肿瘤诱导炎症单核细胞亚群对CD8具有免疫抑制活性⁺T细胞

CD11b基因表达谱分析⁺脾细胞。

使用不同的细胞表面标记尚不足以进一步剖析MSCs的异质性，并鉴定具有免疫调节特性的细胞。因此，我们使用Affymetrix GeneChips进行了全基因组分析。RNA从CD11b中提取⁺从正常小鼠（约5-10个脾脏）和CD11b的混合脾脏中富集的细胞⁺从单个C26-GM荷瘤小鼠的脾脏分离的细胞。立即（时间0）或在完全培养基中孵育24小时后对其进行分析。之所以进行体外培养，是因为我们和其他人已经证明MSCs培养可以提高其抑制活性(1,2,5,14)这表明存在内部分化/成熟计划。每组将三个生物mRNA复制品进行杂交。原始数据已保存，处理值和完整的基因列表可用（基因表达总览[GEO]登录号。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE5455”，“term_id”：“5455”}}GSE5455标准; 网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

微阵列分析证实，所分析的群体因许多上调和下调的基因而分为不同的组（补充结果、补充图3-5和补充表2-8）。CD11b型⁺从荷瘤小鼠新鲜分离的脾细胞与正常小鼠的脾细胞存在两个主要特征。一种是识别编码多形核细胞酶类或与急性炎症反应相关分子的基因（表​（表1）。1). 另一个特征包括细胞因子、膜分子和与巨噬细胞选择性激活相关的标记物。该簇包括几丁质酶3样3（也称为Ym-1）、补体成分4、IL-6、IL-10、IL-1α、IL-1受体II、TGF-β诱导的转录物4和C型甘露糖受体(25,29). A2b腺苷受体对巨噬细胞来说并不是唯一的，因为它也在肥大细胞中表达，但它与细胞因子诱导的巨噬细胞失活有关(30). 综合起来，这些微阵列数据表明CD11b⁺脾细胞包括炎性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞亚群。其他特征无法与特殊的细胞类型明确关联，也无法识别T、B和NK淋巴细胞的明确标记（补充结果和GEO登录号。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE5455”，“term_id”：“5455”}}GSE5455标准).

表1

CD11b中上调的成绩单⁺从荷瘤小鼠脾中分离脾细胞^A类

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CD11b的比较⁺0时和24小时后的脾细胞证实存在导致替代巨噬细胞活化的细胞程序。事实上，培养24小时后，调控最上调的基因之一是精氨酸1，编码Arg1酶，Arg1是公认的交替激活巨噬细胞的标记物，也是MSCs对活化T淋巴细胞抑制活性的关键酶(21). 在24小时培养期间，发现其他基因自发上调，这些基因属于Th2型细胞因子（如IL-4和IL-13）激活的途径（表​（表1）。1). 因此，通过使用IL-4治疗克隆MSC群体，这些基因中大多数的mRNA上调（补充表9）。

CD11b中激活的程序⁺荷瘤小鼠的脾细胞比普通的替代激活更复杂，因为许多过表达基因受I型和II型干扰素的控制。特别地，2个也自发上调（表​（表1），1)，这证实了我们先前的发现，即我-肿瘤诱导CD11b中的精氨酸代谢⁺脾细胞(10,22). 综上所述，这些数据表明MSC是一个特殊的群体，它避开了经典或交替激活的巨噬细胞的严格分类，并表明存在MSC释放的自分泌因子驱动体外MSC成熟/分化。

CD11b型⁺来自荷瘤小鼠的脾细胞产生IFN-γ和IL-13，并需要这些细胞因子来激活抑制程序。

我们推测肿瘤诱导的CD11b体外培养后出现的基因表达谱⁺脾细胞可能是同一细胞释放的细胞因子自分泌作用的结果。CD11b上清液中检测到IL-13和IFN-γ⁺从荷瘤小鼠分离脾细胞并培养48小时（160±25和22000±235pg/ml/10⁵细胞），细胞内染色证实CD11b的相当一部分⁺荷瘤但非无瘤小鼠的脾细胞产生IFN-γ和IL-13（图​（图2）。2). 因此，CD11b⁺从荷瘤IFN-γ-KO小鼠分离的脾细胞产生IL-13，表明这两种细胞因子的表达是不耦合的（图​（图2）。2). ELISA、ELISPOT或细胞内染色未检测到IL-4（数据未显示）。

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图2

CD11b型⁺荷瘤小鼠的脾细胞产生IFN-γ和IL-13。

CD11b型⁺从正常BALB/c和不同荷瘤小鼠（WT-BALB/c、IFN-γ）脾脏分离的细胞^–/–，CD1^–/–和RAG^–/–γ_c（c）^–/–KO小鼠）通过流式细胞术分析细胞内是否存在IL-13（顶部面板）和IFN-γ（底部面板）。开放直方图显示IL-13或IFN-γ抗体染色；填充直方图显示同型匹配抗体对照染色。数据代表了单独实验中的至少3个测定结果。MFI，平均荧光强度（对数标度为10⁰–10⁴已使用）。

为了进一步阐明Th1和Th2细胞因子在MSC功能调节中的作用，我们分析了在CD11b存在的情况下体外产生的同种异体反应性CTL⁺从荷瘤BALB/c小鼠脾脏分离的细胞，WT或IFN-γ或IL-4缺乏。肿瘤诱导CD11b时⁺将细胞加入经γ射线照射的C57BL/6异基因细胞刺激的WT BALB/c淋巴细胞中，WT或IL-4 KO CD11b抑制CTL的生成⁺单元格（图​（图3A）。三A） ●●●●。另一方面，CD11b⁺IFN-γ-KO小鼠的细胞没有抑制作用，而是增加了从培养物中回收的同种抗原特异性CTL的数量。这表明CD11b的能力⁺释放IFN-γ而非IL-4的细胞对肿瘤诱导的CD11b的抑制特性很重要⁺细胞。然后我们询问活化T细胞释放的细胞因子是否在抑制途径中发挥作用。来自IFN-γKO的应答T细胞（图​（图3B）三B） 或IL-4 KO（图​（图3C）三C） 在CD11b存在的情况下，将小鼠与异基因靶点混合⁺来自不同菌株的细胞。同种异体抗原刺激的T细胞缺乏IFN-γ生成，无论肿瘤诱导的CD11b来自何处，其抑制活性都被完全消除⁺单元格（图​（图3B）。三B） ●●●●。相反，T细胞不能产生IL-4并没有改变第三方抑制物的抑制作用，除非CD11b⁺实验中使用了IFN-γ-KO小鼠的细胞（图​（图3C）。三C） ●●●●。这些结果证实了活化T淋巴细胞和肿瘤诱导CD11b产生IFN-γ的需要⁺并完全排除了IL-4在CD11b中的任何作用⁺-介导的抑制。

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图3

肿瘤诱导CD11b所需细胞因子和细胞因子受体的评估⁺细胞抑制同种异体反应和肿瘤特异性CTL的生成。

CD11b型⁺将来自荷瘤WT或不同KO小鼠的分选细胞以3%的最终浓度添加到混合白细胞培养物中，该混合白细胞细胞培养物由BALB/c效应器和等量的C57BL/6脾细胞刺激而成。5天后，在5小时内测试细胞毒性⁵¹针对同基因对照靶点（CT26，H-2）的Cr释放试验^d日)或异基因靶点（MBL-2，H-2^b条). 效应淋巴细胞取自WT(A类)，干扰素-γ-KO(B类)或IL-4 KO(C)老鼠。卢₃₀，定义为实现2×10的30%特异性溶解所需的淋巴细胞数量^三在5小时实验中，根据从培养物中回收的活细胞总数计算靶细胞。数据表示为LU之间的比率₃₀在包含第三方单元格的培养基和在没有第三方细胞的情况下设置的对照培养基中进行测量。数据为3个实验的平均值±SEM。

排除IL-4后，我们考虑了IL-13的参与，因为该细胞因子在替代性巨噬细胞激活中起作用并诱导ARG1(25). 我们使用了IL-4受体（IL-4R）α链（CD124）缺陷的小鼠。IL-4R是由不同链组成的异二聚体复合物。在I型IL-4R中，IL-4Rα和一个普通γ链形成一个仅结合IL-4的复合物，而2型IL-4R由IL-4Rβ和IL-13R1链组成，并结合IL-4和IL-13(31). CD11b型⁺从IL-4RαKO荷瘤小鼠中分离出细胞，并将其作为第三方添加到同种异体培养物中。CD11b上IL-4Rα的存在⁺细胞似乎对其抑制活性至关重要（图​（图3A）。三A） ●●●●。由于IL-4既没有被释放，也没有参与抑制，因此合理的假设是该受体被IL-13激活。

排除污染NK细胞作为分选CD11b中IFN-γ来源的可能作用⁺脾细胞，我们分离出CD11b⁺Rag2脾脏的细胞^–/–γ_c（c）^–/–KO小鼠，除B和T淋巴细胞外，缺乏NK细胞(32). 我们还使用了CD1^–/–小鼠获得CD11b⁺没有任何可能导致IL-13产生的污染NKT细胞的细胞。事实上，Berzofsky及其同事已经证明，NKT细胞释放IL-13可以激活免疫抑制CD11b⁺等级-1⁺几种小鼠肿瘤模型中的细胞(9,33).

肿瘤诱导的CD11b⁺KO脾脏细胞对同种反应性CTL具有完整的抑制活性（图​（图3A）三A） 并释放IL-13和IFN-γ以及WT对应物（图​（图2）。2). 这些数据证实，我们的结果揭示了一种不同的抑制途径，不依赖于NK或NKT细胞。此外，自Rag2以来^–/–γ_c（c）^–/–KO小鼠也缺乏T和B淋巴细胞，缺乏作为I型IL-4R成分的共同γ链，我们可以得出以下结论：（a）CD11b的免疫抑制特性⁺细胞可能是髓系前体上肿瘤释放因子直接活性的结果，不需要先天或适应性免疫系统细胞的任何额外干预；和（b）仅结合IL-4的I型IL-4R在髓样依赖性抑制中不起任何作用。因此，我们可以得出结论，肿瘤诱导的CD11b成功抑制CTL活性⁺细胞依赖于来自IFN-γ的信号的整合，IFN-γ由活化的T淋巴细胞和相同的CD11b释放⁺细胞和IL-4Rα在抑制细胞上表达。IFN-γ的无能进一步证实了这些发现^–/–和IL-4Rα^–/–CD11b型⁺荷瘤小鼠脾细胞抑制纯化CD8的增殖⁺用抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激的T细胞（补充图1B）。

干扰素-γ效应似乎自相矛盾，因为CTL产生IFN-γ，而IFN-γ反过来又可能反式作用，抑制其他CTL的CTL功能。为了进一步阐明这种细胞因子的作用，我们将阻断IFN-γ的抗体或重组细胞因子添加到在WT或IFN-γKO-MSCs存在下刺激的同种培养物中（补充图6）。这些实验数据表明：（a）在缺乏MSCs的正常同种异体培养物中，包含抗小鼠IFN-γ抗体并不会显著提高溶血反应，而在含有MSCs的培养物中却能完全恢复免疫反应性；（b）外源性IFN-γ可以有效替代T淋巴细胞或MSCs（来源于脾脏或肿瘤浸润）产生的细胞因子，维持T淋巴细胞抑制。为获得这种效果而添加到培养物中的细胞因子总量相当高（50 ng/ml），这与IFN-γ的大量和长时间释放是对CTL活性发挥抑制作用所必需的概念相一致。

CD11b型⁺IL-4Rα⁺这些细胞构成了能够产生IL-13和IFN-γ的炎性单核细胞亚群。

在确定IL-4Rα可能是MSC标记物后，我们分离了肿瘤诱导的CD11b⁺根据其表达的脾细胞。该程序区分了CD11b的2个亚群⁺细胞、单核细胞（IL-4Rα⁺)和多形核细胞（IL-4Rα^–)（图​（图4A）。4A） ●●●●。通过这种方法，我们可以使用单个细胞表面标记来区分微芯片分析所揭示的两个主要特征。IL-4Rα⁺该组分还含有一些形态较未成熟的细胞，与粒单核细胞前体一致。IL-4Rα⁺而不是IL-4Rα^–分选的细胞组成性地释放IL-13和IFN-γ，并抑制同种反应性CTL的生成（图​（图4，4，B和C），表明IL-4Rα的表达确实可以被视为肿瘤诱导的循环MSCs的标记物。

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图4

肿瘤诱导CD11b的形态和功能特征⁺IL-4Rα⁺和CD11b⁺IL-4Rα^–细胞。

用微球对脾细胞进行分类，以选择CD11b⁺随后通过流式细胞术对该细胞群进行分类，以选择IL-4Rα⁺（左图）和IL-4Rα^–（右侧面板）单元格。(A类)分选细胞用H&E和May-Grünwald-Giemsa染色（M-GG）。在显微镜下放大40倍拍摄照片。CD11b型⁺IL-4Rα⁺细胞呈单核形态，而CD11b⁺IL-4Rα^–细胞由处于不同分化阶段的粒细胞组成，包括具有条带形态的未成熟细胞。(B类)通过流式细胞术分析这两个群体的IL-13（顶部面板）和IFN-γ（底部面板）的表达。开放直方图显示IL-13或IFN-γ抗体染色；填充的直方图显示同种匹配抗体控制。数据代表了单独实验中的至少3个测定结果。(C)将这两个群体以3%的最终浓度添加到同种抗原刺激培养物中（见上文）。CD11b型⁺白细胞介素-4受体α⁺但不是CD11b⁺IL-4Rα^–细胞抑制同种反应性CTL的生成(对<0.01和对分别=0.48）。结果显示为LU的分数₃₀在缺乏第三方CD11b的对照组同种文化中测量⁺细胞。数据是来自3个实验的平均值±SEM。

在患有9天龄s.c.C26-GM肿瘤CD11b的小鼠中⁺IL-4Rα⁺单核细胞不仅存在于脾脏中，也存在于血液中，它们在单核细胞总数中占很大比例（在荷瘤小鼠中为48.2%±6.52%，而在无瘤小鼠中则为1.2%±0.68%）。循环小鼠单核细胞至少包含2个不同的亚群：CD11b⁺等级-1^–中央控制室2^–CX公司_三CR1型^高的单核细胞是正常组织中常驻巨噬细胞的前体，而CD11b⁺等级-1⁺中央控制室2⁺CX公司_三CR1号机组^低的细胞是“炎症”单核细胞，位于炎症部位，是树突状细胞和活化巨噬细胞的贮存库(34,35). 分选CD11b的流式细胞术分析⁺来自肿瘤宿主的细胞表明IL-4Rα⁺脾细胞表达低水平CX_三CR1，并且对CCR2和CD62L呈阳性（图​（图5A）。5A） ●●●●。此外，约一半的CD11b⁺IL-4Rα⁺单核细胞为Gr-1⁺，真正的炎性单核细胞（图​（图5A）。5A） ●●●●。然而，Gr-1⁺和Gr-1^–分数可能是同一连续统的一部分，因为CD11b⁺等级-1⁺细胞可以在体内外分化为CD11b–单个阳性细胞(1,2,5,14,35).

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图5

肿瘤诱导CD11b的表型特征⁺IL-4Rα⁺细胞。

(A类)CD11b细胞⁺用免疫磁性微球富集9天前接种C26-GM肿瘤细胞系的小鼠脾脏细胞，并用所示抗体染色。FS，正向散射；SS，侧面散射。(B类)对接种不同肿瘤的不同菌株小鼠的血细胞（顶行）和脾细胞（底行）进行CD11b和IL-4Rα染色。使用了以下肿瘤细胞系：BALB/c衍生结肠癌CT26（与我们之前实验中使用的C26肿瘤密切相关）和乳腺癌4T1；以及C57BL/6衍生的EL-4淋巴瘤和MCA203纤维肉瘤。数据来自一个代表3的实验。(C)CD11b型⁺从荷瘤WT或KO BALB/c小鼠的脾脏中分离细胞，并将最终浓度为3%的细胞添加到如上所述的混合白细胞培养基中（顶部面板）。CD11b型⁺将从荷瘤C57BL/6小鼠脾脏中分离出来的细胞以3%的最终浓度添加到混合白细胞培养物中，该白细胞培养液由受同等数量γ射线照射的BALB/c脾细胞刺激的C57BL/6效应器建立，在培养开始和第三天添加抗IFN-γ和/或抗IL-13单克隆抗体（底部面板）。

评估CD11b是否⁺IL-4Rα⁺非移植性肿瘤可以诱导细胞，我们分析了患有已知可导致全身免疫功能障碍的s.c.肿瘤的小鼠的血液和脾脏(2,5,10,14,17). 肿瘤被允许生长，直到达到大约1厘米²然后对血样池和脾脏进行染色。在所有病例中，血液和脾脏中都含有不同数量的CD11b⁺IL-4Rα⁺而在无瘤BALB/c和C57BL/6小鼠中，这些细胞很少（图​（图5B）。5B） ●●●●。

尽管CT26是一种与C26-GM肿瘤模型来源的C26细胞系密切相关的结肠癌，但它并没有诱导高数量的CD11b⁺脾细胞，它们在每个细胞的基础上同样具有抑制作用（图​（图5C），5C） 表明GM-CSF转导基本上增强了肿瘤细胞的固有特性。更重要的是，CD11b⁺CT26荷瘤小鼠脾脏中的细胞表现与先前描述的细胞一样，因为它们需要产生IFN-γ和表达IL-4Rα的能力才能具有免疫抑制作用（图​（图5C）。5C） ●●●●。CD11b也获得了类似的结果⁺从携带乳腺癌4T1的BALB/c小鼠脾脏富集的细胞（图​（图5C）。5C） ●●●●。

由于一些关键的KO小鼠在H-2中不可用^b条背景，我们对同基因C57BL/6小鼠中生长的MCA203和EL-4肿瘤使用了不同的方法。我们将阻断IL-13或IFN-γ抗体的单克隆抗体添加到含有CD11b（作为第三方）的同种异体培养物中⁺荷瘤小鼠的脾细胞。虽然在无瘤小鼠的标准同种异体培养物中产生了同种异体反应性T淋巴细胞，但在接受CD11b的培养物中完全失去了这种同种异体应答⁺由MCA203或EL-4肿瘤调节的脾细胞。通过添加抗IFN-γ或抗IL-13单克隆抗体而非对照单克隆抗体可以恢复活性细胞毒性效应物，这表明每种细胞因子在维持抑制反应中都具有关键作用；此外，阻断单克隆抗体的组合产生了加性/协同活性，因为它使培养物中恢复的同种异体反应T淋巴细胞的数量加倍（图​（图5C）。5C） ●●●●。无论肿瘤类型和小鼠遗传背景如何，这些数据表明，对抗性细胞因子IFN-γ和IL-13（通过IL-4Rα）之间的相互作用是免疫抑制途径的基础。

IL-4Rα的表达是肿瘤宿主骨髓细胞体内抑制活性所必需的。

为了证明IL-4Rα不仅是一种细胞标志物，而且对抑制性骨髓细胞的功能至关重要，我们将s.c.C26-GM细胞接种在LysM中^Cre公司白细胞介素-4受体^{–/弗洛克斯}巨噬细胞和中性粒细胞中IL-4Rα的靶向敲除小鼠(36). IL-4Rα条件性KO小鼠和对照鼠的肿瘤生长相似。CD8的转让⁺用γ射线照射的C26-GM细胞免疫小鼠后纯化的T淋巴细胞对对照小鼠的肿瘤发展有轻微影响，但对LysM的肿瘤生长有完全抑制作用^Cre公司白细胞介素-4受体^{–/弗洛克斯}鼠标（图​（图6A）。6A） ●●●●。此外，CD8⁺T淋巴细胞用装载有AH1肽（AH1-TET）的四聚体染色，AH1肽是一种主要的C26-GM相关抗原(10,37)，在LysM的血液中增加^克里白细胞介素-4受体^{–flox公司}但在过继转移到肿瘤宿主后，对照组小鼠没有（图​（图6B）。6B） ●●●●。当AH1-TET总数增加时，这种差异更加明显⁺因为CD3的数量减少，所以考虑了血液中的细胞⁺CD8（CD8）⁺对照小鼠血液中循环的T细胞（图​（图6C）。6C） ●●●●。我们估计了循环肿瘤特异性CD8的数量⁺T细胞，考虑到BALB/c小鼠循环白细胞的公开数据(38). 我们仅转移了57500个AH1特异性CD8⁺T淋巴细胞，我们计算出总共144503（±44579）AH1-TET⁺CD3（CD3）⁺CD8（CD8）⁺LysM血液中循环的T细胞^Cre公司白细胞介素-4受体^{–/弗洛克斯}荷瘤小鼠过继移植后8天。这些数学考虑表明肿瘤特异性T细胞在LysM中扩增^Cre公司白细胞介素-4受体^{–/弗洛克斯}荷瘤小鼠，但非对照鼠（图​（图6C）。6C） ●●●●。因此，肿瘤特异性CD8⁺体内C26-GM肿瘤生长抑制T淋巴细胞，这种抑制作用关键需要骨髓细胞中IL-4Rα的表达。

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图6

过继细胞移植仅对骨髓限制性IL-4Rα失活的小鼠有效。

(A类)LysM公司^Cre公司白细胞介素-4受体^{–/弗洛克斯}在第0天，用C26-GM细胞对小鼠和对照窝鼠进行皮下注射，24小时后给予CD8⁺在接种γ射线照射的C26-GM细胞前14天，从小鼠脾脏和淋巴结纯化的T细胞。肿瘤大小表示为用卡尺测量的两个主要垂直直径的乘积。患有肿瘤的小鼠在第12天必须接受安乐死，因为它们表现出严重的痛苦迹象。(B类)CD3⁺CD8（CD8）⁺L阳性细胞^d日荷瘤小鼠接种肿瘤后8天，测定其血液中AH1肽四聚体的含量。报告每组的一个点图。数字表示AH1-TET的百分比⁺门控CD3中的细胞⁺CD8（CD8）⁺T淋巴细胞（平均值±SEM，n个= 5–6). (C)CD3的绝对数⁺CD8（CD8）⁺AH1-TET型⁺计算循环白细胞（WBC）总数，并以平均值±SEM报告_876–884/L（左）^d日每次测定减去TET。(D类)干扰素-γ^–/–和WT BALB/c小鼠在第0天用C26-GM细胞进行皮下注射，24小时后给予CD8⁺从IFN-γ的脾脏和淋巴结中纯化的T细胞^–/–和WT BALB/c小鼠，在接种前14天接种γ射线照射的C26-GM细胞。结果以肿瘤激发后的存活率表示，来自1个代表性实验，每组6只小鼠。

我们还通过过继转移肿瘤特异性CD8来评估IFN-γ的重要性⁺从WT或IFN-γ中分离的T细胞^–/–小鼠WT或IFN-γ^–/–荷瘤小鼠（图​（图6D）。6D） ●●●●。通过这种方式，我们可以评估抗肿瘤T细胞或肿瘤条件宿主细胞产生的IFN-γ的相关性。与体外数据一致，过继免疫治疗的完全抗肿瘤活性可以在完全缺乏IFN-γ的情况下获得，因为IFN-γ^–/–接受IFN-γ的小鼠^–/–CD8（CD8）⁺T细胞完全治愈，并在整个观察期内存活（图​（图6D；6D类；对= 0.001). 此外，约65%的干扰素-γ^–/–携带C26-GM的小鼠通过转移WT CD8治愈⁺T细胞(对=0.008），表明IFN-γ的内源性生成与效应淋巴细胞在调节体内肿瘤诱导抑制中释放IFN-γ更相关（图​（图6D）。6D） ●●●●。

IL-13和IFN-γ协同激活肿瘤诱导CD11b的抑制代谢途径⁺细胞。

KO小鼠的研究结果和阻断单克隆抗体的实验表明，MSC可以整合从IL-13和IFN-γ接收的信号来激活其抑制途径。我们评估了拮抗细胞因子（如IL-13和IFN-γ）对MSCs是否具有协同或相加作用。肿瘤诱导的CD11b⁺体外培养的脾细胞逐渐缺乏IL-4Rα的表达⁺由于IL-13的自分泌释放和与该受体的结合（图​（图7A）。7A） ●●●●。事实上，通过添加IL-13阻断单克隆抗体（图​（图7A）。7A） ●●●●。在CD11b中添加IFN-γ也可以抑制IL-4Rα的下调⁺细胞培养。这种效应可能独立于IFN-γ介导的IL-13释放抑制，因为IFN-γ和IL-13阻断单克隆抗体的组合对IL-4Rα的持续性具有协同作用（图​（图7A）。7A） ●●●●。此外，IFN-γ没有改变ELISA监测的CD11b上清液中分泌IL-13的量⁺体外培养期间的细胞（数据未显示）。CD11b中IL-4Rα可忽略不计⁺从无瘤小鼠脾脏富集的细胞和IFN-γ不影响其表达水平（图​（图7A）。7A） ●●●●。

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图7

IFN-γ和IL-13协同激活免疫抑制途径。

(A类)肿瘤诱导CD11b细胞表面IL-4Rα表达动力学⁺脾细胞。CD11b型⁺来自无瘤（正常）或荷瘤小鼠（肿瘤）的脾细胞单独与IFN-γ、小鼠IL-13中和抗体或两者共同孵育72小时。同型匹配抗体作为阴性对照。通过流式细胞荧光法分析不同时间点细胞表面IL-4Rα蛋白的表达，并报告为3次单独测定的阳性细胞平均百分比±SEM。不同动力学值之间的差异具有统计学意义(对< 0.05). (B类–D类)CD11b的作用⁺细胞暴露于IL-13和IFN-γ。CD11b型⁺从无瘤小鼠和荷瘤小鼠的脾脏中分离细胞。这些最后的细胞立即进行分析（新鲜），或在单独培养基（无细胞因子）中培养48小时，或在存在IFN-γ、IL-13或两者的情况下培养48小时。一些样本用IFN-γ治疗24小时，然后再加IL-13治疗24小时（IFN-γ→IL-13），或用逆细胞因子组合治疗（IL-13→IFN-γ）。然后分析细胞的表达精氨酸1和2个实时PCR检测信使核糖核酸(B类)，通过Western blotting检测Arg1和Nos2蛋白水平(C)，以及相对酶活性(D类). 日志₂FC是目标基因的对数转换基因表达值，归一化为内源性参考，并与校准品样本相关。ND，未完成。实时PCR、Western blot和酶活性的数据来自同一个代表3的实验。

为了进一步阐明IL-13和IFN-γ协同抑制MSC的基础，我们培养了肿瘤诱导的CD11b⁺脾细胞在含有或不含IFN-γ或IL-13的完全培养基中培养48小时。我们研究了IFN-γ和IL-13的不同组合对Arg1和Nos2酶表达的影响，这两种酶是负责MSC依赖性抑制T细胞的关键分子（图​（图7，7、B和C）。

新鲜和培养的CD11b⁺从荷瘤小鼠分离的脾细胞显示2个mRNA上调，而相关蛋白保持在免疫印迹的检测极限以下（图​（图7，7、B和C）。精氨酸1在培养的CD11b中24小时后强烈上调⁺单元格（表​（表11和未发表的数据），培养48小时后恢复到基础水平（图​（图7B）。7B） ●●●●。正如预期的那样，当分别添加每种细胞因子时，IFN-γ导致Nos2的优先表达，而IL-13上调Arg1。重要的是，当同时添加细胞因子时，或者在IL-13序列中添加IFN-γ，反之亦然，这两种酶的转录物、蛋白质和功能活性会上调而不是抑制（图​（图7，7、B和C）。IL-13和IFN-γ的协同作用，诱导Arg1和Nos2的伴随表达和激活，从而确定了MSCs的一个独特特性。事实上，在炎症性腹腔巨噬细胞中，IL-13预处理可抑制由IFN-γ和LPS诱导的Nos2蛋白（而非mRNA）表达和活性(39).

老鼠。

八周C57BL/6（H-2^b条)和BALB/c（H-2^d日)小鼠是从哈兰购买的。干扰素-γ^–/–(Ifn公司^tm1吨)和IL-4^–/–(Il4号机组^tm2N吨)小鼠均为BALB/c背景，购自杰克逊实验室。客户尽职调查1^–/–(抄送1^{tm1Gru（tm1Gru）})BALB/c小鼠由Luc Van Kaer（美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学）提供。IL-4Rα^–/–(Il4ra公司^tm1Sz公司)BALB/c小鼠购自Taconic。普通γ（γc）/Rag2–双KO(抹布2^–/–γc（c）^–/–)BALB/c小鼠是日本川崎中央实验动物研究所赠送的礼物。表达α/βTCR的转基因小鼠，该TCR对K呈现的HA中的512–520氨基酸具有特异性^d日（CL4小鼠）是L.Sherman（美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所）赠送的礼物。在我们的实验中，使用了Thy1.1等位基因同源的CL4小鼠，以及Thy1.1⁺CD8（CD8）⁺细胞克隆型T细胞受体均为阳性。LysM公司^Cre公司IL-4Rα^{–/弗洛克斯}用缺失的（IL-4Rα^–/–老鼠）和液氧磷-侧翼IL-4Rα等位基因（IL-4Rα^{flox/flox公司}小鼠）和在溶菌酶M基因（LysM）调控区控制下的Cre重组酶表达^Cre公司小鼠），从而限制Cre介导的液氧磷只对巨噬细胞和中性粒细胞进行重组(36). 小鼠菌株要么使用BALB/c ES细胞产生，要么在交叉前回交至BALB/c至少9代。IL-4Rα^{–/弗洛克斯}在实验中，行为类似BALB/c WT小鼠的室友被用作对照。涉及动物及其护理的程序符合符合国家和国际法律和政策的机构指南。动物护理和实验得到了威尼斯肿瘤研究所机构审查委员会的批准。小鼠左侧皮下接种肿瘤细胞，每2天通过卡尺测量监测肿瘤生长。

细胞因子、单克隆抗体和合成肽。

从PeproTech购买小鼠GM-CSF、IL-13（最终浓度为33 ng/ml）和IFN-γ（25 ng/ml，最终浓度）。以下抗体用于流式细胞术染色：大鼠抗小鼠CD124-PE（IL-4Rα）和对照大鼠IgG_2年–PE（BD Biosciences-Pharmingen）；大鼠抗小鼠CD11b–PE、生物素偶联大鼠抗鼠F4/80和对照大鼠IgG_2年–PE（Caltag实验室）；生物素偶联大鼠抗小鼠CD62L（BD Biosciences-Pharmingen）；大鼠抗鼠Gr-1–FITC（Immunokontact）和同种对照大鼠IgG_2亿–FITC（Caltag实验室）；CX公司_三CR1-Fc（来自Millennium的礼物）和Cy5-山羊抗人IgG（杰克逊实验室）；纯化的山羊多克隆IgG抗CCR2（CKR-2B）和同种型对照正常山羊IgG（Santa Cruz Biotechnology Inc.）；FITC-偶联大鼠抗鼠IFN-γ（BD Biosciences-Pharmingen）和生物素偶联大鼠鼠抗鼠IL-13（BioSource International）。在培养开始和72小时后，向培养物中添加中和单抗山羊抗小鼠IL-13（30μg/ml；R&D系统）、中和单抗大鼠抗小鼠IFN-γR4-6A2（30μg/ml，HB370；ATCC）和正常山羊或大鼠IgG（30μgml；R＆D系统）。

MHC I类L^d日-限制HA_512–520肽（IYSTVASSL）由约翰·霍普金斯合成设施（美国马里兰州巴尔的摩）合成。如HPLC所示，肽纯度大于95%。将冻干肽溶解在二甲基亚砜（Sigma-Aldrich）中，并在使用前储存在-80°C下。

细胞分离和培养。

将荷瘤或无瘤小鼠处死，在无菌条件下采集脾脏。制备单细胞悬浮液，并使用与单克隆大鼠抗鼠/人CD11b（M1/70.15.11.5）或大鼠抗小鼠CD8（Miltenyi Biotec）偶联的磁性微球从脾脏分离细胞。用冷缓冲液清洗细胞以去除未结合抗体，并根据制造商的说明在VarioMACS柱（Miltenyi Biotec）上分离细胞。流式细胞术评估细胞群纯度，纯度超过90%。分离CD11b⁺Gr-1组⁺和CD11b⁺等级-1^–将细胞、脾细胞重新悬浮在MACS缓冲液中，并在4°C下与生物素化抗-Gr-1孵育15分钟。用冷缓冲液清洗细胞以去除未结合的小球，然后在4°C下用链霉亲和素微球培养15分钟。等级-1⁺细胞均为CD11b⁺.Gr-1^–用抗鼠/人CD11b微球进一步培养部分，以分离构成CD11b的细胞⁺等级-1^–分数。在一些实验中，CD11b⁺细胞在5×10密度的完全培养基中培养24～48小时⁵至5×10⁶24孔平底板中的细胞/ml（BD Biosciences）。

CTL响应评估。

为了产生同种反应性CTL，脾细胞（3×10⁶)BALB/c小鼠用3×10⁶γ射线照射的C57BL/6脾细胞。5天后，测试培养物在5小时内裂解同种异体靶点（MBL-2）的能力⁵¹2×10铬释放试验^三靶细胞先前标记有100μCi Na₂⁵¹铬氧化物₄持续60分钟。从三份样品中计算特异性溶解百分比，如下所示：（实验cpm–自发cpm）/（最大cpm–自发性cpm）×100。Lytic单位（LU）计算为每10个给予2000个异基因靶细胞（MBL-2细胞）30%特异性裂解的细胞数⁶效应细胞（LU₃₀/10⁶单元格）。如果存在，则从MBL-2靶细胞获得的CT26对照靶细胞的非特异性裂解百分比中减去。LU的数量₃₀/10⁶然后使用单元格计算LU₃₀每个培养基中回收的活细胞数量。LU的百分比₃₀计算如下：LU₃₀实验组/LU₃₀对照组×100。因此，数据表示为LU的百分比₃₀在包含第三方MSC的培养基和在没有添加第三方细胞的情况下设置的对照培养基中进行测量。

^三H-TdR公司。

CD8（CD8）⁺T细胞（2×10⁵每个孔的细胞）在96周的平底培养板（BD Biosciences）中培养，并用3μg/ml抗CD3（2C11；ATCC）和2μg/ml抗CD28（克隆37.5；ATCC。CD11b型⁺将细胞添加到培养物中，以构成总细胞的20%。培养2天后，用1μCi/孔脉冲培养^三H-TdR（PerkinElmer）18小时，以及^三用闪烁计数法测定H-TdR掺入量。

CD8的采纳转让⁺T淋巴细胞。

从转基因供体的脾脏中制备单细胞悬浮液。细胞在无菌HBSS（Invitrogen）中清洗，并在3×10⁶天真的Thy1.1⁺，第8区⁺抗HA TCR⁺将T细胞注射到雄性BALB/c受体的尾静脉中（Thy1.2⁺). 三天后，小鼠接种1×10的s.c⁷如前所述制备的HA编码痘苗病毒PFU(47). 在体外实验中，1周后采集含有启动的CL4细胞的脾脏。用于LysM的过继转移研究^Cre公司白细胞介素-4受体^{–/弗洛克斯}，干扰素-γ^–/–和BALB/c小鼠、供体小鼠（BALB/c-，WT或IFN-γ^–/–)用γ射线照射的C26-GM细胞免疫s.c.，14天后，5×10⁶CD8（CD8）⁺将从脾脏和淋巴结富集的T细胞（纯度>95%）静脉注射到LysM^Cre公司白细胞介素-4受体α^{–/弗洛克斯}小鼠，干扰素-γ^–/–老鼠和控制室友。

MHC/肽四聚物的合成。

MHC I类L^d日-采用自动固相法合成了与gp70的423–431氨基酸相对应的限制性肽（AH1肽）(37). 由Technogen合成并纯化了β-半乳糖蛋白876–884氨基酸对应的肽。PE-标记的H-2肽四聚体是由生物素化复合物与Extravidin-PE（Sigma-Aldrich）的混合物产生的，并通过具有适当特异性的CTL克隆染色进行验证，如前所述(37).

CFSE标记和增殖试验。

脾细胞来源于原始Thy1.1⁺CL4小鼠或Thy1.2⁺接受Thy1.1的小鼠⁺，CL4 T细胞，随后用HA编码的痘苗病毒引物。脾细胞用PBS洗涤两次，并在10时重新悬浮⁷细胞/ml在PBS/1%BSA中，1μM CFSE（Invitrogen），在37°C下持续10分钟。用冷PBS/BSA洗涤两次，停止标记。CFSE标记的脾细胞（10⁶)含有HA特异性CD8⁺然后在96周的平底平板（BD Biosciences）中用透明质酸刺激T细胞60小时（初始时为10%–12%脾细胞，HA-期为1%–2%脾细胞）_512–520肽（5μM）。用大鼠抗小鼠CD8–PE和小鼠抗Thy1.1–别藻蓝蛋白（BD Biosciences-Pharmingen）对细胞进行染色。在FACSCalibur流式细胞仪（BD）上为每个样本总共收集了100000个事件，并使用FCS Express（2.0版；DeNovo软件）对数据进行了分析。

流式细胞术分析和细胞分选。

CD11b型⁺单元格（10⁵每个样品）重悬于50μl FACS缓冲液（含有2%BSA和0.02%NaN的0.9%NaCl溶液_三与抗小鼠Fc-γ受体2.4G2 mAb腹水（HB-197；ATCC）在室温下保持10分钟，以减少非特异性染色。清洗样品，并将其重新悬浮在50μl FACS缓冲液中，用适量的抗体进行染色。30分钟后，清洗细胞，将其重新悬浮在FACS缓冲液中，并用FACSCalibur流式细胞仪（BD）进行分析。对于抗原特异性细胞内IFN-γ和IL-13生成的流式细胞术分析，CD11b⁺细胞与1μg/ml布雷费尔丁A（Sigma-Aldrich）孵育10小时。在用抗小鼠IFN-γ或抗小鼠IL-13单克隆抗体染色之前，将细胞在4°C下清洗、固定并渗透20分钟（Cytofix/Cytoperm Kit；BD Biosciences-Pharmingen）。使用CellQuest软件（BD）进行数据分析。CD11b⁺IL-4Rα⁺用与单克隆大鼠抗鼠/人CD11b结合的微球对细胞进行预分类，然后用抗鼠CD124–PE标记，并使用配备488-nm氩激光（Innova 305C-BD；相干）的FacsVantage DiVa（BD）以每秒8000–12000个细胞的速率对细胞进行分类，以获得高度纯化的细胞群。每个实验中使用的分类种群纯度超过97%。使用光散射参数和碘化丙啶/膜联蛋白V染色对细胞活力进行充分的控制。对于四聚体分析，在室温下用AH1四聚体-PE（AH1-TET，5μg/ml）标记PBMC 20分钟。然后用大鼠抗鼠CD8–TRI-COLOR（CTCD8α；Caltag Laboratories）和仓鼠抗小鼠CD3–FITC（克隆145-2C11；Caltag-Laboratory）在4°C下对每个样品进行染色。30分钟后，清洗细胞，将其重新悬浮在FACS缓冲液中，并用FACSCalibur流式细胞仪（BD）进行分析。根据之前描述的方案，每个样品也用对照β-gal–TET染色(37).

ELISPOT分析。

根据制造商的说明，使用小鼠IFN-γELISPOT试剂盒（BD Biosciences-Pharmingen）进行ELISPOT。使用KS平板阅读器和软件评估斑点数量。

CD11b的形态学研究⁺IL-4Rα⁺和CD11b⁺IL-4Rα^–细胞。

新分离的CD11b⁺IL-4Rα⁺和CD11b⁺IL-4Rα^–将细胞在载玻片上旋转，在95%乙醇中固定20分钟，并分别用May-Grünwald Giemsa染色剂或H&E染色3或2分钟。放大40倍拍摄显微照片。

总RNA纯化和实时PCR分析。

通过TRI提取总RNA佐尔CD11b中的（Invitrogen）⁺根据制造商的说明对电池进行分类，并进行了微小修改。RNA样品的质量和数量由安捷伦RNA 6000纳米芯片（安捷伦科技）测定。根据制造商的协议，用M-MLV逆转录酶（Invitrogen）从纯化的总RNA中产生cDNA。20毫微克模板cDNA用于在ABI PRISM 7700（Applied Biosystems）上使用以下按需分析（Applera Corp.）进行的TaqMan实时PCR（TaqMan-Gene Expression Assay；50℃下2分钟，95℃下10分钟，95°C下15秒，60℃下1分钟，45个周期）：线粒体核糖体蛋白L33(第33页); 精氨酸酶1肝(精氨酸1); 和NO合成酶2，诱导型，巨噬细胞(2个). 手动确定阈值周期，并按照Applied Biosystems用户公告第2号所述计算表达中的折叠变化。

基因表达。

基因表达通过Affymetrix小鼠基因组表达集230A（U74A）进行分析。如Affymetrix基因芯片表达分析技术手册所述，将5微克RNA样品扩增成生物素化反义RNA。简单地说，使用5μg总RNA生成双链cDNA（Invitrogen）。使用BioArray HighYield RNA转录标签试剂盒（Enzo）合成生物素标记的反义RNA。所有预混合质量控制均使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司）进行。Affymetrix Microarray Suite（MAS）5.0用于单阵列和比较分析。

蛋白质印迹分析。

通过移液收集细胞，并用冷PBS洗涤两次，5×10⁵粒化细胞在裂解缓冲液（50 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1 mM NaOV）中的冰上破碎15分钟₄、0.5%Triton、0.1μg/μl胃蛋白酶抑制素、0.1μg/ml抗蛋白酶、0.1μl/μl抑肽酶、2 mM PMSF）。将裂解液在3000个相对离心场中在4°C下倾析10分钟，向上清液中添加1体积的Laemmli缓冲液，并在100°C下变性5分钟。蛋白质在10%变性SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在4°C下转移到PVDF膜（Millipore）上2小时。在添加不同浓度脱脂奶粉（Sigma-Aldrich）的PBS/0.05%吐温-20（PBS-T）中，在室温下使膜饱和1小时：抗ARG1 5%，抗NOS2 3%，抗肌动蛋白1%。一级抗体的杂交如下：小鼠单克隆抗体ARG1（1:200；美国路易斯安那州新奥尔良市路易斯安那州立大学a.C.Ochoa赠送的礼物），室温下在封闭缓冲液中进行1小时；多克隆兔抗NOS2抗体（1:1000；Santa Cruz Biotechnology Inc.）在4°C PBS-T/3%BSA中过夜；和多克隆兔抗肌动蛋白抗体（1:500；Sigma-Aldrich）在PBS-T/3%BSA中室温下1小时。与HRP-结合的二级抗体小鼠抗鼠IgG（Sigma-Aldrich）和驴抗兔Ig G（Amersham Biosciences）在室温下杂交1小时。蛋白质通过SuperSignal West Pico Chemilluminescent（Pierce）在Hyperfilm（Amersham Biosciences）上检测。

酶活性。

通过Griess反应测量培养物中释放的NO作为NO的量_三^–和否₂^–使用硝酸盐/亚硝酸盐检测试剂盒（Cayman Chemicals）生产。如前所述，在细胞裂解液中测量ARG活性(10)1 U ARG被定义为每分钟催化1μg尿素形成的量。

我们感谢Andrea Azzalini在图形方面的帮助。这项工作得到了意大利卫生部（Ricerca finalizata）、Fondo per gli Investimenti della Ricerca di Base-Minisstero dell’University a e della Ricerca（项目编号RBAU01935A）、Minisstera della Universityáe della Ricerca-Consiglio Nazionale delle Ricerche（肿瘤战略计划）、，2004年Bando Cariverona基金会“Integrazione tra tecnologia e sviluppo di settore-Bando per progetti di ricerca a indirizzo生物医学”和意大利癌症研究协会。