美国国家科学院院刊。1999年3月16日；96(6): 2828–2833.
一种突变的去泛素酶（Ubp-M）与有丝分裂染色体相关并阻止细胞分裂
耶鲁大学医学院博伊尔分子医学中心，康涅狄格州纽黑文06536
*转载请求收件人：耶鲁大学医学院博伊尔分子医学中心，地址：295 Congress Avenue，Room 109A，P.O.Box 9812，New Haven，CT 06536-0812。电子邮件：ude.elay@isehcram.tnecniv。 文森特·马切西撰稿
摘要
在哺乳动物细胞中发现了一种新的泛素加工蛋白酶（Ubp-M），它在有丝分裂开始时磷酸化，在中期/后期转变时去磷酸化。823-aa蛋白的羧基末端结构域可以磷酸化在体外用有丝分裂细胞的提取物或纯化的cdc-2/细胞周期蛋白B复合物。重组Ubp-M能够氘化组蛋白H2A在体外磷酸化形式也具有酶活性。野生型Ubp-M暂时表达为绿色荧光蛋白融合蛋白，定位于培养细胞的细胞质中，但突变型缺乏活性位点半胱氨酸，在细胞分裂的所有阶段与有丝分裂染色体紧密结合，并在有丝分裂后留在细胞核内。转染含有突变Ubp-M基因质粒的细胞停止分裂，最终发生凋亡。Ubp-M可将一个或多个参与有丝分裂染色体凝聚的关键蛋白去偶素化，可能选择性作用于组蛋白H2A和H2B，这是染色质的主要泛素化蛋白。
泛素与赖氨酸侧链的酶连接使大量关键调节蛋白共价修饰，这种修饰常常导致其蛋白水解降解(1，2). 调节细胞周期的蛋白质，如细胞周期蛋白B和p27，以及激活或抑制特定蛋白激酶的蛋白质，被多蛋白复合体泛素化，称为后发复合体或环体(三，4).
普遍认为，共价结合的多泛素链通过内部异肽键连接成聚合物，被26S蛋白质组的一个或多个亚单位识别为最终导致泛素化蛋白质降解的途径的第一步(5——7). 虽然泛素本身是76-aa多肽，但它们不会被蛋白质体降解，而是通过泛素加工蛋白酶（Ubps）或去泛素酶（DUB）的作用回收。泛素与多肽结合的酶和蛋白质辅因子已被广泛研究(8，9)但我们对泛素加工酶如何发挥作用的理解远远落后。许多蛋白质在有丝分裂期间被泛素化，然后被降解，但还不知道去泛素酶在有丝周期中是如何、何时或何地起作用的。此外，许多研究表明，脱泛素酶从降解的蛋白质中回收泛素并不是其唯一的功能。
酵母菌被认为含有20种或20多种可能具有泛素加工活性的蛋白质(10)，但单个Ubps如何识别特定的底物，或者它们本身是如何被监管的，仍然没有解决。将泛素附着到蛋白质底物上的酶，称为泛素结合酶，具有共同的活性位点，并具有决定底物特异性和细胞内定位的独特结构域(11——13); 泛素加工酶很可能具有类似的性质，但迄今为止，还没有任何定义。
除了在有丝分裂期间蛋白质降解中的作用外(14)以及细胞因子激活的生长调节因子的处理(15，16)最近的研究表明，去泛素酶与沉默信息调节蛋白（silent information regulator，SIR）共同参与调节染色质的转录活性(17)中的、和果蝇属其中泛素加工酶（D-Ubp-64E）的突变形式改变了位置效应变异(18). 在这两种情况下，泛素处理都是必要的，但尚不确定去除附着的泛素如何影响基因表达或有助于染色质稳定。
20多年来，组蛋白H2A和H2B都是单泛素化的(19)，但这种翻译后修饰不会导致蛋白质降解增强(20). 正常情况下，有5%到10%的核组蛋白H2A和H2B在间期内泛素化，但一项精确同步的黏菌细胞研究发现，这两种组蛋白在中期都完全氘化，这与有丝分裂染色质的完全浓缩相一致(21). 随着细胞进入后期，几分钟后，两种组蛋白都被重新泛素化。
我们已经鉴定了一种新的去泛素化酶（Ubp-M），它在有丝分裂周期的关键点被磷酸化，然后去磷酸化，其性质和行为表明，它可能通过去泛素化组蛋白或其他相关底物，在调节有丝分裂染色质中发挥一定作用。
材料和方法
Ubp-M的识别。
为了克隆Ubp-M基因，用IgM单克隆抗体筛选了两个人类cDNA文库，即Jurkatλgt11（耶鲁大学医学院纽黑文分校S.Weissman的礼物）和HeLa Uni-ZAP RX（Stratagene），该单克隆抗体是针对来自中国仓鼠有丝分裂卵巢（CHO）细胞的磷蛋白混合物培养的。共筛选出7个阳性克隆：4个来自Jurkat文库，大小分别为2.1、1.9、1.6和1.3 kb，3个来自HeLa，大小分别是2.1、2.0和1.4 kb。这些克隆的DNA序列表明，所有七个克隆在3′端的序列相同，但在5′端有不同大小的延伸。Northern blot分析显示，在多种组织中存在3.0kb的转录物。从5′端克隆制备了许多探针，以搜索额外的唯一5′序列，但所有新克隆都与编码相同多肽链的单个ORF一致。其中三个包含整个编码区域。
有丝分裂周期中Ubp-M的磷酸化。
通过将CHO细胞隔夜培养物在37°C下暴露于诺卡唑（0.25μM）中4小时，并通过机械搅拌收集前中期细胞，制备CHO细胞的同步培养物。在取样之前，将细胞在培养基中洗涤并在悬浮液中孵育不同时期。在标准Laemmli缓冲液中溶解等分细胞，并使用10%聚丙烯酰胺凝胶通过SDS/PAGE进行分析。对于免疫印迹，将凝胶转移到硝化纤维纸（Schleicher&Schuell）上过夜，然后在室温下用3%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水中封闭1小时，在一级和二级抗体中分别培养45分钟，并在使用增强化学发光系统处理后记录在x射线胶片上。使用谷胱甘肽在鸡体内饲养的多克隆抗血清S公司-转移酶（GST）-融合肽（pGEX-3X，Pharmacia）来源于Ubp-M N末端结构域的前190个氨基酸，用于跟踪Ubp-M的迁移率随磷酸化程度的变化。
体外试验Ubp-M的磷酸化。
GST-Ubp-M在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上富集，然后用悬浮生长的同步CHO细胞制备的提取物在37°C下培养45分钟。孵育后，通过离心收集珠子，在SDS溶解缓冲液中溶解，并用单克隆IgM抗体进行免疫印迹分析。含有结合GST-Ubp-M的谷胱甘肽Sepharose珠也在cdc-2/cyclin B复合物（来自新英格兰生物实验室）和[γ-32P] ATP，含或不含olomoucine（200μM）。
脱泛素分析。
脱泛素分析在共转化大肠杆菌或用重组蛋白的可溶性提取物。对于共转化测定，将GST-UPP-M构建体或GST-DUB（剑桥大学哈佛医学院Alan D’Andrea赠送的礼物）与pACYC184 Ub-Met-beta-gal（芝加哥大学Mark Hochstrasser赠送的礼物）共转化为MC1061大肠杆菌.用异丙基β诱导隔夜培养-d日-用SDS/PAGE分析硫代半乳糖苷和总裂解物，并用抗β-半乳糖甙酶抗血清进行免疫印迹。以泛素化绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白为附加底物，利用PCR方法产生Ub-GFP嵌合基因，插入pET-28a载体（Novagen）中，表达为组氨酸融合蛋白。
组蛋白H2A/H2B二聚体的制备（来自马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学E.Moudrianakis的礼物）用于跟踪用谷胱甘肽珠纯化的野生型和突变型Ubp-M的GST融合蛋白的氘化活性。将等分的组蛋白二聚体（10μg）和GST-Ubp-M（2μg）或其突变形式在37°C下培养30和45 min，并使用15%聚丙烯酰胺凝胶通过SDS/PAGE分析产物。
GFP融合蛋白的制备。
在巨细胞病毒启动子的控制下，使用pEGFP-C1载体（CLONTECH）将Ubp-M基因插入GFP基因的3′端，得到含有GFP的融合蛋白。通过PCR将Flag肽标签添加到Ubp-M的N末端，亚克隆到pBluescript（KS）中，并通过测序确认产物。
为了产生Ubp-M的突变克隆，其中活性位点半胱氨酸被丝氨酸取代为唯一的变化，将标记有鞭毛的Ubp-M-基因亚克隆到pAlter-Max载体（Promega）中，并合成一个突变寡核苷酸（5′-AACTGCATGAGAAGGTGTTTCCCAAATT-3′），将C205转变为S，然后通过Hin公司使用改变位点II哺乳动物突变系统，在所需突变位点进行dIII。
GFP融合蛋白的定位。
GFP-Ubp-M构建物通过脂质体感染或磷酸钙共沉淀按照制造商的方案瞬时转染到多个细胞系（293T、CHO、COS-7）。细胞生长在玻璃盖玻片上，并在室温下于4%多聚甲醛/0.1%戊二醛/0.25%Triton X-100/PBS中固定15–30分钟，在5%BSA/PBS中封闭，在蒸馏水中清洗，安装在含有0.05%4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的明胶基培养基中，并用尼康Mikorophat FXA进行检查和拍照。
为了确定转染后不同时间表达GFP融合蛋白的细胞比例，我们使用相差显微镜拍摄了生长在网格标记盖玻片上的活细胞群体，然后通过荧光显微镜确定表达GFP的细胞数量。每个构造大约有500个细胞。对固定细胞进行了类似计数，但显示阳性荧光的细胞比例较低，因为固定细胞在处理过程中有冲掉盖玻片的趋势。
结果和讨论
我们对一种新的泛素处理酶进行了表征，该酶是通过筛选两个哺乳动物cDNA文库，用一种针对有丝分裂磷酸蛋白富集混合物的IgM单克隆抗体进行鉴定的。根据与许多其他已知加工酶共享的肽段，为823 aa的独特多肽链编码的抗体阳性克隆被鉴定为Ubp（见图。A类). 不同组织提取物的Northern blot显示，编码该蛋白的3-kb转录本存在于所有检测组织中（图。B类). 为了证实Ubp-M确实是一种活性加工蛋白酶，将不同重组形式的酶与两种泛素化底物，泛素β-半乳糖苷酶（标准Ubp底物）和泛素化GFP孵育。这两种底物都被野生型Ubp-M裂解，但活性位点半胱氨酸被丝氨酸取代的突变形式是不活跃的（图。C类). 这两种测定都是测量泛素加工活性的有用方法，我们认为它们提供了酶作用于天然存在的泛素化蛋白的能力的一些指示。下文所述的后续研究表明，Ubp-M能够裂解潜在的重要生理底物。
(A类)从Jurkat和Hela细胞库中分离的cDNA克隆推导出Ubp-M的氨基酸序列。强调了与已知泛素加工蛋白酶序列高度同源的序列。(B类)使用全长Ubp-M探针对人体组织进行Northern印迹。通道A-L中装载了来自胎脑、胎肺、胎肝、胎肾、心脏、大脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺的提取物。(C类)Ubp-M的去泛素活性(上部)酶活性Ubp-M（GST-6R）通过去除8.0-kDa泛素增加β-半乳糖苷酶的流动性，这是由Alan D’Andrea提供的一种去泛素酶DUB-2的活性(15). 突变体Ubp-M（6R突变体）不活跃。(下部)泛素化GFP（Ub-GFP）的流动性也因两种形式的Ubp-M、可溶性Ubp-M-或GST-融合蛋白（GST-6R）而增加。
在G期培养的CHO细胞中Ubp-M被磷酸化2/并在诺康唑治疗后前中期收获的细胞中最大限度地磷酸化。我们通过分析Ubp-M的迁移率作为有丝分裂周期的函数来确定这一点，使用针对GST-Ubp-M融合蛋白产生的多克隆抗体，该融合蛋白含有源自氨基末端的190个氨基酸的片段。如图所示。当细胞从中期进入后期时，Ubp-M突然转变为去磷酸化状态，这一时间也与细胞周期蛋白B的降解和姐妹染色单体的分离同时发生，这标志着后期的开始。Ubp-M的完全磷酸化形式存在于被ALLN（一种作用于蛋白体的蛋白水解抑制剂）阻止的中期细胞中(22)但是，如果ALLN阻滞被解除，并且允许细胞进入后期，它就会迅速去磷酸化。这表明Ubp-M的去磷酸化与后期伴随的事件紧密耦合。
有丝分裂周期中Ubp-M磷酸化程度的变化。由于磷酸化作用，前中期（0次）细胞中Ubp-M的迁移率显著降低。完全磷酸化的形式用箭头标记。处于中期/后期过渡期（25分钟）的细胞中出现多条流动性增加的带。后期（45分钟）、末期（75分钟）和有丝分裂后即刻（180分钟）的细胞仅显示出去磷酸化形式，G细胞也是如此1和S相。被ALLN阻滞在中期的细胞显示磷酸化形式的持续存在（ALLN 45分钟），在去除ALLN后（MED 20分钟）在培养基中培养的细胞中去磷酸化。Ubp-M通过按说明制备的细胞提取物的免疫印迹鉴定(18). 在泳道3–9中对等量细胞的提取物进行电泳。
为了确定哪些Ubp-M片段被磷酸化，我们在大肠杆菌并发现完整的分子（残基1-823）和羧基末端片段（残基504-823）都是在大肠杆菌通过一个内部起始位点，被从前期或中期分离的细胞中提取的提取物磷酸化（图。A类). 在有丝分裂后期或紧随其后的细胞中提取的提取物没有活性。我们还发现重组Ubp-M被纯化的cdc-2/cyclin B复合物磷酸化，这一作用被cdc-2激酶抑制剂olomoucine阻断。为了确定Ubp-M的磷酸化是否影响其对氘化底物的能力，我们在之前和之后培养重组形式在体外磷酸化，使用Ub-β-半乳糖苷酶（图。B类)并发现磷酸化重组Ubp-M对这两种底物都具有完全活性。
(A类)Ubp-M的磷酸化在体外. (左侧)将Ubp-M的GST融合蛋白（GST-6R）和截断的羧基末端结构域（40K带）与从有丝分裂不同阶段分离的CHO细胞制备的可溶性提取物一起培养。由于磷酸化增加，前中期和中期细胞提取物降低了条带的流动性。后期、有丝分裂后和缓冲液中的细胞提取物均无效果。SDS/PAGE凝胶用与Ubp-M羧基末端结构域反应的IgM单抗进行免疫印迹分析(赖特)32与[γ]孵育后P并入Ubp-M（GST-6R）-32P] 前中期或与cdc-2/cyclin B制剂孵育后分离的细胞的ATP和提取物。添加olomoucine可通过cdc-2/cyclin B复合物阻断Ubp-M的磷酸化。(B类)磷酸化对氘化活性的影响。泛素化β-半乳糖苷酶（Ub-β-Gal）在与非磷酸化重组Ubp-M（6R）和磷酸化制剂（p-6R）孵育后，转移到低分子量形式，这是去泛素化的结果。在37°C下孵育20分钟后，脱泛素部分完成，40分钟后完成。
为了探索Ubp-M在培养细胞中作为细胞周期功能的作用位点，我们用编码不同版本酶的质粒转染细胞，并比较酶活性GFP标记的融合蛋白与突变对应物的定位，其中活性位点半胱氨酸被丝氨酸取代。这些实验中使用的结构如图所示。A类在HEK-293T细胞中以相当的效率表达Ubp-M的天然形式和突变形式，并且在每种情况下，在转染后的前18小时内在转染细胞的细胞质中发现转录蛋白，如图所示。 B类和C类(上部). 转染酶活性型Ubp-M的细胞继续分裂并表达该酶，并且该酶保留在间期细胞的细胞质中。图。B类(下部)显示转染后培养72小时的细胞中GFP-Ubp-M的定位。同时，在转染突变型Ubp-M的细胞中发现了显著不同的定位。随着培养的进行，继续表达突变型Ubp-M的细胞越来越少，而那些被标记的细胞在其细胞核内具有大多数GFP-Ubp-M-突变形式（图。C下部)，在任何表达酶活性蛋白的细胞中都没有发现这种定位。
转染GFP-Ubp-M融合基因的细胞中Ubp-MGFP-融合蛋白的定位。(A类)构建转染到培养细胞中的具有Ubp-M不同结构域的GFP融合基因。含有催化结构域的DNA片段包含205位半胱氨酸或丝氨酸的密码子。(B类)酶活性GFP-Ubp-M定位于转染后18小时或72小时固定的细胞细胞质。同一细胞的细胞核用DAPI染色。(C类)非活性突变GFP-Ubp-M（C-S）也定位于转染18小时后固定的细胞的细胞质，但72小时后，大部分GFP染色为细胞核。同一细胞的细胞核也被DAPI染色。对细胞进行如上所述的荧光显微镜检查。
在用突变基因转染后检查单个有丝分裂细胞时，发现了另一个差异。突变的Ubp-M似乎覆盖了每一条有丝分裂染色体（图。)当细胞完成胞质分裂并进入末期时，它仍然与染色质相关。酶活性Ubp-M在转染的有丝分裂细胞中分布更为广泛（图。)虽然在某些情况下，它确实集中在染色体附近，但从未发现它覆盖在染色体上，也没有与有丝分裂后染色质相关。转染了许多其他GFP融合蛋白的细胞，包括单独的GFP和与Ubp-M氨基末端片段产生的肽相连的GFP，与有丝分裂染色体没有关联。
突变Ubp-M（C-S）定位于有丝分裂染色体和有丝分裂后染色质。(赖特)突变型Ubp-M（GFP-Ubp-MC-S）可在有丝分裂的所有阶段对染色体进行染色。显示了细胞在前中期、中期、后期和末期固定的示例。DAPI与有丝分裂细胞核的染色重叠，但也对未转染细胞的细胞核进行染色。(左侧)野生型Ubp-M在有丝分裂细胞中广泛定位。在某些情况下，它似乎集中在中期染色体周围，但它不会染色单个染色体，也不会留在有丝分裂后的细胞核中。
转染后20小时分析细胞培养物时，仅含GFP或不同形式Ubp-M的质粒对HEK-293T细胞的转染效率具有可比性（图。)但是，随着培养的进行，表达突变型Ubp-M的细胞数量显著减少。含有不同GFP结构的质粒转染的细胞百分比如表所示在暴露于仅含有GFP编码基因的质粒的培养物中，大约55%的细胞在转染期结束时（20小时）表达GFP。一小部分（40%）表达了GFP-Ubp-M结构，该结构包含突变和天然形式。培养68小时后，继续表达GFP-Ubp-M突变形式的细胞比例显著下降，从转染期结束时的40%降至68小时后的约16%。在同一时期结束时，单独表达GFP或酶活性形式的GFP-Ubp-M的细胞比例基本保持不变，未转染的细胞继续正常生长。
转染后不同时间表达GFP融合蛋白的细胞比例。给出了四个实验的结果。
表1
| 质粒 | 转染后20小时
| 转染后68小时
|
|---|
| 1 | 2 | 三 | 4 | 平均 | 1 | 2 | 三 | 4 | 平均 |
|---|
| GFP控制 | 63.5 | 54.3 | 48.9 | 56 | 55.7 ± 4.1 | 65 | 46.1 | 39.5 | 55.6 | 51.6±7.8 |
| Ubp-M公司 | 52.3 | 31 | 43.7 | 39 | 41.5 ± 6.5 | 42.2 | 32 | 38.3 | 38.1 | 37.7 ± 2.8 |
| Ubp-M突变体 | 47.8 | 39.7 | 39.7 | 33.7 | 40.2±3.8 | 19.1 | 25.5 | 10.9 | 10.2 | 16.4 ± 5.9 |
我们推测，突变型GFP-Ubp-M通过干扰内源性Ubp-M酶的作用而阻止细胞生长，而不是作为非特异性毒剂，因为活性酶的表达对转染细胞没有明显影响。最初，突变型Ubp-M转化的细胞生长正常，其形态学外观没有改变，但随着培养的继续，许多转染细胞似乎发生了凋亡。
我们不知道表达的突变蛋白是否影响HEK-293T细胞内内源性Ubp-M的产生，但CHO和COS细胞对编码突变或反义形式Ubp-M基因的质粒特别敏感。与HEK-293T细胞相比，通过流式细胞术或核形态学分析，转染Ubp-M突变形式或反义GFP-Ubp-M-后，转染COS细胞在24–48小时内发生凋亡。
目前尚不完全清楚为什么泛素处理酶的突变形式与有丝分裂染色体结合，以及为什么它们仍留在有丝分裂后的细胞核内，但有一种可能的解释值得考虑。酶不活性的Ubp-M在其活性部位含有一个氨基酸取代，应该能够与泛素化底物结合，但由于缺乏裂解异肽键的能力，可能仍然与未水解底物结合在一起，类似于特定抑制剂与其他蛋白酶结合并占据其活性部位的方式。染色体上的泛素化蛋白中，组蛋白2A和2B可能是Ubp-M的底物(14). 虽然组蛋白H2A只有5-10%在间期细胞中泛素化，但它是细胞中最丰富的泛素化蛋白，并且作为核心核小体结构的一部分，均匀分布在染色质中。GFP-Ubp-M突变形式对有丝分裂染色体的染色准确反映了泛素化组蛋白的预期分布。
人们已经知道，组蛋白在分裂细胞通过中期时会被重氮化，而在细胞完全分裂时会被重新重氮化(21，23)，但负责泛素这种快速和细胞周期特异性周转的酶尚未确定。我们认为，组蛋白的去泛素化发生在Ubp-M磷酸化、酶活性和有丝分裂染色体可接触的时候，这不仅仅是巧合，组蛋白再泛素化的时间也与Ubp-M去磷酸化及其返回有丝分裂后细胞质的时间一致。组蛋白在有丝分裂完成时的再泛素化可能是由于泛素结合酶的激活或去泛素活性的降低，或两者的结合。
为了确定重组Ubp-M是否能够水解泛素化组蛋白，培养富含组蛋白H2A/H2B的染色质提取物在体外具有活性或突变形式的Ubp-M，并通过SDS/PAGE进行分析，如图所示。基本上，所有可检测到的泛素化H2A/H2B在与酶活性形式的Ubp-M孵育后丢失，而突变酶没有显示出明显的减少。虽然Ubp-M水解泛素化组蛋白的能力在体外不能保证会发生类似的行动体内，的在体外数据与这种可能性是一致的。
组蛋白H2A的泛素化在体外一小部分组蛋白H2A/H2B二聚体制剂是泛素化的（Ub-组蛋白），在SDS/PAGE凝胶上具有较低的流动性。该部分在37°C下与活性Ubp-M孵育后丢失，但不受突变Ubp-M.条带用考马斯蓝染色。
为什么Ubp-M的突变形式阻碍细胞分裂并最终导致程序性细胞死亡？
突变体Ubp-M可以以许多不同的方式与天然的去泛素酶竞争，但其与有丝分裂染色体的紧密结合表明，它可能通过直接影响染色质功能来干扰细胞活力。核小体的晶体学研究进展(24)表明组蛋白H2A的氨基酸通常是泛素化的（赖氨酸-119）位于核小体的一个关键界面附近，在这个位置，一个庞大的泛素分子可能会影响核小体内的堆积。如果组蛋白H2A在有丝分裂期间没有氘化，有丝分裂染色质的凝聚可能会受到影响。染色质不太容易堆积成致密的异染色质，可能对氧化损伤或核酸酶消化更敏感。如果泛素化核小体在有丝分裂过程中始终暴露，则可以向组蛋白H2A中添加额外的泛素，从而形成多泛素链，作为蛋白水解降解的信号。也可以想象，泛素化组蛋白可能影响核小体的其他翻译后修饰，例如负责染色质乙酰化和脱乙酰化的酶。
据报道，作用于染色质的其他去泛素酶也可能直接或间接地与特定组蛋白相互作用。酵母Ubp-3与几种被称为沉默信息调节器（SIRs 2、3和4）的蛋白质相关，这两种蛋白质对基因沉默都至关重要(17)并与组蛋白H3和H4的氨基末端片段相互作用(25). 尽管这些组蛋白不是泛素化的，但晶体学研究表明，哺乳动物染色质中的H3和H4与泛素化的组蛋白2A和2B直接相互作用(24).
众所周知，泛素加工酶在短寿命蛋白质的降解中起着重要作用，但我们在这里描述的酶可能参与泛素转换途径，通过其他机制调节有丝分裂事件，可能包括通过调节组蛋白功能对有丝分裂染色质组织的直接影响。
致谢
我们感谢田旭博士、阿瑟·霍维奇、埃文格洛斯·穆德里安纳基斯和阿兰·德安德里亚博士提供的有益建议，以及卡伦·穆特对手稿的帮助。这些研究部分得到了康涅狄格州西港拜耳公司（Bayer Corporation of West Haven）和露西尔·马基慈善信托基金会（Lucille B.Markey Charitable Trust Foundation）的资助。
缩写
| GFP公司 | 绿色荧光蛋白 |
| 英国石油公司 | 泛素加工蛋白酶 |
| 消费税 | 谷胱甘肽S公司-转移酶 |
| 首席人事官 | 中国仓鼠卵巢 |
| DAPI公司 | 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚 |
工具书类
1Ciechanover A.公司。单元格。1994;79:13–21.[公共医学][谷歌学者] 2霍赫斯特拉瑟·M·。当前操作细胞生物学。1995;7:215–223.[公共医学][谷歌学者] 三。King R W、Peters J-M、Tugendreich S、Rolfe M、Hieter P、Kirschner M W。单元格。1995;81:279–288.[公共医学][谷歌学者] 4苏达金，V。单元格6,185–198.
5Deveraux Q、Ustrell V、Pickart C、Rechsteiner M。生物化学杂志。1994;269:7059–7061.[公共医学][谷歌学者] 6皮卡·C·M。美国财务会计准则委员会J。1997;11:1055–1066.[公共医学][谷歌学者] 7Fu H、Sadis S、Rubin D M、Glickman M、van Nocker S、Finley D、Vierstra R D。生物化学杂志。1998;273:1970–1981.[公共医学][谷歌学者] 8Tong H、Hateboer G、Perrakis A、Bernards R、Sixma T K。生物化学杂志。1997;272:21381–21387.[公共医学][谷歌学者] 9哈斯·A·L、西普曼·T·J。美国财务会计准则委员会J。1997;11:1257–1270.[公共医学][谷歌学者] 10威尔金森K D。美国财务会计准则委员会J。1997;11:1245–1256.[公共医学][谷歌学者] 12Kaiser P、Mandl S、Schweiger M、Schneider R。FEBS信函。1995;377:193–196.[公共医学][谷歌学者] 13Matuschewski K、Hauser H-P、Treier M、Jentsch S。生物化学杂志。1996;271:2789–2794.[公共医学][谷歌学者] 14帕加诺·M。美国财务会计准则委员会J。1997;11:1067–1075.[公共医学][谷歌学者] 15Zhu Y、Carroll M、Papa F R、Hochstrasser M、D'Andrea A D。美国国家科学院程序。1996;93:3275–3279. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Zhu Y、Lambert K、Corless C、Copeland N G、Gilbert D J、Jenkins N A、D'Andrea A D。生物化学杂志。1997;272:51–57.[公共医学][谷歌学者] 17Moazed D，Johnson A D。单元格。1996;86:667–677.[公共医学][谷歌学者] 18Henchoz S、De Rubertis F、Pauli D、Spierer P。分子细胞生物学。1996;16:5717–5725. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Goldknopf I L、Taylor C W、Baum R M、Yeoman L C、Olson M O J、Prestayko A W、Busch H。生物化学杂志。1975;250：7182–7187。[公共医学][谷歌学者] 20布拉德伯里E·M。生物论文。1992;14:9–16.[公共医学][谷歌学者] 21米勒研发、安田H、哈奇C L、邦纳W M、布拉德伯里E M。生物化学杂志。1985;260:5147–5153.[公共医学][谷歌学者] 22Sherwood S W、Kung A L、Roitelman J、Simoni R D、Schimke R T。美国国家科学院程序。1993;90:3353–3357. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23松井S I、Seon B K、Sandberg A A。美国国家科学院程序。1979;76:6386–6390. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Luger K、Mader A W、Richmond R K、Sargent D F、Richmund T J。自然（伦敦）1997;389:251–260.[公共医学][谷歌学者] 25Heckt A、Laroche T、Strahl-Bolsinger S、Gasser S M、Grunstein M。单元格。1995;80:583–592.[公共医学][谷歌学者] 
