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人类分子遗传学。作者手稿；PMC 2006年10月10日提供。
以最终编辑形式发布为：
人类分子遗传学。2006年6月1日；15(11): 1847–1857.
2006年4月21日在线发布。 数字对象标识：10.1093/hmg/ddl107
预防性维修识别码：项目经理1592550
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院10459
PMID：16632484

一种新的中心体/睫状体蛋白CEP290/NPHP6的帧内缺失干扰了其与RPGR的相互作用，导致视网膜早发型变性第16行鼠标

薄昌,1,† 赫曼特·坎纳,2,† 诺曼·霍斯,1 大卫·吉梅诺,5,6 雪莉·何,2 康塞普西翁·利洛,5,6 苏尼尔·帕拉普拉姆,2 洪成,2 艾莉森·斯科特,2 罗恩·赫德,1 约翰·塞耶,三 埃德加·A·奥托,三 马西莫·阿塔纳西奥,三 约翰·奥图尔,三 金庚霖,7 程超寿,7 弗里德海姆·希尔德布兰特,三，4 大卫·S·威廉姆斯,5,6 约翰·赫肯利弗利,2和阿南德·斯瓦鲁2,4,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

中心体和纤毛相关蛋白在有丝分裂后细胞建立极性和调节细胞内转运方面起着关键作用。利用遗传作图和位置候选策略，我们在一个新的中心体蛋白CEP290（也称为NPHP6）中发现了一个框内缺失，导致一个新发现的小鼠突变体早发性视网膜变性，第16行我们证明CEP290主要定位于分裂细胞的中心体和视网膜光感受器的连接纤毛。我们发现，在视网膜中，CEP290与包括RPGR在内的几种基于微管的转运蛋白相关，RPGR在约15%的视网膜色素变性患者中发生突变。在第16行视网膜，但数量显著减少；然而，突变蛋白表现出与特定RPGR同种型更强的相关性。免疫金标记研究显示RPGR和光转导蛋白在视网膜光感受器中的重新分布第16行视网膜。我们的发现表明CEP290在睫状体运输中的关键功能，并为早期光感受器变性的机制提供了见解。

简介

中心体是一种高度专业化的细胞器，由一对中心粒组成，中心粒周围是无定形的蛋白质基质，即中心粒周围物质（PCM）(1). 它通过在细胞分裂和染色体分离过程中协调微管的成核、锚定和释放，充当细胞的主要微管组织中心(2). 在有丝分裂后的细胞中，如感光细胞，其中一个中心粒（基底体）迁移到细胞膜的底部，招募鞭毛内转运蛋白和微管马达，并使初级纤毛的集合成核(三). 由于初级纤毛参与多种细胞过程，中心体/睫状体蛋白的突变导致人类疾病具有广泛的表型谱，包括身体对称性的随机化、肥胖、囊性肾病和视网膜变性(4).

光感受器是高度极性的神经元，具有明显的内部和外部节段；外节是一种特殊的感觉纤毛，通过纤毛与内节相连。光感受器的极性是由光导蛋白从其合成部位独特地分布到内段的外段而建立的(5). 每天大约有10%的外节段被翻转，新的椎间盘在近端形成并在远端脱落。目的地为外节的蛋白质被认为停靠在基底体上，通过连接纤毛向远处运输(6,7). 节段间睫状体运输的扰动与视网膜变性有关(7,8).

自发视网膜变性的动物模型提供了对疾病进展的病理机制的见解，并有助于设计治疗策略。此外，通过对小鼠疾病相关基因的鉴定，发现了导致人类视网膜变性的相应基因。例如，视网膜变性的识别1(第1版)，视网膜变性7(第7版)视网膜退化缓慢(无线电数据系统)小鼠模型分别鉴定了与遗传性视网膜病变相关的β-磷酸二酯酶、光感受器特异性核受体和外周蛋白rds突变(9–14). 现在，通过在杰克逊实验室筛选遗传多样但近交系的小鼠，已经描述出了更多的视网膜突变体(15).

在这里，我们报告了第16行小鼠，表现为具有常染色体隐性遗传的早发性视网膜变性。我们证明了第16行小鼠携带一种新的中心体蛋白CEP290的框内缺失。CEP290蛋白也定位于感光细胞的连接纤毛，并与一些纤毛和中心体蛋白相关，包括RPGR。在第16行视网膜，我们观察到RPGR和突变CEP290的相互作用改变，以及RPGR与光转导蛋白的重新分布。我们的研究结果表明，CEP290在蛋白质运输中起着重要作用，并揭示了导致光感受器退化的途径，这是发达国家遗传性失明的主要原因。

结果

临床和组织学检查第16行鼠标

纯合子的表型第16行小鼠与野生型（WT）动物的区别在于1个月大时出现白色视网膜血管，2个月大的色素斑(图1A). 在暗适应和光适应条件下的视网膜电图显示第16行早在出生后（P）第18天就与野生型进行了比较(图1B). 光学显微镜第16周/第16周早在出生后第19天，视网膜就出现了外节退化和外核层厚度减少，并且随着年龄的增长而发展。在其他细胞层中观察到很少或没有变化(图1C).

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检查第16行小鼠视网膜。(A类)WT C57BL/6J小鼠和第16行纯合子突变体(第16周/第16周)1个月龄和2个月龄时出现视网膜变性。(B类)WT和突变体的ERG反应(第16周/第16周)小鼠在黑暗（SCOTOPIC）和光照（PHOTOPIC。箭头表示A波，箭头表示B波。(C类)WT视网膜组织学第16行指定年龄的纯合子小鼠。视网膜色素上皮；OS，外段；IS，内段；ONL，外核层；外层丛状层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。

Cep290型在第16行鼠标

通过对回交小鼠的连锁分析，我们绘制了第16行位于基因组区域的10号染色体两侧D10密特244（99.4百万）和D10Nds2型（1.05亿）(图2A和B).生物信息学对关键区域的分析显示了30多个假定的表达序列，然后使用我们生成的基因表达谱检查这些序列在小鼠光感受器中的差异表达(16)或其他(17). 我们发现其中一个假设基因的表达，BC004690号，在杆成熟期间增加了近3倍（P2–P6）。它的表达在Crx公司−/−感光细胞无法发育的小鼠(18)在无杆、圆锥体丰富的视网膜中编号−/−老鼠(19)（未显示数据）。使用引物对F1–R1进行实时PCR分析BC004690号（补充材料，表S1）验证了基因保护数据(图2C和D).

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Cep290型中的突变第16行. (A类)连锁交叉数据：165个来自(第16行×铸件/EiJ）F1×第16周/第16周对ERG表型进行表型分析，并对所示微卫星标记进行基因分型。黑框表示纯合子第16行-衍生等位基因和白盒代表第16行-和CAST衍生等位基因。共享相应单倍型的动物数量显示在每列方格的下方。通过最小化交叉数来确定标记位点的顺序。这个第16行从显示重组的小鼠的ERG表型推断出该基因座。(B类)小鼠10号染色体遗传图显示第16行关键区域，与人类染色体12q21.1同源。(C类)实时RT-PCR分析BC004690号（Cep290，外显子27-48）。将不同发育阶段的表达水平归一化为Hprt水平后，计算出相对于胚胎期E14的相对折叠变化。P、 产后一天。每个条形代表平均值±SE(n个= 6). (D类)实时RT-PCR分析BC004690号在视网膜中Crx公司−/−和编号−/−与WT小鼠进行比较。中的表达式级别Crx公司−/−和编号−/−视网膜在正常化至Hprt（小时）水平。每个条形代表平均值±SE(n个= 6). (E类)RT-PCR分析（使用F2–R2引物组）BC004690号使用第16行和WT视网膜RNA。在第16行与WT中2.1 kb的产物相比。DNA大小标记显示在左侧（以kb为单位）。(F类)BC004690号中的顺序第16行显示包含外显子35-39的897bp的框内缺失。使用了氨基酸的三个字母代码。(G公司)WT和第16行DNA使用外显子34探针。DNA被消化多克隆位点在外显子34和40之间切割WT DNA五次，而在第16行DNA，只有三个多克隆位点网站仍然存在。WT DNA的预期带宽为10.6 kb，而第16行DNA，一条约15 kb的较重条带（箭头所示）。分子量标记以千碱为单位。(H（H）)的示意图Cep290型基因和CEP290和ΔCEP290蛋白显示假定的结构域和基序。CC，线圈；KID、RepA/Re+蛋白KID；P-loop，ATP-GTP-结合位点基序A；纺锤体结合域；MYO-尾，肌球蛋白尾同源结构域。

此外生物信息学分析表明BC004690号是鼠标的一部分Cep290型基因（外显子27-48），编码一种类似于人类中心体蛋白CEP290的蛋白质(20). 考虑到某些中心体蛋白的突变可能会因感光细胞中的睫状体功能障碍而导致视网膜变性(4)，我们筛选了Cep290型可能发生突变的基因第16行鼠标。使用F1–R1引物对的初始RT-PCR分析没有扩增任何产物（数据未显示）；另一个引物组（F2–R2；补充材料，表S1），包括完整的BC004690号序列检测到一个1.2 kb的产品第16行视网膜cDNA与WT cDNA中预期的2.1 kb产物的比较(图2E). RT-PCR产物的序列分析确定了897 bp（cDNA中5073-5969 bp）的框内缺失，对应于CEP290氨基酸残基1599-1897(图2F显示连接顺序）。截短的CEP290蛋白被命名为ΔCEP290。未检测到其他序列改变。WT和第16行纯合子基因组DNA证实在Cep290型基因(图2G).

CEP290的域组成

这个Cep290型该基因跨越85 kb和52个外显子，编码2472个氨基酸（表观分子量290 kDa）的假定蛋白质。为了研究CEP290的结构域，我们扫描了MotifScan和SMART蛋白质数据库(网址：www.expasy.org)并鉴定出至少九个线圈结构域和一个C末端肌球蛋白尾同源结构域，为肌球蛋白马达提供结构骨架(图2H). 此外，CEP290与SMC（染色体结构维持）染色体分离ATP酶具有显著相似性(21)6个RepA/Rep+蛋白基序KID，参与运动蛋白与核苷酸结合的富含甘氨酸的ATP/GTP结合位点基序（P-loop），以及中心体蛋白参与微管组织的转化酸性线圈（TACC）域。肌球蛋白尾巴的大部分同源区域在第16行鼠标（请参见图2H和补充材料中的蓝色区域，图S1）。CLUSTALW分析显示CEP290蛋白具有很强的进化保守性达尼奥雷里奥和冈比亚按蚊（补充材料，图S1）。

CEP290在小鼠视网膜中的表达和定位

单克隆抗体3G4(22)在来自WT小鼠不同组织的蛋白质提取物以及用全长myc标记的CEP290构建体转染的COS1细胞中，针对CEP290识别了约290kDa的条带（数据未显示）。我们还针对小鼠CEP290蛋白对应的两个肽产生了多克隆抗体；这种抗体也能识别转染COS-1细胞中的CEP290蛋白(图3A). 免疫印迹分析显示，从视网膜提取液中提取的视网膜细胞具有微弱的快速迁移带（ΔCEP290）第16行小鼠与WT中290 kDa带的比较(图3B). 牛视网膜提取物中也观察到其他低分子量条带（我们未发表的数据）。在此基础上生物信息学分析表明，这些带代表CEP290的交替剪接亚型。

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CEP290的表达和定位。(A类)用空载体（模拟）或编码全长人CEP290蛋白并融合到myc-tag的载体转染COS-1细胞。使用抗myc（上面板）或抗CEP290抗血清（下面板），通过免疫印迹（IB）对细胞进行裂解和分析。箭头表示特定的条带。模拟转染通道（下面板）中的免疫反应带为内源性CEP290蛋白。免疫前血清未显示信号（数据未显示）。(B类)WT蛋白提取物的免疫印迹（20μg）和第16行使用CEP290抗体分析（200μg）视网膜。箭头表示CEP290的全长和预测的交替拼接产品。(C类)野生型小鼠视网膜的免疫组织化学分析。将切片与CEP290抗体孵育，然后进行二级抗体孵培养。（a） 和（c）视网膜切片的Nomarski图像。（b） （d）CEP290抗体染色（绿色）显示连接纤毛的强烈标记（箭头所示）。还观察到IS中的标签。比例尺：（a）、（b）为40μm；（c）、（d）为10μm。(D类)在IMCD-3细胞中，CEP290（绿色）与γ-微管蛋白（红色；上图）和PCM1（红色；下图）在中心体（箭头；合并）处共定位。用双苯甲酰亚胺（BIS）对DNA进行染色。(E类)CEP290在细胞周期中与中心体相关。同步化HeLa细胞与抗γ-微管蛋白（红色）和CEP290（绿色）抗体共同染色，并通过共焦显微镜进行分析。箭头表示CEP290（合并）在所有指定的细胞分裂阶段的中心体染色。(F类)用p50-dynaminin表达载体转染IMCD-3细胞。细胞用p50（红色）、CEP290或γ-微管蛋白（绿色）抗体染色。箭头表示未转染细胞中的中心体CEP290和γ-微管蛋白，而箭头表示p50过度表达细胞中CEP290及γ-微管蛋白定位于中心体。合并图像显示蓝色细胞核染色。

然后，我们通过免疫荧光和免疫金显微镜研究了CEP290在小鼠视网膜中的定位。CEP290主要定位于小鼠光感受器的连接纤毛，尽管在内段检测到一些标记(图3C; 补充材料，图S2）。CEP290的连接纤毛染色也在小鼠视网膜的分离杆状光感受器中观察到，这是通过与乙酰化α-管蛋白共同定位确定的（数据未显示）。

CEP290以动力蛋白依赖的方式定位于中心体

使用CEP290抗体的免疫细胞化学分析表明，CEP290与中心体和中心粒周围基质标记物γ-微管蛋白和PCM1共定位(2)小鼠肾脏内髓集合管中心体（IMCD-3）(图3D). 与PCM1的共定标使人想起BBS4的染色模式，BBS4是一种参与微管动力学的睫状体/中心体蛋白(23). 我们还发现在细胞周期的不同阶段，CEP290与γ-微管蛋白的共同标记是一致的(图3E).

接下来，我们询问了CEP290是如何在中心体上被招募或组装的。先前的研究表明，使用诺卡唑进行微管解聚不会改变CEP290的中心体定位(20). 假设许多中心体蛋白，包括RPGR-ORF15和PCM1，通过功能性动力蛋白-动力锡分子马达锚定在中心体上，而其他如γ-微管蛋白和BBS6则不是(24,25)，我们通过过度表达dynactin复合体的p50-dynaminin亚单位，检测了CEP290的定位是否依赖于dynactin-dynamitin马达(26). 与γ-微管蛋白一样，CEP290在中心体的定位在过度表达p50-dynaminin的细胞中没有改变(图3F). 我们的数据表明，功能性微管马达或聚合微管不需要维持CEP290在中心体的位置；然而，我们不能排除他们需要向中心体招募新合成的CEP290。

CEP290与哺乳动物视网膜RPGR相关

鉴于RPGR，一种睫状体/中心体蛋白(27–29)视网膜色素变性中检测到的突变(30–32)，与中心体疾病相关蛋白相互作用(29,33–35)，我们假设CEP290也可能与RPGR及其相互作用蛋白相关，并参与共同的功能途径。ORF15人物配对关系针对富含视网膜的RPGR-ORF15亚型的抗体(28,29,34)能够从WT小鼠视网膜提取物中沉淀极少量的CEP290(图4A). 使用3G4抗体的反向共免疫沉淀在免疫印迹中检测到RPGR-ORF15(图4B). 值得注意的是，酵母双杂交实验似乎没有揭示CEP290与RPGR的直接相互作用（数据未显示）。

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CEP290和ΔCEP290与视网膜中的RPGR-ORF15和其他中心体/微管相关蛋白相关。(A、 B类)使用ORF15执行IP人物配对关系（A） 来自WT的CEP290（B）抗体或正常IgG，以及第16行视网膜提取物（每个200μg）。免疫沉淀蛋白通过IB使用CEP290（A）或ORF15进行分析人物配对关系（B） 抗体。输入通道含有20%用于IP的蛋白质提取物。长时间暴露于（A）中的印迹显示ΔCEP290在第16行输入车道（未显示数据）。分子量标记以千道尔顿为单位。星号表示使用ORF15从WT视网膜免疫沉淀的微弱全长CEP290-免疫活性带（290kDa）人物配对关系抗体。（A）中的箭头指向从第16行视网膜使用ORF15人物配对关系.（B）中的箭头表示ORF15识别的多个RPGR-ORF15亚型人物配对关系抗体(29). CEP290抗体免疫沉淀低分子量（120–220 kDa）RPGR-ORF15亚型第16行. (C类)使用CEP290（绿色）和ORF15的免疫细胞化学人物配对关系（红色）抗体显示内源性CEP290和RPGR-ORF15在IMCD-3细胞中的共同定位。箭头表示共同本地化（合并）。(D类)WT和第16行使用CEP290抗体对视网膜提取物进行IP处理，并使用指示的抗体通过IB进行分析。输入通道占IP所用总蛋白提取物的5%。分子量标记以千道尔顿为单位。车道1和2：来自WT和第16行视网膜提取物；3和4:IP使用来自WT和第16行分别为；5:IP，WT视网膜IgG正常。(E类)通过将WT视网膜的蛋白质提取物与指示的IP抗体孵育，然后使用CEP290抗体孵育IB来进行反向IP。分子量标记以千道尔顿为单位。

接下来，我们使用第16行视网膜提取物。RPGR-ORF15可以从第16行视网膜与野生型蛋白的比较(图4A). 反向免疫沉淀法从第16行视网膜(图4B). 与此一致，内源性CEP290与RPGR-ORF15在IMCD-3细胞中共同定位(图4C)和分离的小鼠杆状感光体（数据未显示）。

CEP290是选定的中心体和微管相关蛋白复合物的一部分

为了评估CEP290和ΔCEP290是否是与其他中心体和微管相关运动组件的多蛋白复合物的一部分，其中一些还可能与含有RPGR-ORF15的复合物重叠，我们使用小鼠或牛视网膜提取物进行了额外的免疫共沉淀实验。我们的数据显示CEP290与RPGR相互作用蛋白1（RPGRIP1）、动力蛋白亚基p150复合物存在胶水和p50-动力蛋白、驱动蛋白亚基KIF3A、驱动素相关蛋白（KAP3）、γ-微管蛋白、PCM1、中心蛋白、周中心蛋白和ninein，但不与核磷蛋白（NPM）或肾胱氨酸5（NPHP5）结合(图4D和E). Dynein亚单位不可检测，可能是因为Dynein-dynactin相互作用的丰度低或不稳定。作为RPGR-ORF15，CEP290还与SMC1和3相互作用。与SMC蛋白和p50-dynaminin的关联程度不同可能是由于蛋白质的相对丰度。CEP290与视网膜病变中突变的另一种睫状体蛋白RP1无关(36) (图4D). 通过以下方法获得了类似的结果第16行以及牛视网膜提取物（数据未显示）。当正常IgG用于IP时，未检测到免疫反应带。值得注意的是，RPGR-ORF15与NPM相互作用(28)和NPHP5(34)但不包括centrin和pericentrin(29). 因此，我们的结果表明，CEP290和RPGR可能在视网膜中执行多种重叠但不同的微管运输功能。

RPGR和视蛋白的扰动定位第16行视网膜

接下来，我们研究了ΔCEP290的关联增加是否影响RPGR-ORF15在第16行视网膜。免疫电镜实验显示RPGR-ORF15在P12的内段聚集第16行视网膜，表明贩运缺陷，而如前所示(29)正常视网膜光感受器中的轴丝和基底体被ORF15强烈标记人物配对关系抗体(图5A-C). 然而，我们没有观察到连接纤毛的纤毛有任何明显的结构缺陷第16行视网膜。

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RPGR-ORF15、视紫红质和抑制素的定位第16行视网膜。(A–D)WT的免疫金EM或第16行带有指示抗体的视网膜。使用ORF15标记人物配对关系抗体显示RPGR-ORF15（a）的连接纤毛（CC）染色占优势，而非在整个感光细胞IS中异常广泛的标记第16行视网膜（B、C）。箭头表示成簇的免疫金颗粒。视紫红质的标记第16行视网膜（D）在感光细胞体周围明显可见（箭头所示），无专属OS定位；N、 核心。(E、 F类)WT和第16行P12视网膜，在正常光/暗循环下解剖，带有抗视紫红质（E）或抑制素（F）抗体。如图所示，视紫红质和抑制素主要定位于WT视网膜的OS，而第16行光感受器的ONL和IS中也检测到视紫红质和抑止素。中的操作系统第16行视网膜在P12处退化，因此与内节（OS/IS）结合。比例尺：50μm。

鉴于RPGR-ORF15参与光感受器的细胞内转运(29,37)，我们试图检测CEP290突变和/或RPGR定位错误对视网膜光转导蛋白转运的影响。免疫金EM和免疫荧光分析显示视紫红质和抑制素在整个细胞膜上重新分布第16行与野生型光感受器中正常的外节段定位相比较时的光感受器(图5D–F).

讨论

光感受器变性与许多综合征疾病相关，如Senior-Loken综合征和Bardet-Biedl综合征（BBS）(4,34)以及非综合征遗传性视网膜变性疾病。已经确定了100多个遗传性视网膜变性的遗传位点（参见RetNet:http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet网站/). 视网膜变性小鼠模型为人类视网膜病变提供了候选基因，并为疾病发病机制提供了关键见解。在这里，我们报告了在第16行小鼠与一种新的中心体蛋白CEP290的框内缺失相关。我们的数据表明，CEP290调节细胞内蛋白质运输，其功能的扰动导致睫状体和光转导蛋白定位错误，导致光感受器退化。

观察到的缺陷第16行视网膜与CEP290在睫状体运输过程中的作用一致。由于ΔCEP290与微管马达（动力蛋白和驱动蛋白II）的结合保持不变，我们得出结论，RPGR和视蛋白的异常转运第16行不是ΔCEP290与运动蛋白受损或缺陷关联的直接影响。本研究中一个有趣的发现是，完整ΔCEP290的减少能够与更高数量的特定RPGR-ORF15亚型相关。这种更高的联系可能会从连接纤毛中招募RPGR，并将其重新分布在内部节段中。与RPGR参与细胞内蛋白质运输一致，我们观察到光转导蛋白的重新分布，这是潜在的“货物”蛋白(8)通过连接纤毛运输至外部节段第16行视网膜。然而，我们并不排除CEP290（或ΔCEP290）与视紫红质和/或arrestin直接相关的可能性。到目前为止，试图直接鉴定货运蛋白与睫状体运输组件之间的联系一直没有成功，可能是因为弱相互作用或短暂相互作用(29,38,39).

我们的研究结果表明，光转导蛋白的错误路由是视网膜光感受器退化的潜在原因第16行视网膜。由于纤毛运输受损，视蛋白在光感受器内节的这种重新分布以前已经在Kif3a型条件突变体，Tg737型奥普克,背景2−/−和背景4−/−老鼠(7,40–42)以及其他类型的视网膜退化（例如。第1版,rds公司/外周蛋白和视蛋白突变体，Q334ter和P347S，但不是P23H）(43,44). 视蛋白的错误定位可能是由于RPGR-ORF15重新分布到内段。支持这一假设的是以前的一项观察，即RPGR的连接纤毛染色在第1页−/−小白鼠，由于视蛋白的贩运，也会出现早期光感受器退化(45). 值得注意的是，Rpgr−/−小鼠的视网膜退行性变慢了很多，只有少量的视紫红质重新分布(37)与第16行鼠标。这可能是由于存在一些RPGR-ORF15亚型，这些亚型仍在印尼盾−/−小鼠和定位于连接纤毛(29).

CEP290在整个细胞周期中主要与中心体结合，表明其在微管成核中的作用，起源于分裂细胞的中心粒。然而，对其在细胞分裂中确切作用的描述还需要进一步研究。有趣的是，CEP290与SMC蛋白具有同源性并与之相关，SMC蛋白除了在细胞分裂过程中调节染色体动力学外，还定位于感光器的初级纤毛，并被假设通过与RPGR相互作用参与感光器中的纤毛运输(29). 一些睫状体和中心体蛋白质包含SMC样结构域，并参与逆行和顺行蛋白质运输过程中的微管动力学(20,46,47). 因此，可以将SMC样结构域假设为在这些传输过程中识别的签名序列。

在这项研究进行的过程中CEP290公司基因（也称为NPHP6核电站)在Joubert综合征患者中发现，除了早发性视网膜变性或缺损外，还包括囊性肾病（肾病）和小脑缺陷(48). 对6个月大的婴儿进行全面评估第16行纯合子未检测到任何粗大的脑或肾病理（补充材料，表S2），表明ΔCEP290蛋白第16行鼠标至少保留部分功能。值得注意的是，在CEP290公司Joubert综合征患者的基因已被鉴定。这些观察结果表明，CEP290的肌球蛋白尾同源结构域具有视网膜特异性功能。然而，在缺乏CEP290蛋白的情况下，在Joubert综合征患者中观察到多效性表型。

总之，我们的研究表明，CEP290可能通过组织不同的多蛋白复合物进行微管转运来参与调节细胞内蛋白质转运。我们的发现提供了神经元微管组织、细胞内转运和睫状体功能之间的直接联系，并可能有助于以视网膜光感受器为范例对中心体疾病相关蛋白进行功能性分离。

材料和方法

动物研究

这些小鼠在杰克逊实验室和凯洛格眼科中心的标准化条件下繁殖和饲养。小鼠的使用得到了机构动物护理和使用委员会的批准。这个第16行在大约F140代的时候，在菌株BXD-24/Ty中发现了小鼠，并且该突变在该菌株中得到了固定，但在大约F84代的时候从胚胎冷冻库中回收的所有BXD--24/Ty小鼠的视网膜都正常。对视网膜检查、组织学和视网膜电图的详细方法进行了描述(49). 我们将BXD-24/Ty交配-第16行带有CAST/EiJ小鼠的小鼠。未表现出视网膜异常的F1小鼠被回交（BC）到BXD-24/Ty-第16行老鼠。使用微卫星标记对165个BC后代的DNA进行基因分型，以绘制结构图；已经报道了详细的定位和突变筛选方法(49).

DNA、RNA和蛋白质分析

描述了DNA和RNA分析方法(19). RT-PCR的引物对在补充材料表S1中给出。视网膜提取物的联合IP实验如所述进行(29). 针对小鼠序列产生兔多克隆CEP290肽抗体（Invitrogen）517SKRLKQQQYRAENQ公司530和2457SEHS-EDGESPHSFPIY公司2472兔抗RPGR、RPGRIP1和NPHP5的多克隆抗体已在前面描述过(29,34). 抗乙酰化α-微管蛋白、γ-微管蛋白、p50动态蛋白、SMC1和SMC3的抗体购自Chemicon（Temeculla，CA）。鼠标抗p150胶水抗体来自BD转导实验室（加利福尼亚州圣何塞）；抗KIF3A、抗KAP3、抗中心蛋白和抗周中心蛋白抗体从Sigma获得，抗ninein来自BioLegend（加州圣地亚哥）。Eric A.Pierce博士慷慨提供了抗RP1抗体，Alan F.Wright博士提供了抗NPM抗体，A.Merdes博士提供了PCM1抗体。

细胞培养和免疫定位

肾脏m-IMCD-3细胞（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收集中心；CRL 2123）在六孔板中生长，并使用Fugene-6试剂（Roche）转染p50-dynaminin表达构建物（Trina a.Schroer博士的礼物）。免疫细胞化学和免疫金EM程序的实验细节如下所述(29). 视网膜切片的视紫红质和arrestin的免疫荧光显微镜检查是使用公开的程序进行的(50). 对于CEP290的免疫标记，将眼睛固定在甲醇中，用3G4标记切片，然后用与AlexaFluor 488偶联的山羊抗鼠抗体。

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致谢

我们感谢Muriel T.Davisson提供的指导，感谢Masayuki Akimoto提供的Nrl-p-GFP小鼠，感谢Stephen Lentz提供的共焦显微镜，感谢Robbie Duerr和Steve Merino提供的技术援助，感谢Edwin Oh和Swaroop实验室的其他成员提供的讨论，感谢Sharyn Ferrara提供的行政援助。本研究得到了美国国立卫生研究院（EY07961、EY07003、EY13408、EY12598、EY00758、RR01183、DK1069274、DK1068306、DK064614和DK20572）、防盲基金会、防盲研究和乔治·M·奥布莱恩肾脏研究中心的资助。美国国立卫生研究院拨款EY07961为支付本文的开放获取出版费用提供了资金。

脚注

‡小鼠Cep290 cDNA和基因序列与GenBank登录号一致。XM_618806号.

利益冲突声明.作者声明没有利益冲突。

工具书类

1Nigg EA公司。发育和疾病中的中心体。Wiley-VCH Verlag GmbH&Co；KGaA:2004年。[谷歌学者]
2Doxsey S.重新评估中心体功能。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2:688–698.[公共医学][谷歌学者]
三。Beisson J，Wright M.基本体/中心粒组装和连续性。当前操作细胞生物学。2003;15:96–104.[公共医学][谷歌学者]
4Badano JL，Teslovich TM，Katsanis N.人类遗传病中心体。自然资源部Genet。2005;6:194–205.[公共医学][谷歌学者]
5年轻的RW。新形成的蛋白质通过青蛙视网膜杆的连接纤毛。超微结构研究杂志。1968;23:462–473.[公共医学][谷歌学者]
6Liu X，Udovichenko IP，Brown SD，Steel KP，Williams DS。肌球蛋白VIIa通过纤毛感光器参与视蛋白转运。神经科学杂志。1999;19:6267–6274. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Marszalek JR、Liu X、Roberts EA、Chui D、Marth JD、Williams DS、Goldstein LS。哺乳动物光感受器中驱动蛋白II选择性转运视蛋白和抑制素的遗传证据。单元格。2000;102:175–187.[公共医学][谷歌学者]
8Besharse JC、Baker SA、Luby-Phelps K、Pazour GJ。光感受器节段间转运和视网膜变性：运动纤毛和感觉纤毛共同的保守途径。高级实验医学生物。2003;533:157–164.[公共医学][谷歌学者]
9Bowes C、Li T、Danciger M、Baxter LC、Applebury ML、Farber DB。rd小鼠的视网膜变性是由杆状cGMP-磷酸二酯酶的β亚单位缺陷引起的。自然。1990;347:677–680.[公共医学][谷歌学者]
10Akhmedov NB、Piriev NI、Chang B、Rapoport AL、Hawes NL、Nishina PM、Nusinowitz S、Heckenlivey JR、Roderick TH、Kozak CA等。光感受器特异性核受体mRNA缺失导致rd7小鼠视网膜变性。美国国家科学院程序。2000;97:5551–5556. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Travis GH、Brennan MB、Danielson PE、Kozak CA、Sutcliffe JG。视网膜缓慢变性（rds）基因编码的光感受器特异性mRNA的鉴定自然。1989;338:70–73.[公共医学][谷歌学者]
12McLaughlin ME、Sandberg MA、Berson EL、Dryja TP。视网膜色素变性患者中编码杆磷酸二酯酶β亚基的基因的隐性突变。自然遗传学。1993;4:130–134.[公共医学][谷歌学者]
13Haider NB、Jacobson SG、Cideciyan AV、Swiderski R、Streb LM、Searby C、Beck G、Hockey R、Hanna DB、Gorman S等。核受体基因NR2E3的突变会导致S锥综合征增强，这是一种视网膜细胞命运障碍。自然遗传学。2000;24:127–131.[公共医学][谷歌学者]
14Farrar GJ、Kenna P、Jordan SA、Kumar-Singh R、Humphries MM、Sharp EM、Sheils DM、Humphres P。一种视网膜色素变性的外周蛋白RDS基因中的三个碱基对缺失。自然。1991;354:478–480.[公共医学][谷歌学者]
15Chang B、Hawes NL、Hurd RE、Davisson MT、Nusinowitz S、Heckenlivey JR。小鼠视网膜变性突变体。视觉研究。2002;42:517–525.[公共医学][谷歌学者]
16Akimoto M，Cheng H，Zhu D，Brzezinski JA，Khanna R，Filippova E，Oh EC，Jing Y，Linares JL，Brooks M，et al.通过Nrl启动子将绿色荧光蛋白靶向新生杆状体，并对流动光受体进行时间表达谱分析。美国国家科学院程序。2006;103:3890–3895. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Blackshaw S、Harpavat S、Trimarchi J、Cai L、Huang H、Kuo WP、Weber G、Lee K、Fraioli RE、Cho SH等。小鼠视网膜发育的基因组分析。《公共科学图书馆·生物》。2004;2：E247。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Furukawa T、Morrow EM、Li T、Davis FC、Cepko CL。Crx缺乏小鼠的视网膜病变和昼夜节律抑制。自然遗传学。1999;23:466–470.[公共医学][谷歌学者]
19杆感光器开发需要Mears AJ、Kondo M、Swain PK、Takada Y、Bush RA、Saunders TL、Sieveng PA、Swaroop A.Nrl。自然遗传学。2001;29:447–452.[公共医学][谷歌学者]
20Andersen JS、Wilkinson CJ、Mayor T、Mortensen P、Nigg EA、Mann M.通过蛋白质相关分析对人类中心体进行蛋白质组学表征。自然。2003;426:570–574.[公共医学][谷歌学者]
21Nasmysy K，Haering CH。SMC和kleisin复合物的结构和功能。生物化学年度收益。2005;74:595–648.[公共医学][谷歌学者]
22郭J，金G，孟L，马H，聂D，吴J，袁L，寿C.肿瘤相关抗原3H11Ag的细胞亚定位。生物化学与生物物理研究委员会。2004;324:922–930.[公共医学][谷歌学者]
23Kim JC、Badano JL、Sibold S、Esmail MA、Hill J、Hoskins BE、Leitch CC、Venner K、Ansley SJ、Ross AJ等。Bardet–Biedl蛋白BBS4靶向中心粒周围区域的货物，是微管锚定和细胞周期进展所必需的。自然遗传学。2004;36:462–470.[公共医学][谷歌学者]
24Dammermann A，Merdes A。中心体蛋白和微管组织的组装依赖于PCM-1。细胞生物学杂志。2002;159:255–266. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Kim JC、Ou YY、Badano JL、Esmail MA、Leitch CC、Fiedrich E、Beales PL、Archibald JM、Katsanis N、Rattner JB等。MKKS/BBS6是一种与肥胖障碍Bardet–Biedl综合征相关的发散性伴侣蛋白样蛋白，是胞质分裂所需的一种新型中心体成分。细胞科学杂志。2005;118:1007–1020.[公共医学][谷歌学者]
26.沃恩KT，瓦利RB。细胞质动力蛋白通过中间链和p150粘附分子之间的直接相互作用结合动力蛋白。细胞生物学杂志。1995;131:1507–1516. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Hong DH、Pawlyk B、Sokolov M、Strissel KJ、Yang J、Tulloch B、Wright AF、Arshavsky VY、Li T.连接纤毛和运动纤毛过渡区的感光器中的RPGR亚型。投资眼科视觉科学。2003;44:2413–2421.[公共医学][谷歌学者]
28Shu X、Fry AM、Tulloch B、Manson FD、Crabb JW、Khanna H、Faragher AJ、Lennon A、He S、Trojan P等。RPGR ORF15亚型与RPGRIP1在中心粒和基底体共定位，并与核磷蛋白相互作用。人类分子遗传学。2005;14:1183–1197.[公共医学][谷歌学者]
29Khanna H、Hurd TW、Lillo C、Shu X、Parapuram SK、He S、Akimoto M、Wright AF、Margolis B、Williams DS等RPGR-ORF15，在色素性视网膜炎中突变，与SMC1、SMC3和微管转运蛋白相关。生物化学杂志。2005;280:33580–33587. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Vervoort R、Lennon A、Bird AC、Tulloch B、Axton R、Miano MG、Meindl A、Meitinger T、Ciccodicola A、Wright AF。X连锁视网膜色素变性新RPGR外显子内的突变热点。自然遗传学。2000;25:462–466.[公共医学][谷歌学者]
31Breuer DK、Yashar BM、Filippova E、Hiriyanna S、Lyons RH、Mears AJ、Asaye B、Acar C、Vervoort R、Wright AF等。北美X连锁视网膜色素变性家族队列中RP2和RPGR的综合突变分析。美国人类遗传学杂志。2002;70:1545–1554. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32X连锁视网膜色素变性患者中的Sharon D、Sandberg MA、Rabe VW、Stillberger M、Dryja TP、Berson EL.RP2和RPGR突变和临床相关性。美国人类遗传学杂志。2003;73:1131–1146. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Dryja TP、Adams SM、Grimsby JL、McGee TL、Hong DH、Li T、Andreasson S、Berson EL。Leber先天性黑蒙患者的RPGRIP1等位基因为空。美国人类遗传学杂志。2001;68:1295–1298. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Otto EA、Loeys B、Khanna H、Hellemans J、Sudbrak R、Fan S、Muerb U、O'Toole JF、Helou J、Attanasio M等。Nephrocysin-5是一种睫状体IQ域蛋白，在Senior-Loken综合征中发生突变，并与RPGR和钙调蛋白相互作用。自然遗传学。2005;37:282–288.[公共医学][谷歌学者]
35Hong DH，Yue G，Adamian M，Li T.视网膜色素变性GTP酶调节因子（RPGRr）-相互作用蛋白与光感受器纤毛轴丝稳定相关，并将RPGR-锚定在连接纤毛上。生物化学杂志。2001;276:12091–12099.[公共医学][谷歌学者]
36Liu Q、Zuo J、Pierce EA。视网膜色素变性1蛋白是一种感光细胞微管相关蛋白。神经科学杂志。2004;24:6427–6436. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Hong DH，Pawlyk BS，Shang J，Sandberg MA，Berson EL，Li T.X连锁色素性视网膜炎（RP3）GTP酶调节因子（RPGR）缺陷小鼠模型美国国家科学院程序。2000;97:3649–3654. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Cole DG、Diener DR、Himelblau AL、Beech PL、Fuster JC、Rosenbaum JL。衣原体驱动蛋白Ⅱ依赖的鞭毛内转运（IFT）：IFT颗粒含有纤毛组装所需的蛋白质秀丽隐杆线虫感觉神经元。细胞生物学杂志。1998;141:993–1008. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Piperno G、Siuda E、Henderson S、Segil M、Vaananen H、Sassaroli M。逆行鞭毛内转运（IFT）的不同突变体具有相似的形态和分子缺陷。细胞生物学杂志。1998;143:1591–1601. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Pazour GJ、Baker SA、Deane JA、Cole DG、Dickert BL、Rosenbaum JL、Witman GB、Besharse JC。鞭毛内转运蛋白IFT88对脊椎动物感光细胞的组装和维护至关重要。细胞生物学杂志。2002;157:103–113. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Nishimura DY、Fath M、Mullins RF、Searby C、Andrews M、Davis R、Andorf JL、Mykytyn K、Swiderski RE、Yang B等。Bbs2-null小鼠存在神经感觉缺陷、社会支配缺陷以及与视紫红质定位错误相关的视网膜病。美国国家科学院院刊。2004;101:16588–16593. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Mykytyn K、Mullins RF、Andrews M、Chiang AP、Swiderski RE、Yang B、Braun T、Casavant T、Stone EM、Sheffield VC。Bardet–Biedl综合征4型（BBS4）-空白小鼠在鞭毛形成中牵连BBS4，但不牵连全球纤毛集合。美国国家科学院程序。2004;101:8664–8669. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Nir I，Papermaster DS。视蛋白在RCS大鼠和rd和rds小鼠退化感光细胞中的免疫细胞化学定位。临床生物研究进展。1989;314:251–264.[公共医学][谷歌学者]
44Li T、Snyder WK、Olsson JE、Dryja TP。携带显性视紫红质突变P347S的转基因小鼠：视紫红素向外节段的载体运输缺陷的证据。美国国家科学院程序。1996;93:14176–14181. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Zhao Y，Hong DH，Pawlyk B，Yue G，Adamian M，Grynberg M，Godzik A，Li T.视网膜色素变性GTPase调节器（RPGR）-相互作用蛋白：支持RPGR功能并参与椎间盘形态发生。美国国家科学院程序。2003;100:3965–3970. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46.Avidor-Reiss T、Maer AM、Koundakjian E、Polyanovsky A、Keil T、Subramaniam S、Zuker CS。解码纤毛功能：定义分隔纤毛生物发生所需的特殊基因。单元格。2004;117:527–539.[公共医学][谷歌学者]
47Li JB、Gerdes JM、Haycraft CJ、Fan Y、Teslovich TM、May-Simera H、Li H、Blacque OE、Li L、Leitch CC等。比较基因组学确定了包含BBS5人类疾病基因的鞭毛和基底体蛋白质组。单元格。2004;117:541–552.[公共医学][谷歌学者]
48Sayer JA、Otto EA、O'Toole JF、Nurnberg G、Kennedy MA、Becker C、Hennies HC、Helou J、Attanasio M、Fausett B等。Joubert综合征中一种新的中心体蛋白肾胱氨酸-6突变并激活转录因子ATF4/CREB2。自然遗传学。2006新闻界。[公共医学][谷歌学者]
49Pang JJ、Chang B、Hawes NL、Hurd RE、Davisson MT、Li J、Noorwez SM、Malhotra R、McDowell JH、Kaushal S等。视网膜变性12（rd12）：一种新的自发出现的人类Leber先天性黑蒙症（LCA）小鼠模型摩尔粘度。2005;11:152–162.[公共医学][谷歌学者]
50Cheng H，Khanna H，Oh EC，Hicks D，Mitton KP，Swaroop A.光受体特异性核受体NR2E3在视杆光感受器中起转录激活剂的作用。人类分子遗传学。2004;13:1563–1575.[公共医学][谷歌学者]