原文昌霉素TACE裂解调节GPCR诱导的癌细胞增殖和运动

GPCR激动剂刺激AR的蛋白水解裂解和释放

以前的报告表明，GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化需要proHB-EGF的蛋白水解裂解(Prenzel等人，1999年;Asakura等人，2002年;Lemjabbar和Basbaum，2002年)促使我们询问HB-EGF或其他EGF-样生长因子是否参与头颈癌细胞的EGFR反式激活途径。通过cDNA微阵列分析，我们发现proHB-EGF、proTGF-α和proAR mRNA在SCC-4、SCC-9、SCC-15和SCC-25细胞中的表达（数据未显示）。此外，这些配体的表达和细胞表面定位通过使用外源性抗体的流式细胞术进行确认（图2A、 SCC-9的代表性数据）。LPA或佛波酯12治疗头颈癌细胞-哦-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）是脱落事件的一般诱导剂，导致内源性前AR的细胞表面含量迅速降低（图2B） ●●●●。然而，在这些实验条件下，我们无法检测到proTGF-α或proHB-EGF对短期LPA刺激（长达30分钟）的蛋白水解裂解，而TPA刺激导致两种EGF-样生长因子前体的胞外区裂解（数据未显示）。这些结果表明LPA刺激选择性地诱导HNSCC前AR的脱落。此外，巴蒂司他完全消除了LPA诱导的前AR胞外结构域切割（图2B） 确定了proAR脱落对金属蛋白酶活性的要求。与Gi/o家族中主要对百日咳毒素（PTX）敏感的G蛋白是LPA诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的介体的观察结果一致（图1，下部面板），PTX部分抑制了SCC-9细胞表面的proAR脱落（图2B） ●●●●。

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图2。GPCR刺激导致金属蛋白酶依赖性的裂解和细胞表面AR的释放。(A类)流式细胞术分析EGF-like前体表达。收集SCC-9细胞，进行表面HB-EGF、TGF-α或AR染色，并进行流式细胞术分析。对照细胞仅用FITC-结合二级抗体标记。(B类)LPA诱导proAR蛋白水解过程。用batimastat（BB94；10µM）或PTX预培养SCC-9细胞，并用LPA或TPA（1µM。收集细胞并通过流式细胞仪分析细胞表面AR密度。(C类)GPCR诱导的AR蛋白水解释放。SCC-9细胞预先用batimastat或载体孵育，然后按指示用激动剂刺激120分钟。收集条件培养基并通过ELISA分析AR总量。每个bar是三个重复值的平均值（平均值±SD）*P（P）激动剂与BB94+激动剂之间的差异<0.03。

除细胞表面前AR减少外，GPCR刺激还导致成熟AR在细胞培养基中的积累，这是由夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）测定的（图2C） ●●●●。与LPA刺激相比，卡巴胆碱引起的AR释放显著降低，这一发现表明，释放AR的量与GPCR配体引起的EGFR酪氨酸磷酸化含量直接相关（图1). 此外，用batimastat预培养完全阻止了GPCR和TPA诱导的AR在细胞培养基中的积累（图2C） ，证实AR释放的金属蛋白酶依赖性。

前AR的外结构域脱落是GPCR诱导的EGFR激活和EGFR特征性细胞反应的先决条件

我们使用了三种方法来确定GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化和下游细胞反应是否需要AR功能。首先，SCC-9细胞中proAR、proHB-EGF和proTGF-α的内源性表达被小干扰RNA（siRNA）沉默。通过RT-PCR监测靶基因表达的高效和特异性敲除（图三A） 证实基因沉默是由mRNA降解引起的。同时，研究了siRNAs对EGFR反式激活信号的影响。如图所示三B、 proAR的siRNA完全阻断了GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化。然而，针对proHB-EGF和proTGF-α的SiRNAs并没有显著改变反式激活信号，表明对proAR有特定的需求。此外，我们检测了前AR表达的抑制是否影响GPCR诱导的头颈癌细胞向纤连蛋白的趋化迁移在体外事实上，前AR siRNA显著抑制LPA诱导的SCC-9细胞迁移（图三C） ●●●●。如前所述，AR siRNA部分抑制EGF触发的跨孔迁移，这一发现表明AR在HNSCC自分泌调节细胞反应中的作用(O-Charoenrat等人，2000年).

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图3。前AR siRNA对GPCR诱导的EGFR激活和细胞迁移的影响。(A类)通过RNA干扰（RNAi）阻断EGF-like生长因子前体表达。用siRNA转染SCC-9细胞以检测proAR、proHB-EGF或proTGF-α，培养2天，并根据指示或(B类)用LPA或卡巴胆碱刺激并测定EGFR酪氨酸磷酸化含量。(C类)AR对LPA诱导的细胞迁移的要求。分析SiRNA转染的SCC-9细胞向纤连蛋白作为化学引诱剂的跨阱迁移。每个bar是四个重复值的平均值（平均值±SD）*P（P）对照siRNA+LPA与前AR siRNA+LPA的差异<0.001。

其次，我们通过LPA检测AR中和抗体对鳞癌细胞株SCC-4、SCC-9、SCC-15和SCC-25中EGFR酪氨酸磷酸化的影响。结果表明，用多克隆山羊或单克隆小鼠抗体预处理人类AR外区抑制EGFR反式激活信号（图4A、 上面板；SCC-9细胞中多克隆抗AR抗体的代表性数据）。用卡巴胆碱刺激头颈癌细胞也得到了类似的结果（数据未显示）。相反，使用白喉毒素突变体CRM197或抗HB-EGF中和抗体对HB-EGF的特异性抑制对LPA或卡巴胆碱诱导的EGFR反式激活没有影响（数据未显示）。

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图4。抗AR中和抗体和肝素对AR生物活性的抑制可消除EGFR酪氨酸磷酸化、有丝分裂信号事件、Akt/PKB的激活和GPCR配体的细胞增殖。(A类)用抗AR抗体（αAR Ab；50µg/ml，60 min）或肝素（100 ng/ml，15 min）预处理SCC-9细胞，并刺激3 min（EGFR，上面板）或5 min（SHC，下面板），如图所示。沉淀的EGFR和SHC用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹，然后分别用抗EGFR和抗SHC抗体复制相同的过滤器。(B类)Grb2与SHC的关联在体外SCC-9细胞预先与抑制剂孵育并刺激5分钟，如图所示。裂解物与GST–Grb-2融合蛋白或GST单独孵育。用单克隆抗SHC抗体免疫印迹蛋白质。(C类)AR是GPCR诱导的ERK/MAPK活化和Akt/PKB磷酸化所必需的。SCC-9或SCC-15细胞预先与抑制剂孵育并刺激7分钟。用抗磷酸-ERK抗体免疫印迹总裂解物检测磷酸化ERK1/2。用抗ERK抗体重新探测相同的过滤器。三个独立实验中ERK磷酸化的定量分析（平均值±标准偏差）*P（P）LPA与抑制剂+LPA之间的差异<0.05。刺激Akt/PKB。细胞裂解物用抗磷酸化Akt/PKB抗体进行免疫印迹，然后用抗Akt/PKB抗体复制相同的过滤器。(D类)PI3K和EGFR抑制对GPCR诱导的Akt/PKB磷酸化的影响。用沃特曼（WM，100 nM）、LY294002（100µM）、AG1478（250 nM）或载体预处理静止的SCC-9细胞30分钟，并用LPA或卡巴胆碱刺激15分钟。裂解后，用多克隆抗磷酸化Akt/PKB（P-Akt）抗体对总裂解物进行免疫印迹，然后用多克隆抗体对相同的过滤器进行复制，以检测活化的Akt/PKB。(E类)AR抑制对LPA诱导的DNA合成的影响。用所示抑制剂处理SCC-15细胞，并在有或无配体（LPA；AR，10 ng/ml）的情况下培养18 h。然后用脉冲标记细胞[^三H] 用液体闪烁计数法测定胸苷和胸苷掺入量。三个独立实验的定量分析（平均值±标准偏差）*P（P）LPA与抑制剂+LPA的对比<0.001。

第三，由于AR含有肝素结合域，而糖胺聚糖肝素可阻止角朊细胞中AR引发的有丝分裂反应(库克等人，1991年)，我们评估了肝素对EGFR反式激活信号的影响。正如预期的那样，肝素完全阻断了LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化（图4A、 上部面板）。基于这些发现，我们接下来研究了反式激活EGFR下游的SHC激活是否需要AR功能，因为已知衔接蛋白SHC的酪氨酸磷酸化和SHC–Grb2–Sos复合物的形成是将激活的EGFR连接到Ras/MAPK级联的关键步骤（参见Bar-Sagi和Hall，2000年). 事实上，用抗AR中和抗体和肝素阻断AR可完全阻止LPA诱导的SHC酪氨酸磷酸化（图4A、 下面板）和SHC与GST–Grb2融合蛋白的关联在体外（图4B） ●●●●。

一些研究已经证明，EGFR反式激活是GPCR激动剂激活ERK/MAPK通路的一个重要机制(福雷等., 1994; 已在中审阅格什温等., 2001;Marinissen和Gutkind，2001年). 为了确定LPA刺激的HNSCC细胞ERK/MAPK激活是否需要AR，研究了AR抑制对ERK1/2激活的影响。如图所示4C、 AR中和抗体、肝素和batimastat可阻止LPA诱导的SCC-9和SCC-15细胞ERK1/2活化。除了其促有丝分裂作用外，LPA还可以通过激活ERK/MAPK通路和Akt/PKB的PI3K依赖性磷酸化来充当生存因子(沙丁等., 2001). 因此，我们提出了LPA刺激是否诱导头颈癌细胞中Akt/PKB磷酸化的问题。结果表明，LPA显著增加了Ser473处Akt/PKB的磷酸化（图4D） 并且Akt/PKB的激活被EGFR-特异性酪蛋白AG1478抑制。此外，LPA的Akt/PKB磷酸化对沃特曼或LY294002的PI3K抑制敏感（图4D） 并且在SCC-9和SCC-15细胞中通过AR阻断或batimastat治疗也被废除（图4C） ●●●●。

为了进一步扩展我们对AR在促生长GPCR信号中的作用的研究，我们评估了AR抑制对LPA诱导的DNA合成的影响。如图所示4E、 抑制AR后，HNSCC细胞显示LPA触发的DNA合成速率显著降低，表明LPA的完全增殖反应需要AR。此外，batimastat和AG1478将LPA的DNA合成降低到基础水平以下。总的来说，这些数据证实了AR在HNSCC中生成EGFR-特征性、有丝分裂和运动促进的反式激活信号的必要性。

蛋白质分析

如前所述裂解细胞并免疫沉淀蛋白质(格什温等., 2002). 在SDS-PAGE后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。按照标准方法进行蛋白质印迹。抗人EGFR（108.1）和SHC抗体(普伦泽尔等., 1999)以及GST–Grb2融合蛋白(涂抹等., 1996)，之前已经进行了表征。用4G10单克隆抗体（UBI，纽约州普莱西德湖）检测磷酸酪氨酸。多克隆抗磷酸化p44/p42（Thr202/Tyr204）MAPK抗体和抗磷酸化Akt（Ser473）抗体购自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州贝弗利）。多克隆抗Akt1/2和抗ERK2抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯），抗TACE抗体来自Chemicon（英国哈罗）。

流式细胞术分析

如前所述进行荧光激活细胞分选（FACS）分析(普伦泽尔等., 1999). 简而言之，细胞被接种，生长20小时，在某些情况下，如所示被逆转录病毒感染。在血清饥饿24小时后，用所示的抑制剂和生长因子处理细胞。收集后，用抗HB-EGF、AR（研发系统）或TGF-α（致癌基因，马萨诸塞州波士顿）的外源性抗体对细胞染色45分钟。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，用异硫氰酸荧光素（FITC）结合二级抗体孵育细胞15分钟，然后用PBS再次冲洗。细胞在Becton Dickinson FACScalibur流式细胞仪上进行分析。

AR酶联免疫吸附试验

将SCC-9细胞接种到12孔板（3.2×10⁴细胞/孔），培养18小时。剥夺血清24小时后，用batimastat（10µM）对细胞进行预培养20分钟，并如图中图例所示进行刺激。收集细胞培养基，在添加苯甲基磺酰氟（PMSF；1 mM）后，通过离心（10分钟；13000转/分）预先清除。样品被转移到抗体涂层板上。

使用单克隆抗AR捕获抗体（MAB262）和生物素化多克隆检测抗体（BAF262）通过夹心ELISA（R&D系统）测定游离AR的浓度。根据制造商的建议，使用四甲基联苯胺作为底物进行平板制备和分析程序。使用ELISA平板读取器以650 nm的参考波长读取455 nm处的吸光度。在使用人重组AR蛋白的稀释系列生成标准曲线后，计算每个样品的AR浓度。

对于统计分析，学生t吨-测试用于比较两组之间的数据。数值表示为至少三份样品的平均值±SD。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

RNA干扰和RT-PCR分析

如前所述，使用寡病毒胺（Invitrogen）和每6孔板4.2微克siRNA双链体转染21个核苷酸siRNA双联体（Dharmacon Research，Lafayette，CO）以靶向内源性基因(埃尔巴希尔等., 2001). 转染的SCC-9细胞在转染后4天进行血清饥饿和检测。通过使用靶向感兴趣基因不同区域的siRNA双链混合物，可以获得沉默靶基因的最高效率。所使用的siRNA序列为CCACAAUCGGCUATAdTdT、AAAUCCAAGUAGCAGAAdTd（AR）；GUGAAGUGGGCAU GACUAdTdT、UACAAGACUUCCAUCCdTdT（HB-EGF）；AAC ACUGUGGUGCCGdTdT、GAAGCAGGCCAUCGCTdT（TGFα）；AGUUGCUUGGCACACCUUdTdT、AGUAAGGCCCAGG AGUGUUdTd、CAUAGAGCCACUUUGGAGdTd（TACE）；CCU CGCUGCAAAGAUGUGdTdT，GACCUUGATACACGUGdT dT（ADAM12）；CGUACGGAAUACUUCGAdTdT（控制，GL2）。

通过western blot（TACE）和RT-PCR分析证实了靶基因的特异性沉默。使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）分离的RNA使用AMV逆转录酶（Roche，Mannheim，Germany）逆转录。使用PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）进行PCR扩增。引物（Sigma Ark，Steinheim，德国）为proAR，5′-tGGTGTCGCTTGATA-3′和5′-GCCAGGTATTGGTGTCGT-3′；proHB-EGF，5′-TTATCTCCAAGCCAAGC-3′和5′-TGACCAGACAAGAGAGATG-3′；proTGF-α，5′-TGTTCGCTCT GGGTATTG-3′和5′-ACTGTTCGAGTGGCAGCA-3′；TACE，5′-CGCATTCAAGTCTCCACA-3′和5′-TATTCCCCCCTGG TCCTC-3′；和ADAM12，5′-CAGTTTCACGGAACCCACT-3′和5′-GACCAGAACACGTGCTGGAGA-3′。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，DNA通过溴化乙锭染色显示。