纳瓦霍神经肝病是由MPV17型基因

摘要

纳瓦霍神经肝病（NNH[MIM256810])是一种常见于美国西南部纳瓦霍人的常染色体隐性多系统疾病。据估计，纳瓦霍保留地西部的该病发病率为1600例活产婴儿中的1例。¹NNH患者表现为肝病、严重的感觉和运动神经病变、角膜麻醉和瘢痕形成、脑白质脑病、发育不良、反复代谢性酸中毒伴并发疾病。^1–三根据发病年龄和临床病程，已筛选出三种表型。婴儿型（即6个月前发病）和儿童型（即1至5岁发病）NNH以严重肝病和肝衰竭早期死亡为主。NNH的典型表现为中度肝功能障碍和进行性神经病变。所有三种形式均可见外周和中枢神经系统脱髓鞘。同一家族中三种不同的NNH型的出现说明了临床异质性。¹迄今为止，NNH的遗传原因尚不清楚。

NNH患者和mtDNA缺失综合征（MDS）患者的临床、病理和生化特征相似，提示mtDNA拷贝数的异常调节可能是NNH的主要缺陷。^1,三两名NNH患者肝活检中mtDNA缺失的文献证实了这一概念。^三这一发现反过来促使我们对这两名NNH患者的MDS相关基因进行测序，包括编码线粒体脱氧鸟苷激酶的基因(DGUOK公司[MIM公司601465]),⁴线粒体胸苷激酶(TK2型[最小188250]),⁵琥珀酸-CoA连接酶ADP-形成β亚基(SUCLA2公司[MIM公司603921]),⁶和聚合酶γ(POLG公司[MIM公司174763]),⁷但我们没有发现致病性突变。编码线粒体转录因子A的另一候选基因的测序(TFAM公司[MIM公司600438])也没有发现任何潜在的突变。

另一方面，来自纳瓦霍保留地西部纳瓦霍人的历史和人口数据强烈表明，作为NNH的起源，存在创始人效应。在这种情况下，纯合子作图是鉴定致病基因的有力工具。因此，我们研究了两个扩展的纳瓦霍族家族，其中疾病分离为常染色体隐性性状(图1). 在我们研究的后期，又登记了三个NNH核心家庭（3-5个家庭）(图1). Holve等人报告了NNH的诊断标准。¹

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图1

带有NNH的1-5号系列。Singleton等人描述了家族1。⁸Holve等人。¹Vu等人将家系4（II-1）和家系5（II-1）的先证者分别报告为患者1和患者2。^三核苷酸149G→MPV17型基因用加号（+）表示，正常序列用减号（−）表示。

家族1已在别处描述^1,8：V1、V3和V8患者分别患有婴儿型、经典型和儿童型NNH，V11和V12患者V8的两个受累兄弟也患有经典型NNH。¹在生命的第一年，患者1（V11）在发烧期间反复出现低血糖和代谢性酸中毒。他发育不良，发育迟缓；他的身高和体重都低于5%，他2岁时开始走路。在学校里，他有学习困难。10岁时，他因进行性肌无力接受了医学评估。他的步态很宽，无法奔跑，也无法用手拿重物。检查显示远端肢体比近端肢体无力、袜子手套感觉缺失和屈曲无力；神经传导研究证实存在周围神经病变。肌肉活检显示神经源性萎缩。他没有角膜溃疡或疤痕。他没有肝肿大或肝功能障碍的证据，但他的血清γ-谷氨酰转移酶（GGT）轻度升高。到12岁时，他已经失去了行走和吞咽的能力，这就要求他被安置在慢性病护理机构，在那里他通过胃造口管进食。他发展为肝硬化，16岁时死于肝衰竭。

作为一名女婴，患者2（V3）（Holve等人报告为患者12）。¹)反复低血糖和代谢性酸中毒伴发热。在6个月大的时候，人们注意到她发育不良，运动发育迟缓。在她2岁的时候，当她第一次行走时，她的肢体远端肌肉无力、消瘦和无屈曲。神经传导研究显示速度缓慢。血清转氨酶和GGT是正常上限的两到三倍，总胆红素和直接胆红素轻度升高。她的虚弱更加严重，到了4岁时，她只能靠用力翻过地面才能移动。由于远端感觉缺失，她肢端残割并发复发性皮肤感染。她还进行了角膜麻醉，并出现了角膜溃疡。她的智商是72。脑磁共振成像（MRI）显示弥漫性白质脑病，在小脑中尤为突出。16岁时，她因神经病变需要轮椅，角膜瘢痕导致视力下降。20岁时，她的呕吐症状，评估显示食管静脉曲张和肝硬化。她死于肝衰竭。

Holve等人将患者3（家系2中的III-6）报告为患者17。¹这个男孩有经典的NNH。他有一个姐姐（Holve等人报告称为患者1）。¹)他在1岁时死于肝衰竭，并被推定患有NNH。在婴儿期，他有粗大运动迟缓和发育不良；他2岁时开始走路，身高和体重<5%。3岁时，他出现角膜溃疡，医学评估显示有周围神经病变的迹象，包括角膜感觉丧失、袜子手套感觉丧失、远端肢体无力和屈光不正。神经传导研究显示明显减慢，腓肠神经活检显示有髓纤维严重丢失。血液测试显示转氨酶和GGT升高，但胆红素正常。4岁时，他感染了水痘，并伴有肝衰竭、急性呼吸窘迫综合征、代谢性酸中毒和肾功能障碍，但他接受了重症监护。随后，他的转氨酶持续升高，是正常和轻度升高总胆红素和直接胆红素上限的两到三倍，他的神经病变逐渐恶化。到了10岁，他已经不能走路，也不能自己吃饭或穿衣了。由于感觉神经病导致的肢端残割导致反复感染。他通过胃造口管进食。脑部MRI显示白质脑病。14岁时，他因食管静脉曲张和肝硬化而吐血。一年后，他死于肝衰竭。

Holve等人将患者4（家系3中的个体II-1）报告为患者4。¹这名女孩患有婴儿期NNH，其第二个表亲（Holve et al。¹以及本报告中的患者5）。6个月大时，这名女婴出现发育不良、黄疸和肝肿大。实验室研究显示转氨酶、GGT、总胆红素和直接胆红素升高。Prothrobin时间延长。肝活检显示胆汁淤积、脂肪变性和纤维化。一个月后，她成功进行了肝脏移植。尽管肝功能良好，但她仍反复出现代谢性酸中毒，体重没有增加。神经系统检查显示张力减退、远端肢体无力、粗大和精细运动延迟。3岁时，她没有支撑就无法站立。她有周围神经病变的症状；她的手脚没有疼痛感，角膜感觉减弱，肢体远端肌肉无力无力，肌腱反射消失。神经传导研究显示传导缓慢。脑部MRI结果正常。12岁时，患者的供肝功能良好，但她的身高和体重仍低于5%，周围神经病变继续恶化。

患者5（家系4中的II-1）患有婴儿NNH，Vu等人将其报告为患者1。^三她有一个患有婴儿型NNH的堂兄（本报告中的患者4）。患者在1个月大时出现体重增加不良，并注意到转氨酶、总胆红素和直接胆红素水平升高。在4个月大的时候，她被评估为发育不良，并被发现患有肝肿大。肝活检显示急性肝细胞坏死、肝硬化、微泡和大泡脂肪变性。15个月大时，她有明显的腹胀和腹水、肌肉萎缩、张力减退和反射减退。脑部MRI显示弥漫性白质脑病。一个月后，她接受了肝移植。她移植的肝脏功能正常，但仍然无法发育，反复出现代谢性酸中毒。放置胃造瘘管。2岁时，她患上了吸入性肺炎和革兰氏阴性败血症并死亡。随后对移植肝组织进行的组织化学分析显示，大多数肝细胞中COX缺乏，琥珀酸脱氢酶活性正常升高。^三肝脏的生化研究表明，呼吸链酶复合物I、III和IV（包含线粒体DNA编码亚单位）的活性降低，柠檬酸合成酶活性显著增加。^三肝脏mtDNA的Southern杂交显示89%的缺失。^三

患者6（家族5中的II-1）是一名患有典型NNH的21岁女性，Vu等人将其报告为患者2。^三4个月大时，她出现了与低血糖相关的癫痫发作。两个月后，对发育不良的评估显示转氨酶轻度升高。20个月大时的肝活检显示小结节性肝硬化、轻度脂肪变性和细胞内糖原积聚。11岁时，她患上了肝细胞癌并接受了肝移植。虽然她的移植肝脏功能良好，但她出现了周围神经病变。神经传导研究显示速度较慢，脑部MRI显示白色病变。对移植肝脏的小样本进行的有限研究表明，线粒体DNA耗竭了82%，通过生化分析，COX降低，但柠檬酸合成酶活性正常。^三她有一个患病的哥哥，他也有发育不良、低血糖和慢性肝衰竭，5岁时死于食道静脉曲张出血。

根据机构审查委员会批准的方案，在书面知情同意后，从所有患者和未受影响的受试者中获取外周血。来自2名受影响个体（家族1的患者V3和家族2的患者III-6）和15名未受影响个体的血液DNA用于连锁分析，从家族1的V8患者先前获得的肝活检样本中提取的基因组DNA也用于我们的研究。所有患者均符合NNH的诊断标准。¹使用一组平均距离为10cM的400个多态性DNA微卫星标记进行全基因组扫描（ABI Prism Linkage Mapping set MD-10[Applied Biosystems]）。PCR产物在ABI Prism 310基因分析仪上运行。使用Genescan和Genotyper软件（Applied Biosystems）鉴定基因型。利用计算机软件包linkage 5.1版的MLINK选项进行参数两点连锁分析，假设常染色体隐性遗传，外显率为90%，突变频率为1/100000。利用研究中所有家庭成员的单倍型估计等位基因频率。假定雄性和雌性的重组频率相等。

基因型分析显示只有一个纯合单倍型，带有微卫星标记D2S305型在染色体2p24.1处，由所有受影响个体共享，在未受影响的家庭成员中缺失或杂合（数据未显示）。有趣的是，该标记是仅有的10个两两LOD评分为⩾1的微卫星标记之一(表1). 使用附加多态性DNA标记侧翼位点的进一步分析D3S1263、D5S406、D7S510、，和D9S1826号文件排除与这些基因座的连锁。根据我们的微卫星标记研究，我们还排除了两个候选基因的突变，即核呼吸因子-1(NRF-1型[MIM公司600879])和线粒体内切酶G(ENDOG公司[MIM公司600440])-参与维护mtDNA拷贝数。

然后我们考虑了染色体位点周围的其他候选基因D2S305中，包含通过整合基因组学鉴定的线粒体功能相关基因的区域。⁹其中一个是MPV17型（MIM137960)最近与一种新的肝脑型MDS有关。¹⁰该基因与我们的染色体位置非常接近，并且所述患者的表型与MPV17型婴儿NNH的突变和临床表现促使我们在我们的患者中对该基因进行直接突变分析。测序显示我们的患者1-6中存在纯合R50Q突变。对所有可用的未受影响个体的进一步遗传分析证实了突变与疾病的分离。综上所述，连锁分析结果和对患有三种不同形式疾病的患者的相同致病性R50Q突变的检测结果表明MPV17型是NNH的致病基因。需要对来自不同家族的其他NNH患者进行分析，以探讨NNH的可能遗传异质性。

Mpv17型在小鼠基因组中插入逆转录病毒后，基因表达减少，从而导致基因功能不全。¹¹最初，Mpv17型^−/−小鼠出现肾小球硬化。先前的研究表明编码蛋白存在过氧化物酶体定位。¹²随后MPV17型-在来自两个家族的四名MDS患者中，一名意大利人和另一名摩洛哥血统的MDS患者外显子2中的R50Q和外显子7中的N166K被鉴定。¹⁰加拿大一家系的第三名患者第2外显子R50Q和第7外显子25-bp缺失为复合杂合子。对HeLa细胞中的突变进行的功能分析显示MPV17型参与线粒体DNA的维持和氧化磷酸化的调节。¹⁰同一报告中描述的进一步研究¹⁰表明编码蛋白定位于线粒体内膜Mpv17型^−/−小鼠肝脏线粒体DNA缺失，与人类疾病相似。

NNH是一个定义明确的临床实体。这三种类型的重叠临床特征似乎形成了一个谱，从破坏性婴儿到主要的经典型，再到更良性和缓慢进展的神经病变类型，这一谱与年龄相关。^1,8目前尚不清楚为什么一些患者在婴儿期死于肝衰竭。随着肝移植的成功，婴儿型NNH患者（如本报告中的患者4和5）发展为进展性周围神经病变和CNS白质脑病，与典型NNH患者相似。由于神经功能障碍的不可避免的进展，肝移植在治疗这种疾病方面的价值非常有限。神经病变是NNH的一个显著诊断特征，在其他形式的婴儿MDS中并不常见。只有良性迟发性肌病型MDS患者TK2型突变与阿尔卑斯综合征（MIM）患者203700)和POLG公司突变显示亚临床神经病变。

Spinazzola等人描述的6名MDS患者的表型。¹⁰类似于以致命性早发性肝病为主的NNH临床谱的一端。意大利家系的四名受影响婴儿中，有两名婴儿与我们的NNH患者具有相同的纯合R50Q突变，他们在9个月前死亡。在同一份报告中，2-4和3-1名患者的病程相似。¹⁰值得注意的是，两名携带纯合R50Q突变的存活患者出现了多发性脑损伤和生长迟缓，这都是NNH的典型症状。^13,14另一方面，患者4-1出现进行性脊髓小脑共济失调、手足肌阵挛、精神发育迟滞和严重的神经源性脊柱后凸，这些不属于NNH的临床特征。有趣的是，通过低血糖饮食控制，该患者延长生存期至9岁，可能对婴儿和儿童型NNH患者具有治疗意义。这种表型变异性表明，MDS的其他神经肝脑形式可能是由以下基因突变引起的：MPV17型非纳瓦霍人患者。或者，NNH中显著的外周神经系统参与可能表明额外的未连锁修饰基因或表观遗传因子在表型的确定中起作用。

对两名NNH患者的肝脏样本进行了线粒体DNA缺失和呼吸链缺陷评估。两者都显示出明显的耗竭（与对照组相比减少89%和82%），并且与mtDNA-编码亚单位的呼吸链复合物的活性相应降低。因为只有一名婴儿NNH患者和另一名典型型NNH患者的肝脏被研究过，所以不可能将线粒体缺陷的严重程度与NNH亚型联系起来。值得注意的是，NNH患者肝脏中mtDNA的缺失与Alpers综合征患者肝脏中观察到的mtDNA缺失相似（60%–97%mtDNA缺失），原因是POLG公司突变，^15–17患有肝脑疾病DGUOK公司突变（线粒体DNA缺失61%-98%），^4,18以及由于以下原因导致的肝脏疾病MPV17型突变（>70%mtDNA缺失）。¹⁰

总之，我们通过纯合性定位确定了导致NNH的遗传缺陷，表明MVP17型说明了这种疾病的不同形式。识别MPV17型因为致病基因将为NNH提供明确的产前和产后诊断，并将阐明该疾病的发病机制。

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