肥胖与代谢失衡有关，代谢失衡会导致脂肪细胞肥大和增生导致脂肪组织质量增加(1). 重要的是，脂肪组织本身是系统代谢的关键调节器(2)这表明，脂肪生成的调节应该比仅仅改变脂肪组织质量具有更大的系统性影响。事实上，了解调节脂肪生成的信号可能对糖尿病等疾病具有广泛的意义。
脂肪细胞来源于多潜能祖细胞，这些祖细胞被招募到脂肪细胞命运中(三,4). 一组未完全定义的因子和细胞因子启动分化级联反应，其中干细胞致力于谱系，例如成为“前脂肪细胞”。进一步的信号通过诱导增殖并最终分化为脂溶性脂肪细胞来继续进展(5). 为了更好地定义这些信号，已经建立了脂肪生成的组织培养模型。这些研究已经确定了一种“混合物”因素，包括地塞米松、胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤（DIM），可以在细胞培养中引发脂肪生成(5). 然而，人们对这种混合物每种成分的具体作用知之甚少。
肌生长抑制素（MSTN），也称为生长分化因子8（GDF8），是TGF-β超家族的成员。肌肉组织中的MSTN功能已被广泛研究(6,7)但其在脂肪组织中的作用尚不清楚。例如，地塞米松诱导肌肉细胞中MSTN的表达(8)但尚不清楚这种调节是否也发生在脂肪生成过程中，或MSTN是否参与分化过程。与MSTN在脂肪生成早期的作用一致，MSTN表达或活性的降低导致小鼠脂肪组织减少(9——11). 此外，其他研究表明，MSTN在细胞命运决定中发挥作用，使分化偏向脂肪细胞谱系而远离肌肉谱系(12). 然而，矛盾的是，对前脂肪细胞中MSTN表达和作用的研究表明，MSTN抑制而不是促进成熟脂肪细胞的形成(13,14).
我们试图探讨MSTN与DIM混合物中地塞米松成分之间的关系，并更好地了解这些信号的功能和作用。我们研究了这些信号如何调节细胞培养和小鼠的脂肪生成，并评估了它们的作用对细胞和系统的影响。
结果
MSTN由地塞米松在C3H10T1/2细胞中诱导并参与脂肪生成。
我们首先检测了地塞米松是否在C3H10T1/2细胞系中诱导MSTN，该细胞系在特定条件下可以分化为脂肪、肌肉、骨骼或软骨(15)；因此，C3H10T1/2具有间充质干细胞的特性。DIM诱导该细胞系的脂肪生成(16). 合成糖皮质激素地塞米松是混合物的基本成分，因为胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤的结合不会导致脂肪生成(). 通过实时定量PCR，我们发现在没有地塞米松的情况下，在C3H10T1/2中无法检测到MSTN的表达，并且在地塞米森暴露4h后显著诱导（>100倍）MSTN表达。因此，分化混合物中的糖皮质激素成分在C3H10T1/2细胞中强烈调节MSTN的表达。
MIM在C3H10T1/2细胞中诱导脂肪生成，但在3T3-L1细胞中不诱导。C3H10T1/2(上部)或3T3-L1(下部)细胞生长到汇合处。然后将细胞暴露于异丁基甲基黄嘌呤和胰岛素（IM，左侧)或带DIM(居中)或MIM(赖特). 培养6-10天后，细胞固定并用Oil-Red-O染色以鉴定脂肪细胞。IM不足以诱导两种细胞系的脂肪生成。DIM诱导两种细胞系的脂肪生成。在C3H10T1/2细胞中，MIM诱导脂肪生成，但在3T3-L1细胞中没有。
然后，我们检查了在DIM混合物（MIM）中添加重组纯化MSTN是否可以替代地塞米松。如所示，MIM混合物诱导了显著水平的脂肪生成，这是通过Oil-Red-O染色评估的细胞内脂滴的积聚来定义的(13).
为了进行比较，我们检测了3T3-L1细胞，这是一种广泛研究的细胞系，它比C3H10T1/2细胞进一步分化，因为它属于脂肪细胞谱系。虽然3T3-L1尚未完成分化，因此通常被称为前脂肪细胞系，但它可以通过DIM混合物有效地分化为成熟脂肪细胞。与我们在C3H10T1/2细胞中的发现不同，DIM混合物而非MIM混合物诱导3T3-L1细胞的脂肪生成(). 这一结果与之前研究MSTN在该细胞系中作用的报告一致(13). 从表面上看，我们的结果表明，如果将MSTN提供给早期细胞（如间充质干细胞），MSTN可以作为MIM混合物的一部分诱导脂肪生成，但它在脂肪细胞承诺细胞（如3T3-L1）中已失去功效。
MSTN诱导的脂肪细胞较小且明显不成熟。
有趣的是，MIM诱导的C3H10T1/2脂肪细胞小于DIM处理产生的脂肪细胞(). 为了进一步研究这些小脂肪细胞，我们测量了一系列脂肪细胞特异性基因的表达，其中三个（过氧化物酶体增殖物激活物受体γ、脂肪酸结合蛋白脂肪细胞P2（aP2）和脂蛋白脂肪酶）在成熟脂肪细胞中的表达水平升高，而一个（前脂肪细胞因子1）与脂肪生成早期相比，成熟脂肪细胞中表达水平较低(16,17). MSTN诱导的小脂肪细胞以类似于脂肪生成完成前观察到的模式表达这些标记物(A类)表明它们可能是未成熟脂肪细胞。
MSTN诱导C3H10T1/2细胞的脂肪生成。在融合的C3H10T1/2细胞中，MIM均可诱导脂肪生成(A类,C、和E类)或DIM(B,天、和F类). 细胞在培养过程中在光学显微镜下拍照(A类和B)或用Oil-Red-O固定和染色后(C——F类). 与地塞米松治疗后形成的脂肪细胞相比，MSTN治疗后生成的脂肪细胞更小，并且似乎含有更少的脂质。暴露于异丁基甲基黄嘌呤和胰岛素或单独暴露于每种成分的细胞脂肪生成最小（数据未显示）。（放大倍数：A类,B,E类、和F类, ×200;C和天, ×100.)
MSTN暴露产生的脂肪细胞具有未成熟脂肪细胞的表达谱。(A类)实时定量PCR用于比较MIM或DIM暴露后培养的脂肪细胞之间的表达模式(n个=每种情况下4）。(左上)MSTN诱导的脂肪细胞具有较低水平的成熟脂肪细胞标记物过氧化物酶体增殖物激活物受体γ（PPAR）、aP2和脂蛋白脂肪酶（LPL），以及较高水平的未成熟标记物前脂肪细胞因子1（Pref-1）。(右上)与地塞米松诱导的脂肪细胞相比，MSTN诱导的培养脂肪细胞的脂肪因子表达水平也较低。(下部)MSTN转基因（TG）小鼠具有类似的未成熟脂肪组织表达谱和较低水平的脂肪因子表达。(B)通过对转基因（Tg）小鼠和WT同窝小鼠血清进行ELISA检测，转基因动物的循环脂联素水平较低。误差条表示SD。
成熟脂肪组织显示内分泌功能，分泌大量脂肪因子(2). 因此，与地塞米松诱导的脂肪细胞相比，我们测量了MSTN暴露后脂肪细胞中脂肪因子的表达。与地塞米松诱导的相比，小脂肪细胞表达的脂肪因子水平较低，这进一步支持了MSTN诱导的脂肪细胞是未成熟的假设(A类).
aP2-MSTN转基因小鼠的脂肪细胞。
我们接下来调查了体内我们的相关性在体外通过产生在脂肪生成细胞中表达MSTN的转基因小鼠的发现；具体来说，我们在aP2启动子和调节元件（aP2-MSTN）的控制下构建了MSTN转基因。该启动子在C3H10T1/2间充质细胞系和小鼠骨髓中活性，并在整个脂肪生成过程中保持活性(A类). 该启动子和调节元件的使用也在其他动物模型中得到验证；例如，具有相同转基因启动子和增强子元件的aP2-Wnt10b小鼠显示间充质干细胞命运发生改变(18).
aP2-MSTN小鼠具有良好的代谢特征，并对肥胖具有抵抗力。(A类)转基因（Tg）构建是通过在aP2启动子后亚克隆全长MSTN cDNA而创建的。通过对WT和转基因小鼠脂肪组织产生的cDNA进行实时定量PCR扩增，检测到转基因小鼠MSTN过度表达10倍。引物P1和P2用于扩增转基因特异性cDNA，而引物P1和P3用于比较MSTN的总表达水平。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）定量PCR扩增用于控制样品之间的cDNA浓度。(B)对两个瘦小鼠进行葡萄糖耐量试验(上部)和高脂肪饮食的老鼠(下部). 隔夜禁食（时间=0）后检查血糖水平，然后腹腔注射2 g/kg葡萄糖。在葡萄糖丸后，在每个时间点检查尾血糖水平。在60分钟的时间点，所有食用高脂肪饮食的野生动物的血糖都高于仪表的上限，因此在该时间点使用了上限值（600 mg/dl）。aP2-MSTN小鼠对胰岛素的敏感性高于其与WT同窝的正常小鼠(P（P）=0.0061）和高脂肪食物(P（P）= 0.0025). (C)将aP2-MSTN小鼠及其WT窝友置于高脂肪饮食中7周。转基因小鼠(右下角)对野生型动物产生的肥胖具有抵抗力(左下方). (天)aP2-MSTN小鼠的空腹血糖、胰岛素和甘油三酯水平低于其WT同胞。误差条表示SD。
尽管aP2 MSTN小鼠比同窝出生的WT小鼠小(C)除此之外，他们看起来比例匀称，健康，没有严重畸形。然而，来自aP2-MSTN转基因小鼠的脂肪组织显示出基因表达谱，并且细胞尺寸减小，与MIM混合物分化的脂肪细胞相似在体外(A类图6，作为支持信息发布在PNAS网站上）。这一特征与WT小鼠脂肪组织中的表达模式形成对比，WT小鼠的脂肪组织显示出成熟脂肪细胞特征。与这些发现一致，我们发现aP2-MSTN小鼠的血清脂联素水平相对于WT降低(B). 因此，两者都是在体外和体内，MSTN导致具有不同表达谱的脂肪细胞的形成。
脂肪组织中MSTN转基因表达的代谢效应。
接下来，我们研究了aP2-MSTN小鼠脂肪组织改变的系统代谢后果。我们对喂食普通食物的瘦小鼠进行了葡萄糖耐量试验。与它们的WT同胞相比，转基因动物表现出明显更高的胰岛素敏感性，表现为其较低的空腹血糖水平、较低的高血糖水平和较快恢复正常血糖水平(B 上部).
接下来，我们对喂食高脂肪饮食7周的小鼠进行了葡萄糖耐量测试。WT动物表现出胰岛素抵抗的证据，如高血糖和接受葡萄糖丸后延迟恢复正常血糖。这一发现在患有胰岛素抵抗的小鼠和人类中很常见，通常用作人类II型糖尿病的诊断试验(19). 与此形成鲜明对比的是，aP2-MSTN转基因小鼠在高脂肪饮食中保持了正常的胰岛素敏感性，这是通过其较低的空腹血糖和正常的糖耐量测试来评估的(B 下部).
MSTN转基因表达导致脂肪细胞胰岛素敏感性自主增加。
为了确定系统性胰岛素敏感性是否可归因于脂肪细胞的改变，从WT和转基因动物中纯化初级脂肪细胞，并通过测量摄取[三H] 2-接触胰岛素后脱氧葡萄糖。从WT动物中采集的脂肪细胞对胰岛素的反应是细胞内葡萄糖浓度增加3倍，而aP2-MSTN动物的脂肪细胞则增加7倍。这些结果表明，aP2-MSTN小鼠的胰岛素敏感性至少在一定程度上是脂肪细胞的细胞自主效应。为了评估系统因素（如肥胖）影响这些结果的可能性，对分化为脂肪细胞的C3H10T1/2细胞进行了相同的实验在体外使用MIM或DIM。MIM培养产生的脂肪细胞对胰岛素的敏感性是DIM诱导脂肪细胞的3倍。
aP2-MSTN小鼠体内有益的系统胰岛素、葡萄糖和甘油三酯水平。
为了测试未成熟脂肪细胞是否对其他代谢紊乱有保护作用，我们测量了aP2-MSTN小鼠与年龄匹配的WT动物的空腹胰岛素、葡萄糖和甘油三酯水平，这两种动物均维持在高脂肪饮食中。转基因动物没有表现出WT小鼠明显的代谢综合征特征。特别是，转基因小鼠的空腹胰岛素、葡萄糖和甘油三酯水平显著低于野生型小鼠(天).
aP2-MSTN转基因小鼠代谢率增加，对饮食诱导的肥胖有抵抗力。
在代谢笼中检测了转基因瘦鼠和WT同窝小鼠的能量平衡，连续测量食物摄入量、运动活性和代谢率（通过耗氧量（VO）计算）2). aP2-MSTN小鼠的代谢率高于WT小鼠(P（P）=0.005），而活动和食物摄入（归一化为总体重）相似(A类). 这一发现表明转基因动物可能对饮食诱导的肥胖有抵抗力。因此，将转基因动物和对照动物置于高脂肪饮食中7周，并通过双能x射线吸收仪扫描监测脂肪组织的数量。正如预期的那样，WT小鼠在这种饮食中变得肥胖，平均体脂为38%，而aP2-MSTN小鼠对体重增加有抵抗力，达到26%的最大平均体脂(C). 因此，aP2-MSTN动物体内的脂肪细胞似乎会产生较高的代谢率，并对肥胖的发展产生抵抗力。
与WT同窝小鼠相比，aP2-MSTN转基因小鼠的代谢率增加，脂肪组织中的糖酵解增加。(A类)将转基因（Tg）和野生型（WT）窝友放在代谢笼中，同时测量代谢率（通过气体交换计算）、活动、食物摄入量和体重。转基因动物的代谢率增加(P（P）=0.005），食物摄入量略有增加，活动与野生动物同窝伙伴相似。这种新陈代谢率的增加可能有助于保护动物不致肥胖。(B)定量实时PCR用于测量小鼠脂肪组织中葡萄糖利用相关基因的表达水平。转基因动物的葡萄糖转运相关基因（GLUT1和GLUT4）和糖酵解途径中的酶[葡萄糖激酶（GK）、己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）]的表达水平高于WT同窝动物。此外，aP2-MSTN动物的一些与脂肪生成有关的基因[脂肪酸合成酶（FAS）和二酰甘油酰基转移酶2（DGAT2）]的表达水平较低。(C)通过使用14C葡萄糖（参见方法). 与DIM暴露后产生的脂肪细胞相比，MIM暴露后生成的脂肪细胞具有较高的细胞自主葡萄糖氧化速率(P（P）= 0.001). 误差条表示SD。
MSTN转基因表达导致葡萄糖氧化增加。
接下来，我们研究了瘦动物的耗氧量和有氧代谢，使用代谢笼来测量呼吸交换比（VCO2/VO（旁白）2). 虽然没有统计学意义，但转基因动物的比率高于野生动物(A类)这表明aP2-MSTN小鼠比WT小鼠更能氧化葡萄糖产生能量。与此观点一致，定量实时PCR显示aP2-MSTN小鼠脂肪组织中mRNA编码葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT4以及关键糖酵解酶己糖激酶、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶和丙酮酸脱氢酶的表达增加。此外，与WT相比，转基因脂肪组织中脂肪生物合成酶（如脂肪酸合成酶和酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶2）的mRNA表达下调(B). 这些结果表明，转基因动物体内代谢率的增加和对肥胖的抵抗力反映了脂肪组织中葡萄糖摄取和葡萄糖氧化的增加。
为了确定MSTN诱导的脂肪细胞是否以细胞自主的方式使用更多的葡萄糖，我们使用14C-标记葡萄糖（参见方法)与DIM处理产生的脂肪细胞相比，在通过MIM暴露分化为脂肪细胞的C3H10T1/2细胞中。正如预测的那样，MSTN治疗后生成的脂肪细胞(P（P）=0.001）比地塞米松诱导的脂肪细胞葡萄糖氧化更多(C).
讨论
我们已经证明，间充质干细胞中的MSTN是由地塞米松诱导的，它可以替代地塞米森诱导脂肪生成。相反，MSTN不能触发3T3-L1前脂肪细胞系的脂肪生成。我们推测，在间充质干细胞的细胞命运测定和早期分化过程中可能存在一个敏感区间，其中MSTN可以诱导脂肪生成，并且敏感期在3T3-L1细胞所代表的前脂肪细胞阶段之前结束。这一假设可以解释之前报道的MSTN看似矛盾的影响。此外，该假设与MSTN基因敲除小鼠的研究结果一致。这些动物的脂肪组织减少，这可能是由于脂肪生成的起始受损所致。
重要的是，MSTN在C3H10T1/2中诱导的脂肪生成产生了保持未成熟脂肪细胞表达谱的细胞。此外，脂肪生成过程中MSTN的表达体内产生了类似的结果，这些小鼠的脂肪组织保持了这种独特的表达模式。我们假设MSTN暴露后生成的脂肪细胞代表了脂肪生成的一个新阶段，它比前脂肪细胞进一步分化，但比完全分化的脂肪细胞更早。根据该模型，含有地塞米松的分化条件（如DIM混合物）会触发细胞通过这一阶段，而含有MSTN的条件（如MIM混合物）则会导致未成熟脂肪细胞的积聚。我们在MSTN转基因小鼠中的发现表明，MSTN的表达可能主要抑制脂肪生成的后期阶段，因为这些动物当然是糖皮质激素充足的。事实上，我们已经在C3H10T1/2细胞中观察到MSTN的这种显性负性行为（B.J.F.，未发表的结果）。在未来的研究中，研究糖皮质激素和MSTN信号在脂肪生成中的机制关系，并确定MSTN诱导的细胞是沿着完全分化途径的前体细胞，还是代表从该途径中退出的分支，将是一件有趣的事。
最后，值得注意的是，MSTN诱导的脂肪细胞对代谢有良好的影响。特别是，代谢研究表明，这些变化导致胰岛素敏感性和对肥胖的抵抗力提高，这至少部分是由于葡萄糖氧化增加。这些发现表明，改变脂肪生成的最后阶段，例如通过靶向MSTN暴露，可能对患有代谢性疾病（如糖尿病）的人有治疗益处。
方法
组织培养和分化分析。
C3H10T1/2细胞来自加利福尼亚大学旧金山组织培养核心设施。3T3-L1细胞取自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞在补充有1 mM丙酮酸和10%FBS的高糖DMEM中生长汇合。汇合细胞在两天后暴露于1μM地塞米松（西格玛，圣路易斯，密苏里州）或40 nM重组MSTN（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）以及11.5μg/ml异丁基甲基黄嘌呤（西格马）和24 ng/ml胰岛素（西格曼）。细胞培养10天，每2天用新鲜DMEM和10%FBS替换一半培养基。
定量PCR。
按所述进行定量PCR(20)使用Opticon2机器和软件（MJ Research，Cambridge，MA）。使用的引物序列可根据要求提供。
转基因小鼠的产生。
从小鼠肌肉RNA（Stratagene，La Jolla，CA）中扩增MSTN cDNA。该cDNA在aP2启动子和调控域后面，在poly（a）序列前面进行亚克隆（来自密歇根州安阿伯市密歇根大学奥蒙德·麦克道格尔德的礼物）。加州大学旧金山分校转基因癌症核心设施使用FVB菌株对转基因小鼠进行微注射并将其移植到假孕小鼠体内。使用转基因特异性引物通过PCR进行基因分型。所有小鼠均被安置在无病原体屏障型设施中（12小时光照/12小时暗循环）。所有研究均使用雄性小鼠，它们被喂食标准的饮食（5053 PicoLab饮食；普瑞纳，圣路易斯，密苏里州）或高脂肪的西式饮食（TD.01064，Harlan-Teklad，麦迪逊，威斯康星州），其中含有20%的无水乳脂、1%的玉米油和0.2%的胆固醇（按重量计）。所有动物研究均由加利福尼亚大学旧金山动物研究委员会批准。
葡萄糖耐量测试。
雄性转基因(n个=5）和重量(n个=7）同窝动物在3-4个月大时禁食过夜。用一触式超血糖仪和试纸从尾静脉血中获取空腹和随后的血糖水平。将溶于无菌生理盐水中的葡萄糖（2 g/kg）注入小鼠腹腔，监测血糖。
原代脂肪细胞的分离和葡萄糖转运的测定。
如前所述，测定了来自转基因和WT窝友的纯化初级白色脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖转运(1,21). 简单地说，脂肪库用I型胶原酶（2 mg/ml；新泽西州莱克伍德市沃辛顿生化公司）处理，并通过500μm尼龙网过滤。用Krebs-Ringer-Hepes缓冲液和2.5%BSA洗涤脂肪细胞三次[三H] 2-脱氧葡萄糖加胰岛素和不加胰岛素30分钟。通过使用邻苯二甲酸二壬酯（比例2:3）通过硅油DC550从培养基中纯化脂肪细胞。细胞内[三H] 用闪烁计数器定量2-脱氧葡萄糖。脂肪细胞产量在样本之间是可变的，因此，通过计算基础样本和胰岛素诱导样本之间的倍数变化，可以对胰岛素敏感性进行内部标准化。
葡萄糖氧化速率。
葡萄糖氧化速率的测定如下所述(22). 简单地说，用MIM、DIM或载体处理汇合的C3H10T1/2细胞，并按所述培养10天。细胞在Krebes-Ringer-Hepes缓冲液中清洗并饥饿2小时。C14将葡萄糖单独（基础）或与胰岛素一起添加到培养基中，并在37°C下培养细胞2小时。14一氧化碳2加入2 M HCL后释放，并通过闪烁计数进行定量。
身体成分。
小鼠禁食4小时，并用异氟醚麻醉，用PixiMus2扫描仪（威斯康星州麦迪逊市通用医疗月球公司）通过双能x射线吸收仪分析其身体成分。
能量平衡。
食物摄入量和耗氧量（VO2)在3天内通过间接量热法（Oxymax综合实验动物监测系统，俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司）进行测量。这两个参数均被归一化为瘦体重，这是在开始热量测定研究的当天通过双能x射线吸收仪扫描测量的。对三只WT和五只转基因雄性小鼠进行了研究。P（P）使用双尾计算值t吨测验。
