）和我)P-ERK 1/2上调，在所有肾脏病变中再次观察到AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行老鼠。(J型)P-Akt在肾损伤中的上调AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行老鼠。(K（K）)核P-S6激酶在肾损伤中的作用AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区佛罗里达州/佛罗里达州. (插入)肾脏病变中P-mTOR的上调。(L（左）)p21在肾损害中的上调AhCre公司+/T型，K-ras（拉斯维加斯）+/LSLV12级,亚太区飞行/飞行老鼠。（放大倍数：A类, ×40;B类–L（左）, ×400.)
相对缺乏病变AhCre公司+/T型,K-ras公司+/+,亚太区飞行/飞行处于这些阶段的小鼠表明致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本等位基因允许Apc缺陷细胞在肿瘤发生的早期存活。这与我们之前的研究类似，我们发现p53缺乏也会加速肿瘤的发生，尽管这种影响不如这里观察到的那么明显。K（K）-ras（拉斯维加斯）V12版本表达也可能推动病变增长，因为Apc缺乏的肾脏在3个月时表现为β-catenin阳性灶，但直到数月后才进展为RC(22).
此前的两项研究表明，肿瘤中Raf-MEK-ERK通路激活体内内源性K之后-ras（拉斯维加斯）癌基因激活。值得注意的是，其中一项研究要求子宫内膜样卵巢腺癌PTEN同时缺失(24). 第二项研究是在联合表达致癌K后对胰腺腺癌进行的-ras（拉斯维加斯）等位基因与p53缺失(25). 这些研究与这里提供的数据一起认为，细胞和遗传背景都是K的后果的关键决定因素-ras（拉斯维加斯）突变。观察到的肾、胰腺和肠上皮的差异可能反映了正常肠上皮细胞中的P-MEK和P-ERK染色水平高于正常肾或胰腺上皮。因此，K的影响-ras（拉斯维加斯）突变在组织（如肠上皮）中的侵袭性可能较小，在这些组织中，这些通路通常被激活，并表达适当的反馈回路。有鉴于此，值得注意的是，在Madin Darby犬肾细胞中，活性ERK/MEK信号的缺失使细胞恢复到上皮状态(26).
在肠道中，致癌K-ras（拉斯维加斯）表达导致腺瘤加速发展和侵袭性增加，但只有在亚太区缺陷。后一种效应是值得特别注意的亚太区缺乏是指细胞迁移的完全丧失和TIAM1等蛋白质的同时上调(27)和EphB受体(28). 结直肠癌晚期的标志是蛋白质（包括E-Cadherin和EphB受体）的逐步放松调节，这可能会逆转Apc丢失的结果，从而允许侵袭。我们的数据表明致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）为这种逆转提供了进一步的机制(28).
总之，我们已经阐明了表达内源性K的后果-ras（拉斯维加斯）V12版本肠和肾上皮癌基因。K的表达式-ras（拉斯维加斯）V12版本这些组织中的癌基因本身没有表型结果。然而，亚太区缺乏使这些细胞允许K的致瘤特性-ras（拉斯维加斯）致癌基因。然而，这些组织在钾的特异性贡献方面存在显著差异-ras（拉斯维加斯）V12版本表达式。而肾上皮对钾的影响非常敏感-ras（拉斯维加斯）V12版本在没有亚太区，致癌K的表达-ras（拉斯维加斯）V12版本在肠上皮中对生理影响很小或没有影响，并且不会加重亚太区缺乏。然而，长期来看，致癌K-ras（拉斯维加斯）V12版本表达促进肠腺瘤的形成和侵袭。这些数据显示了对钾的不同组织特异性反应-ras（拉斯维加斯）癌基因，可能反映这些组织中Raf-MEK-ERK途径激活状态的差异。
