鞭毛内转运蛋白IFT20与高尔基复合体相关，是纤毛组装所必需的

标记蛋白质

为了构建GFP标记的IFT20，我们PCR扩增了IFT20的开放阅读框（登录号AAA81518型)从EST克隆AA023464中克隆到pEGFP-N1中，得到pJAF2.13。这会将GFP熔断到IFT20的C端子端。GFP和GST-tagged IFT20是通过扩增pGEX-6p1（Amersham Pharmacia Biotechnology，Piscataway，NJ）的GST开放阅读框构建的，并在pJAF2.13的IFT20和GFP开放阅读框之间克隆该框架以产生pJAF25.7。在p3XFLAG-myc-CMV-26（西格玛，密苏里州圣路易斯）中构建标记IFT20。

哺乳动物细胞培养

IMCD3、NRK和hTERT-RPE细胞（Clontech）在45%DMEM（IMCD3和NRK的高糖，hTERT_RPE的低糖）、45%F12和10%胎牛血清中生长，并在37°C的青霉素和链霉素中在5%CO中生长₂LLC-PK1细胞的培养方法类似，只是它们生长在90%的DMEM（高糖）中，而不是DMEM/F12混合物中。

使用Lipofectamine Plus试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）或电穿孔（Bio-Rad，Richmond，CA）转染细胞。通过向培养基中添加400μg/ml G418（Sigma）或1μg/ml嘌呤霉素（Sigma-）来选择稳定的细胞系。

免疫荧光显微镜

用于免疫荧光显微镜的细胞在酸洗过的玻璃盖玻片上生长。将细胞固定在PHEM中2%多聚甲醛中30分钟（0.05 M管道、0.025 M HEPES、0.01 M EGTA、0.01 M MgCl₂pH 7.2），然后用0.1%Triton X-100在PHEM中萃取2分钟，或用含有0.1%Trito X-100的PHEM预萃取30秒，然后在冷甲醇中萃取10分钟。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行两次短暂清洗后，用1%牛血清白蛋白（BSA）在TBST（0.01 M Tris，pH 7.5，0.166 M NaCl，0.05%吐温20）中封闭细胞1 h，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜或在室温下孵育2 h。然后用1%BSA/TBST清洗细胞四次，持续约30分钟。然后用1:2000稀释的Alexa 350–、488–、594–、633–或680–共轭抗鼠IgG或抗兔IgG（分子探针、尤金、or）培养细胞二级抗体1小时，用1%BSA/TBST洗涤4次，洗涤时间约30分钟，然后用PBS短暂洗涤。如果用凝集素或链霉亲和素标记细胞，则加入二级抗体。然后用ProLong Antifade（分子探针）安装细胞，并用荧光显微镜观察。

使用的主要抗体包括抗微管蛋白（611β1，B-5–1-2，GTU-88，Sigma），抗标志蛋白（Sigma，抗MmIFT20、抗MmIFT52、抗MmIFT57、抗MmIFT88(帕佐尔等人。，2002年a)、抗MmIFT140抗体（B.Walker的礼物）和硬皮病患者血清5051（S.Doxsey的礼物）。通过注射含有与B9和C2片段相等的小鼠多囊蛋白-2部分的麦芽糖融合蛋白，产生多囊蛋白2抗体(蔡等。，1999). Alexa 488–共轭大蜗牛凝集素来自分子探针。

图像由Orca ER相机在配备蔡司100×平面彩色1.4 NA物镜的蔡司Axiovert 200M显微镜上采集（纽约州桑伍德）。图像由Openlab（Improvision，Lexington，MA）拍摄，并在Adobe Photoshop（San Jose，CA）中进行对比度调整。如果要在图像之间进行比较，则这些照片是在相同的条件下拍摄的，并进行了同等的操作。为了定量纤毛中的多囊蛋白-2，使用Openlab的测量工具测量纤毛的长度、面积和平均荧光强度。数据进行了单向方差分析，然后采用Bonferroni-Dunn检验进行事后分析（SuperANOVA，Abacus Concepts，Berkley，CA）。用IFT20抗体和中心体标记物染色的载玻片对中心体上残留的IFT20的数量进行了类似的定量。

活细胞成像

将表达IFT20-GFP（pJAF2.13）的LLC-PK1细胞接种在玻璃底培养皿中。当细胞达到～50%的融合后，培养基变为含有HEPES、无血清、无酚红的生长培养基。在该培养基中放置至少48小时后，使用蔡司Axoivert（如上所述）对细胞进行可视化，使用分级客观加热器将细胞保持在37°C。识别出有绿色纤毛的细胞，然后以0.2秒的曝光间隔0.75秒拍摄34次。这些图像经过对比度调整后，在Metamorph（Universal Imaging，宾夕法尼亚州西切斯特）合成了一部电影。使用10像素宽的选择在Metamorph中生成Kymograph。

为了观察IFT20在细胞体和睫状腔之间的运动，如上所述生长表达IFT20-GFP（pJAF2.13）的IMCD3细胞，并使用定制的高速显微镜和摄像系统成像(里祖托等。，1998). 四十Z轴-以150毫秒的间隔采集堆栈（每个堆栈5个平面，间距200纳米，曝光10毫秒）。三维数据被取消卷积(卡林顿等。，1995)，通过对五个平面求和投影为二维，然后转换为以每秒六帧的速度显示的电影，这接近实时（每秒6.6帧）。

IFT20在细胞周期中与中心体保持联系

为了检测IFT20在细胞周期中的命运，用甲醇固定活跃生长的细胞，并用IFT20、乙酰化微管蛋白、5051硬皮病血清和DAPI抗体标记(图2). 在间期，IFT20抗体染色一个或两个与乙酰化微管蛋白抗体染色共存的小点(图2A） ●●●●。这些斑点还标记有硬皮病患者血清5051，将这些斑点标记为中心体（未发表数据）。IFT20抗体也能染色高尔基复合体，尽管在这些固定条件下，这种结构的保存并不好。当细胞进入有丝分裂期时，高尔基体中的IFT20分散成较小的结构，并在中心体周围结合。中心体在整个细胞周期中标记IFT20(图2，B–E）。

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图2。

IFT20在细胞周期中与中心体相关。（A–E）用甲醇固定活跃生长的哺乳动物RPE细胞，并用抗IFT20（绿色，仅在A′–E′中显示）和抗乙酰化微管蛋白（红色）抗体以及DAPI（蓝色）标记。中心粒/基底体的位置（由5051染色确定，未发表的数据）用箭头标记。请注意，IFT20的明亮焦点与细胞周期所有阶段的中心体有关。尺寸条为5μm，与所有图像相关。

IFT20与IFT复合物B蛋白质相互作用

衣原体IFT20是从鞭毛中纯化出来的，是IFT蛋白大复合体的一部分(科尔等。，1998). 然而，观察到IFT20与哺乳动物细胞中的大多数IFT颗粒蛋白位于不同的细胞隔室，这就对IFT20作为IFT颗粒亚单位的鉴定提出了质疑。为了更直接地测试IFT20和其他IFT颗粒蛋白之间的相互作用，我们构建了IFT20融合GFP和谷胱甘肽的表达结构秒-转移酶（GST）并将其转染到培养的小鼠肾细胞中。IFT20融合GFP作为对照。这些细胞的提取物用谷胱甘肽珠培养，结合蛋白用谷胱甘肽洗脱。IFT52、IFT57和IFT88是从实验珠中洗脱出来的，但不是从对照珠中洗提出来的，而只有极少量的IFT140（如果有的话）在这些条件下结合(图3). 先前的工作表明，在酵母双杂交分析中，IFT20与顺行IFT运动的KIF3B亚基相互作用，IFT20和KIF3B可以与其他IFT复合物B亚基的抗体共同免疫沉淀(贝克等。，2003). 我们在GST下拉框中没有观察到任何KIF3B，也没有检测到睫状膜蛋白多囊蛋白-2或高尔基相关蛋白高尔基-97，这表明结合条件很严格，观察到的IFT20和复合B蛋白之间的相互作用是特定的。在衣原体IFT颗粒纯化为两个亚复合物A和B，观察到使用复合B抗体的免疫沉淀优先免疫沉淀相对于复合A蛋白的复合B蛋白，反之亦然(科尔等。，1998). 我们使用复合物B亚单位IFT20作为诱饵的结果与此一致，因为IFT52、IFT57和IFT88是复合物B的一部分，而IFT140是复合物a的一个亚单位。没有内源性IFT20结合到珠子，这表明每个复合物中不存在该亚单位的多个拷贝。这些结果证实小鼠IFT20是IFT复合物B的一个亚单位。

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图3。

哺乳动物IFT20与复合B蛋白相关。表达IFT20-GFP（pJAF2.13）或IFT20-GST-GFP（p JAF25.7）的小鼠IMCD3细胞的裂解液用谷胱甘肽珠孵育并洗涤，结合蛋白用谷胱甘肽洗脱。洗脱后的蛋白质通过Western blotting和图像左侧标记的蛋白质抗体进行分析。在这张图片中，IFT20-GFP-GST用IFT20抗体检测，并用GFP抗体确认（未公布的数据）。

IFT20细胞体和纤毛的贩运

为了观察IFT20在活细胞中的动力学，我们制备了表达IFT20-GFP的IMCD3和LLC-PK1肾细胞系，并用荧光显微镜进行了检测，这类似于广泛用于研究IFT在感觉纤毛中的表达的技术秀丽线虫(奥罗斯科等。，1999). 在这两种细胞系中，IFT20-GFP定位于高尔基复合体（纤毛基底部基底体周围的区域）和纤毛本身。IMCD3细胞中的IFT20-GFP较亮，但LLC-PK1细胞更适合在单个平面上成像纤毛，因为它们倾向于聚集较长的纤毛，通常水平放置在细胞表面，而IMCD3上的纤毛通常从细胞表面垂直伸出。在最初的实验中，在LLC-PK1细胞中捕获IFT20-GFP的单平面荧光图像的时间序列。对这些图像进行对比度调整并组合成电影（在线补充数据，LLC_IFT20-GFP.mov）。可以观察到大量颗粒从细胞体向鞭毛尖端顺行移动。逆行粒子的观察频率较低。在衣原体，逆行粒子看起来更小(米斯基等。，1993)因此，哺乳动物纤毛中的大多数逆行颗粒可能低于我们的检测极限。向外移动的粒子以～0.6μm/s的速度移动，而向内移动的粒子则以～0.7μm/s.的速度移动。这些速度比衣原体（顺行2.5μm/s，逆行4μm/s；米斯基等。，1993)但与在秀丽线虫感觉纤毛（0.52～0.72μm/s顺行，1.09～1.17μm/s逆行；雪等。，2004).

对细胞体的单平面图像检查表明，高尔基体内的IFT20-GFP是动态的，可能在高尔基复合体和纤毛之间移动。为了更好地检验这一点Z轴-捕获纤毛IFT20-GFP IMCD3细胞的堆叠。这个Z轴-对每个时间点的堆栈进行去卷积，通过对各个平面求和将其缩减为单个平面，并将其组装成电影（在线补充数据，IMCD3_IFT20-GFP.mov和图4C） ●●●●。正如从单平面图像拍摄的电影中观察到的那样，IFT20-GFP明显沿着纤毛移动。高尔基复合体和纤毛底部的IFT20-GFP也是高度动态的，并从细胞体移动到纤毛。图4C显示了电影中的三个连续帧，分别是伪红色、绿色或蓝色，这三个图像被组合在一起。如果IFT20-GFP在时间间隔内没有移动，则GFP颗粒在合成图像中为白色。离散的红色、绿色和蓝色颗粒表示IFT20-GFP在图像之间移动。箭头所示为IFT20-GFP结构，该结构从细胞体移动到电影开头附近的纤毛中。

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图4。

IFT20在细胞体和纤毛中移动。（A和B）每0.75秒拍摄一次表达IFT20-GFP的LLC-PK1细胞的延时荧光图像，持续26秒。调整这些图像的对比度，并将其组装成以~5倍正常速度播放的电影。（A） 为了说明观察到的两种类型的运动，显示了三帧（12-14）。最长的箭头表示基体。宽箭头标记高尔基复合体中的IFT20。三个小箭头表示颗粒从基底体移动到睫状体尖端的位置（顺行运动）。粒子在每个帧中的位置用星号（*）标记。箭头标记了IFT20-GFP在细胞质中快速移动的焦点位置。在电影中，这个焦点出现在基底体附近，移向细胞，然后返回基底体。尺寸棒，2μm长。（B） Kymography显示了电影中两个纤毛中IFT20-GFP的运动。每一对的顶部面板显示原始的波形图，而底部面板上绘制了线来标记移动的粒子。顺行粒子显示向上倾斜的线条，而逆行粒子显示向下倾斜的线条。（C） 五幅图像Z轴-每隔150ms取一堆表达IFT20-GFP的IMCD3细胞Z轴-堆栈被解卷，通过求和简化为单个平面，然后组装成电影。在C语言中，电影中的三个连续帧是伪红色、绿色或蓝色（图2、3和4），这三个图像被组合在一起（图2-4）。组合图像中的离散颜色表明IFT20-GFP是高度动态的。图3中的箭头指向一个进入纤毛的管状结构。

RPE细胞中IFT20的强烈减少阻碍了睫状体的组装

为了破坏细胞中IFT20的功能，我们使用短发夹RNA（shRNA）分子的体内表达(布鲁梅尔坎普等。，2002)对应于IFT20消息，以减少IFT20的生成量。将该构建物转染到人类RPE细胞中，并选择IFT20染色显著降低的亚克隆进行更多分析(图5). 免疫印迹法几乎检测不到IFT20(图5A） 或免疫荧光(图5，B和C）。IFT20的敲除大大降低了血清饥饿24或48小时后纤毛细胞的百分比(图5D） ●●●●。血清饥饿导致细胞进入G_0,其通常比有丝分裂活性的细胞更具高度纤毛(塔克和帕迪，1979年). 通过转染小鼠IFT20-GFP表达构建物可以挽救睫状体集合表型(图5，H和I），表明纤毛的缺乏是由于这些人类细胞中针对IFT20信息的发夹RNA的表达。小鼠IFT20与人类IFT20的区别在于靶序列中有一个核苷酸。尽管细胞缺乏纤毛并且整体敲除水平很高，但敲除细胞系中心体的IFT20数量并没有显著降低(图5、E、F和G）。高尔基体的结构似乎没有受到降低IFT20水平的显著影响(图5、J和K）。与中心体IFT20相对较小的减少相一致(图5G） IFT20的缺乏并不能阻止IFT57或IFT88在基底体的积聚(图5，L–O），尽管与pericentrin相比减少较小(尤尔奇克等。，2004)没有被排除在外。IFT20水平的降低似乎不影响高尔基体水平的运动蛋白-2(艾伦等。，2002; KIF3B，图5，P和Q）或动力蛋白2(格里森等。，2002; D2LIC、，图5、R和S）。这些结果表明，IFT20对于睫状体的组装是必需的，但对于高尔基复合体的完整性或两个IFT马达定位到高尔基复体则不是必需的。

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图5。

强大的IFT20击倒阻碍睫状体组装。（A） 用IFT20抗体检测RPE和IFT20 KD细胞的Western blot。用pGP677.2转染RPE细胞，然后进行稀释克隆，以纯化IFT20数量显著减少的细胞系，从而生成IFT20KD细胞。用抗微管蛋白抗体作为负载对照的蛋白质印迹显示，从敲低细胞负载的蛋白质比对照细胞更多。（B和C）标记有抗MmIFT20（绿色）、抗乙酰化微管蛋白（红色）和DAPI（蓝色）的RPE和IFT20KD细胞。Cilia标有箭头。注意C中没有IFT20染色和纤毛。（D）IFT20KD细胞的纤毛比对照细胞少。纤毛百分比是通过计算100个被抗乙酰化微管蛋白抗体染色的细胞上发现的纤毛数量来确定的。（E和F）RPE和IFT20KD细胞用Triton X-100预先提取，甲醇固定，然后用IFT20（绿色）、乙酰化微管蛋白（红色）和DAPI（蓝色）抗体染色。注意，IFT20在两种细胞系中都位于中心粒/基底体（箭头所示）。插图是基底身体区域的4倍放大。（G） 在每个群体的25个细胞上对中心体中残留的IFT20数量进行量化。误差棒，SEM。（H和I）敲除细胞用一种表达GFP标记的小鼠IFT20的构建物电穿孔。这将恢复纤毛组装（H中的箭头，I中的图表）。在两次单独的转染（实验1和实验2）后测定纤毛细胞的百分比。（J和K）RPE和IFT20KD细胞用HPA染色，HPA是一种标记顺式高尔基复合体内侧池。请注意，击倒细胞中高尔基体结构正常。用抗IFT57（绿色；L和M）和抗IFT88（绿色；N和O）染色的（L–O）RPE和IFT20KD细胞，以及DAPI（蓝色）和抗γ微管蛋白（红色）。插图是基底身体区域的4倍放大。请注意，在对照细胞和敲除细胞中的两个中心粒之一附近发现了一个IFT57或IFT88斑点。用抗KIF3B（P和Q）和抗D2LIC（R和S）染色的（P–S）RPE和IFT20KD细胞。请注意，高尔基体染色在击倒细胞和对照细胞中似乎相似。基底用箭头标记。B中的尺寸条为5μm，适用于所有图像。

细胞周期中IFT20在中心体的定位(图2)提示它可能在有丝分裂中起作用。流式细胞术测量循环细胞或G区阻滞细胞的DNA含量₂nocodazole在对照细胞和IFT20敲除细胞之间没有显示任何差异，这表明IFT20不是有丝分裂所必需的，或者留在中心体的IFT20的数量足以满足IFT20在有丝分裂中的任何功能。

我们感谢乔治·B·威特曼博士对这项工作的支持和他的批判性见解；试剂：Jovenal San Agustin博士、Bethany Walker博士、Steve Doxsey博士和Marvin Fitzler博士；和Julie Jonassen博士协助统计。我们也感谢同事们对手稿的有益讨论和批判性评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（GM-60992）和伍斯特生物医学研究基金会学者奖（G.J.P.）的资助。