组织核小体耗竭和有序因子组装GRP78级单分子足迹揭示的启动子

M-SPA显示了一个350-bp的无核小体组成区GRP78型发起人

我们利用了这样一个事实：GRP78级将启动子嵌入CpG岛，利用M-SPA研究其染色质结构和功能组织。在这种方法中，完整的细胞核用M.SssI处理，然后进行DNA提取、DNA亚硫酸氢盐转化和研究区域的PCR扩增。PCR产物被克隆，单个克隆被测序，为单个启动子分子提供保护模式[12]. 三个扩增子覆盖约1100 bp的GRP78级初步分析了包含73个CpG位点的启动子。裸体DNA的亚硫酸氢盐测序显示GRP78级如预期的那样，启动子是完全非甲基化的，这是使用这种方法的先决条件(图S1A） ●●●●。用M.SssI处理裸DNA 15分钟后，甲基化率几乎达到100%，证明了M.SssI甲基化在该区域的效率(图S1B） ●●●●。对从接受M.SssI治疗的非诱导细胞中提取的细胞核进行序列分析后发现，受保护的CpG长片段，跨度约为150 bp或更长，可以诊断核小体的存在[12] (图2A） ●●●●。在所有测序的分子中，我们检测到核心启动子上游的核小体足迹(图2A、 上游扩增子），可能反映了该区域的定位核小体。TIS下游的许多核心启动子放大子分子和所有下游区域分子中都存在这样长的保护补丁，表明这些区域存在核小体。然而，这些似乎位置较低。值得注意的是，虽然小脚印很明显，但在TIS上游和周围约350-bp的区域没有发现150-bp的核小体保护模式。这些发现与ChIP、MNase和DNase I数据一致，并使我们能够描绘出约350 bp的最小区域GRP78级不含核小体的启动子(图2B） ●●●●。这种现象并非LD419细胞独有，因为在所研究的其他四种细胞系（RKO、HCT116、SW13和A-427，数据未显示）中也存在来自该启动子的核小体缺失。

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图2

上的无核小体区域GRP78级核心推荐人的长度至少为350 bp

（A） 顶部的图表按比例绘制，表示所分析的区域，并表示该区域中73个CpG位点（勾号）的分布密度。ERSE（E1–E3）、TATA盒（T）和转录起始位点（弯曲箭头）的位置已标明。从活跃生长的LD419细胞中提取细胞核，然后进行15分钟M.SssI处理，提取DNA的亚硫酸氢盐转化，对1100 bp启动子的三个区域进行PCR扩增，并对单个克隆进行克隆和测序。每个带有一串圆圈的水平线代表一个DNA分子的甲基化曲线。白色圆圈表示未甲基化，黑色圆圈表示甲基化CpG位点。

（B） 单个CpG站点的总保护级别。条纹条代表推断的无核小体区域。请注意，CpGs 40到50的相对较高的保护水平是由不同的足迹造成的，这些足迹太小，无法反映核小体。椭圆代表预测的核小体位置（实线，定位良好的核小体；虚线，定位不太好的核小小体或无核小体边界）。

解剖GRP78型Promoter定义高分辨率封装模块

虽然在核心启动子上没有检测到核小体，但在该区域中有几个较小的保护区或足迹(图2，核心启动子扩增子），其中最引人注目的是在TATA盒下游仅发现2 bp的CpG位点，在23个分子中有16个（69%）受到保护。因此，我们将重点放在TIS周围跨越495 bp的区域，包括37个CpG位点（CpGs 26–62，图2)，以研究GRP78级内质网应激诱导中的启动子。我们使用M-SPA分析294个启动子序列，这些启动子序列来源于基础表达细胞和TG应激诱导后不同时间点采集的细胞(图3和​和44).

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图3

核心发起人中足迹模块的定义

（A） 图中所示为37个CpG在GRP78级核心启动子区（CpGs 26–62）。红色表示正相关，绿色表示负相关。对角线上明显的红色区块对应于在294个启动子序列中高度共保护的相邻CpG组。虽然是以完全无监督的方式发现的，但这些区块对应于不同的已知功能启动子元件。

（B） 对来自裸DNA的40个序列进行了类似的相关分析，作为阴性对照，裸DNA被甲基化以达到60%的平均甲基化。未找到与（A）中类似的已定义模块。对于（A）和（B），注意矩阵根据定义是对称的；绘制上下三角部分仅用于可视化目的。

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图4

GRP78级ER应激过程中的激活

在用300 nM TG诱导后0、0.5、1、2、6和16 h收集LD419细胞。纯化细胞核并用M.SssI处理，然后进行亚硫酸氢盐基因组测序。

（A） 相对GRP78级通过定量RT-PCR（归一化为GAPDH）测定TG诱导后不同时间点的mRNA水平。

（B） 对不同时间点的数据进行排序。顶部的图表按比例绘制，表示所分析的区域（核心启动子扩增子，简称），并指示该区域中包含的37个CpG位点的分布密度。标记TIS（弯曲箭头）、TATA框（T）和ERSE元件（E1–E3）。每个带有一串圆圈的水平线代表一个DNA分子的甲基化曲线。白色圆圈表示未甲基化，黑色圆圈表示甲基化CpG位点。模块，如中的相关分析所定义图3，是彩色编码：蓝色，TATA盒模块；黄色，TIS模块；亮绿色，ERSE1模块；深绿色，ERSE2模块；橄榄，ERSE3模块；深红色，CpGs 49–50和51–53模块；粉红色，核小体模块。如果构成模块的大多数CpG受到保护，则模块被着色。根据先前的核糖体补丁定义，对核糖体模块进行着色[12]其中，超过两个连续受保护的CpG被视为一个补丁，并且一个非甲基化CpG位点的出现不会破坏补丁的连续性。

（C） 计算核小体模块（左）、TATA和TIS（中）以及ERSE（右）的保护水平（参见材料和方法)和显示在不同的时间点。

（D） TG应激诱导后0、1、4和16 h采集的LD419细胞的ChIP分析显示，ATF6在ERSE区域富集。使用针对启动子所示四个区域（如图1A） ●●●●。

首先，我们对294个测序分子池中的CpG保护模式进行聚类分析，以揭示高度共保护的相邻CpG组，我们将其定义为“足迹模块”(图3A） ●●●●。模块表示以类似方式受保护的CpG（一起受保护或一起不受保护），这表明在大多数情况下，公共因子与它们绑定。该分析定义的模块与已知的GRP78级发起人(图3A） ：最上游的模块（CpGs 26和27）与预测的Sp1结合位点相关[21]. 在下游，定义了三个不同的足迹模块（CpGs 33-37、CpGs38-39和CpGs10-43），对应于三个保守的内质网应激反应元件（ESRE）[19,20]. 定义的TIS[30]两侧为CpGs 45至49，也被强烈认定为模块。TIS下游，对应于在许多测序分子中检测到核小体补丁的区域(图2A和​和4B），4B） 观察到明显的更大和“更模糊”的保护模式（CpGs 50–62）。该模块进一步细分为两个或三个模块，可能表明上游子模块（CpGs 50–51和52–54）除核小体外的其他因子的额外结合。因此，在我们的进一步分析中，我们认为下游子模块（CpGs 55–62）反映了核小体保护（参见图4). 为了确保定义的模块不是由M.SssI的内在特性产生的，我们对来源于用M.SssI处理的裸DNA的40个序列进行了相同的聚类分析，该浓度产生了与294个合并序列相似的总甲基化水平（约60%，见图S2对于单序列记录道）。虽然甲基化不是完全随机的，但该分析没有在裸DNA上定义类似的模块(图3B） ●●●●。因此，使用M-SPA，我们可以系统地剖析GRP78级发起人进入足迹模块，并得到已知组织的良好支持GRP78级启动子和我们的ChIP数据(图1A） ●●●●。

GRP78应力诱导过程中序列模块的动力学

接下来，我们分析了在应力感应的时间过程中定义的足迹模块的保护动态(图4). 增长约3.5倍GRP78级mRNA水平在TG诱导后2 h检测到，在6 h时达到最大10倍增加，维持到16 h(图4A） ●●●●。294个序列的分析(图4B） 研究表明，无论诱导状态如何，在TIS上游均未发现任何核小体补丁，这表明图2组成上不含核小体。然而，TIS下游的先前定义的核小体区域（CpGs 55–62，参见图3)TG治疗后（t=0.5h），保护模式立即发生明显变化，核小体斑块减少(图4B、 粉色补丁，以及​和4C，4C、 左图）。这种减少可能反映了由应激诱导和持续转录驱动的核小体滑动或重塑，一直持续到16小时(图4C、 左图，对< 0.026). 有趣的是，随着时间的推移，上部子模块（CpGs 49–53）的保护水平没有明显变化，这再次表明，这些保护水平受不同因素的约束，而非占据CpGs55-62子模块的因素。

在核心启动子处，靠近TATA盒的CpG 44在基础状态-前应力诱导中已经得到了实质性的保护（67%）。TG治疗后，这种保护作用立即显著增强（t=0.5h时保护率为94%，对< 0.01 (χ²试验），并在整个诱导期内保持高水平（t=16 h，93%保护，对< 0.0001,图4B、 蓝色条，以及​和4C，4C、 中间图形）。TIS模块的保护遵循类似的趋势（在t=0.5小时时增加保护，对<0.03，在t=16小时时，对<0.003），但与TATA箱保护相比，其水平较低(图4B、 黄色条，以及​和4C，4C、 中间图形）。

有趣的是，ERSE模块的保护动态遵循不同的趋势：所有三个ERSE足迹都是在治疗后30分钟诱导的，尽管水平不同(图4B亮绿色、深绿色和橄榄条，以及​和4C，4C、 右图）。这种保护随着时间的推移而增加(对<0.0002，t=6小时），但在诱导后16小时降至接近基础水平(对< 0.5). 在ChIP实验中，使用ERSE结合因子ATF6抗体重述了ERSE区域的保护模式，ATF6被ER应激激活，在GRP78的诱导中起重要作用[26]. 如所示图4D、 ATF6在诱导后1 h在ERSE区域富集，6 h达到峰值，16 h降至基础水平。然而，与M-SPA方法相比，ChIP的分辨率较低，无法区分多个ERSE模块及其差动保护。

综上所述，这些结果表明，因子负载和可能的染色质重塑发生在诱导后不久，远早于检测到mRNA水平升高。它们还反映了与ERSE上结合的特定转录因子相比，一般转录机制的结合动力学不同。

逆转录聚合酶链反应。

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，California，United States）从培养的LD419细胞中提取总RNA。总RNA（2-5μg）用于RT。与DNase I（Invitrogen）孵育后，为了消除可能的DNA污染，使用Superscript III（Invit罗gen）和随机六聚体（Promega，Madison，Wisconsin，United States）进行第一链cDNA合成。定量RT-PCR是使用带有SYBR绿色I（Sigma）的Opticon光环进行的，使用基因特异性引物GRP78级[45]. 将所有值标准化为GAPDH表达比率。

炸薯条。

如前所述，使用抗组蛋白/修饰组蛋白抗体进行ChIP分析[46].简单地说，未诱导或TG诱导的LD419细胞在37°C下与1%甲醛交联10分钟，用冰镇PBS洗涤两次，溶解并超声处理。对于转录因子ChIP，细胞在37°C下用1%甲醛交联15分钟，用冰镇PBS洗涤两次，一次用缓冲液A（20 mM HEPES[pH7.6]，0.25%Triton X-100，10 mM EDTA，0.5 mM EGTA），另一次用缓冲器B（50 mM HEPE[pH76]，150 mM NaCl，1 mM EDTA,0.5 mM ECTA）。缓冲液A和缓冲液B的洗涤包括10分钟的旋转和7分钟的500倍旋转克（1200转/分），温度为4°C。然后使用ChIP裂解缓冲液对所得细胞核进行裂解并进行超声处理。对组蛋白和转录因子进行ChIP超声处理，注意大部分DNA片段约为200 bp。使用的抗体为5μg抗总组蛋白H3（美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）、5μg反H3Ac-K9/K14（美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔市Upstate Biotechnologies）、8μg反RNA-pol II CTD（Upstate Biotechnologies）、15μg抗TBP、6μg抗NF-Y、，和10μg抗ATF6（美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）。使用SYBR绿色I（Sigma）通过实时PCR（Opticon，Orangeburg，New York，United States）进行定量分析。引物序列列于表1（R1–R4）。

表1

本研究中使用的引物序列

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细胞核提取。

所有细胞核分离程序均在4°C下进行。积极生长的细胞（10⁸MNase和DNase I治疗和10⁷对M.SssI处理）进行胰蛋白酶化，并用冰镇PBS洗涤两次。细胞重新悬浮在1ml RSB缓冲液中（10mM Tris-HCl[pH7.4]，10mM NaCl，3mM MgCl₂)并在冰上保持10分钟。在此培养后，添加0.1 ml 10%Nonide P-40（NP-40）清洁剂，并用Dounce均质器的紧杵10至15次将细胞均质。随后用RSB缓冲液洗涤两次（用于MNase和DNase I处理），或用RSB缓冲液洗涤一次，然后用M.SssI缓冲液洗涤一次（用于M.SssI处理，10mM Tris-HCl[pH 7.9]，50mM NaCl，10mM MgCl₂、1 mM二硫苏糖醇和0.3 M蔗糖）。

核小体DNA的制备和分析。

提取细胞核（1.5×10⁷)在200μl的1×MNase反应缓冲液（10 mM Tris-HCl[PH7.4]，10 mM NaCl，3 mM MgCl）中再次悬浮₂0.25 M蔗糖，100μM PMSF，3 mM氯化钙₂)并在37°C下与MNase孵育15分钟。通过添加EDTA/EGTA（每个最多10 mM）停止反应。离心后，将核颗粒重新悬浮在含有5 mM EDTA/EGTA的RSB缓冲液中，以获得可溶染色质，该染色质通过蔗糖梯度离心（在5%至25%蔗糖、10 mM Tris-HCl[pH7.4]、0.25 mM EDTA、200 mM PMSF、100 mM NaCl中）在4°C下以30000 rpm的速度进行16小时的分离。作为对照，我们使用MNase部分消化的裸DNA。用核糖核酸酶和蛋白酶K处理裸DNA和核糖体DNA样品，然后进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，并使用SYBR green I和下列引物通过实时PCR（Option）进行定量分析表1（R1–R4）。

M.SssI治疗。

将如上所述提取的细胞核重新悬浮在1×M.SssI缓冲液中，浓度为10⁷细胞核/0.1 ml，并在37°C下制备15分钟后立即与M.SssI孵育。甲基化反应在具有160μM SAM的1×M.SssI缓冲液中进行（由美国马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室提供M.SssI）。从10开始的Nuclei⁶用60 U M.SssI处理总反应体积为150μl的细胞（约6μg DNA）或6μg裸DNA。通过添加等量的停止溶液（20 mM Tris-HCl[pH7.9]、600 mM NaCl、1%十二烷基硫酸钠、10 mM EDTA、600μg/ml蛋白酶K）来停止反应。样品在55°C下培养3小时，然后在37°C下过夜，DNA通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化。

DNA酶I足迹。

将如上所述提取的细胞核或裸DNA重新悬浮在RSB缓冲液中（10 mM Tris-HCl[pH 7.4]，10 mM NaCl，3 mM MgCl₂)加0.25 M蔗糖。然后使用不同浓度的DNase I（美国加利福尼亚州旧金山沃辛顿）在37°C下消化15分钟，以获得EtBr染色显示的合适范围的基因组DNA消化。将消化后的基因组DNA纯化，用RsaI重新消化，在1.5%琼脂糖凝胶上溶解，并进行Southern印迹。该印迹与220-bp PCR-扩增的RsaI探针杂交，该探针位于相对于GRP78级转录起始位点。用于探针扩增的引物序列为正向，5′-ATC AGA CCT TTT CCT GGA ATG-3′，反向，5′-CAA AGG AAT TGC CTC CAG C-3′。

使用亚硫酸氢盐基因组测序进行甲基化分析。

亚硫酸氢盐基因组测序用于分析单个DNA分子的甲基化模式。这个GRP78级根据标准方案，启动子是用经过M.SssI处理后再进行亚硫酸氢钠转化的DNA进行PCR扩增的[47,48]. 使用与脱氨基DNA互补的引物（列于表1、上游扩增子、核心启动子长扩增子、内核启动子短扩增子、下游扩增子）。对于每个扩增子，至少有两个PCR产物被克隆到TOPO-TA克隆试剂盒（Invitrogen）提供的pCR2.1载体中，并转化为大肠杆菌遵循制造商的说明。阳性筛选菌落包含一个单独DNA分子的独特序列。使用Qiagen质粒Mini试剂盒纯化来自所选阳性集落的质粒DNA，并在感兴趣区域测序。在USC/Norris微化学测序核心设施进行测序。除了完全非甲基化或完全甲基化的分子外，只有具有独特修饰模式的分子才会显示出来并包含在分析中，以避免单个DNA分子后代的多重克隆带来的偏差。在所执行的372个技术上成功的序列中（包括上游、下游和核心扩增子），有12个因转换不充分（转换效率低于97%）而被删除，23个序列因与来自相同克隆反应的其他序列100%一致而从各种反应中删除（参见表S1每个扩增子的测序数据摘要）。

封装模块标识。

为了识别足迹模块，我们通过汇集所有时间点的数据，编译了一组CpG的足迹二进制向量。我们通过计算Spearman相关系数来分析足迹之间的相似性，并将序列模块定义为通过关联足迹相关性大于0.5的所有成对CpG而形成的图中的一个连接组件（换句话说，我们使用Spearman相关性截止值0.5进行单链聚类）。重要的是，在这个定义下，所有模块都表示最大的连续启动子序列，这使得我们可以使用这种简单的方法，并且仍然可以获得空间组织的模块。为了定义模块的活动配置文件，我们平均了从特定时间点采集的所有序列中所有模块的CpG的保护状态。为了评估不同时间点保护水平增加/减少的重要性，我们进行了χ²测试比较从一个时间点到其他时间点的样本中推断出的模块的二进制状态。

我们感谢彼得·鲍迈斯特的有益讨论。