中的突变CEP290公司(NPHP6核电站)基因是Leber先天性黑蒙的常见病因

摘要

Leber先天性黑蒙（LCA[MIM204000])是一种严重的视网膜营养不良症，在出生时或出生后的头几个月内会导致失明或严重的视力损害。LCA通常以常染色体隐性方式遗传，具有遗传异质性。迄今为止，八个基因的突变(AIPL1、CRB1、CRX、GUCY2D、IMPDH1、，RDH12、RPE65、，和RPGRIP1系统)已发现与生命周期评价有关。^1–三在2%–15%的LCA患者中发现了这些基因的突变，这八个基因加在一起占所有LCA病例的约45%。^4–8

我们确定了一个有血缘关系的法裔加拿大家庭，有四个兄弟姐妹受到LCA的影响(图1A类)我们排除了所有已知LCA基因的参与IMPDH1。进行全基因组连锁扫描以定位致病基因缺陷。这四个受影响的兄弟姐妹进行了11555个SNP的基因分型，这些SNP分布在整个基因组中（Affymetrix基因芯片人类定位10K阵列）。使用Allegro进行多点联动分析⁹easyLINKAGE-Plus软件包中的1.2c版，¹⁰使用白色等位基因频率。我们确定了四个多点LOD评分>2的染色体间隔。用多态性CA重复标记对母亲、四个受累同胞和五个未受累同胞的所有四个区域进行分析。单体型分析排除了其中两个区域。最高的多点LOD评分（2.9和3.0）在两个染色体间隔处获得：12q21-q22(rs950017–rs1385060)和15q26(rs1384739–rs725213). 第15号染色体上的区域只包含一个基因(MCTP2型)，其编码多个C2结构域跨膜蛋白。对编码外显子和剪接接头进行突变分析，但只检测到已知的变异。

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图1

法裔加拿大LCA患者家庭的谱系和临床特征。A、，家族谱系。四个兄弟姐妹受LCA影响(黑色符号)父母是堂兄妹。染色体12间隔的单倍体显示包含CEP290.B–E、，45岁时受累同胞IV-8右眼的彩色眼底照片。B、，后极，显示近视改变，脉络膜显示，轻度视盘苍白，极显著的小动脉和小静脉狭窄，中央凹发育不良，以及沿上拱廊延伸的毛细血管周萎缩。C、，上视网膜，显示一小块孤立的色素沉着区，一个骨针，以及弥漫性脉络膜。D、，视网膜下部，可见小团块圆形色素沉着。E中，颞下视网膜，显示更广泛的小而圆的视网膜内色素沉着（色素沉着）。由于轻度核白内障，图像略微模糊。F、，40岁先证者IV-7中脑水平的CT扫描。大脑的轴视图显示了中脑和小脑的正常结构，没有臼齿征。G、，40岁先证者IV-7基底神经节和脑室水平的CT扫描，显示大脑结构正常，无小脑萎缩。H（H）和我，51岁时受累同胞IV-6的肾脏超声检查。在实质水平上，两个肾脏都显示出孤立的微小病灶，回声明显增强，但没有明确的后部阴影。这些主要位于左侧皮质水平，但也有少数位于两侧髓质附近，可能表明存在肾钙质沉着。在这两张图像中，既没有明确的囊肿，也没有收集系统扩张或输尿管扩张。没有肾病的证据。

12号染色体上的区域包含15个基因，包括CEP290公司（或NPHP6核电站[MIM公司610142]) (图1A类). 最近，该基因的突变与Joubert综合征的多效性形式有关。^11,12Joubert综合征是一种常染色体隐性遗传疾病，以神经系统特征为特征，包括精神运动迟缓、张力减退和共济失调。Joubert综合征的典型神经放射学特征是“臼齿征”，表示小脑蚓部发育不全或发育不全。除了神经系统的特征外，Joubert综合征患者还可能会发展为肾病和视网膜营养不良。Joubert综合征的临床谱与CEP290公司突变是广泛的。所有患者都有典型的Joubert综合征的神经系统症状，但肾脏疾病要么严重，要么不存在。所有分析的患者都有先天性黑蒙或视网膜色素变性。几乎所有患者的两个等位基因都有无意义或移码突变。中的帧内删除Cep290型该基因最近也与早发性视网膜变性有关第16行鼠标。¹³经过广泛评估，在这些小鼠中未检测到大体的大脑或肾脏病理。CEP290定位于分裂细胞的中心体和感光细胞的连接纤毛。CEP290与几种基于微管的转运蛋白相关，包括RPGR，一种在X连锁视网膜色素变性和圆锥型营养不良患者中突变的蛋白。

受法国-加拿大LCA影响的家庭中的受影响个体在出生时都是失明或严重视力受损的，并且从～6周龄开始出现游走性眼球震颤。患者IV-7在43岁时首次被我们看到，我们观察到他有光感视力，有眼指征和眼球内陷。我们还注意到轻度小眼畸形、远视性屈光、明显圆锥角膜、致密白色白内障、晶状体异位和色素性视网膜变性伴色素沉着。四个受累同胞的视觉功能差异显著，从IV-6和IV-7患者的光感到IV-8患者的功能性视力（20/150视力），以及IV-9患者的隧道视力（30°）（20/80视力）。图中显示了患有近视散光屈光的IV-8患者的视网膜情况​图1B类1B类–1E类四个受累同胞中有两个（IV-6和IV-7）出现癫痫发作，这不是Joubert综合征的典型症状，也没有其他神经症状。所有四名受累同胞的认知功能均正常。IV-7患者的详细CT扫描（重复五次）显示无臼齿征，无小脑萎缩，无Joubert综合征的结构性征象（图。​（图1F类1F类和​和1克).1克). 先证者和受影响的同胞现在都是40多岁和50多岁，从未出现任何肾脏疾病的临床症状。患者IV-6在51岁时肾脏超声检查正常（图。​（图1H（H）1H（H）和​和1我1我).

由于其功能和表型第16行我们考虑过老鼠CEP290公司在这个法裔加拿大人家族中是一个很好的LCA候选基因。我们对所有53个编码外显子和剪接连接进行了测序，在外显子21中仅检测到一个同义序列变体（c.2055T→c[p.A685A]），这不是已知的SNP。由于该变异体位于剪接启动子位点和预测的外显子剪接增强子之间(^ESE救援,14)，我们推断它可能对该外显子的剪接有影响。然而，对从患者IV-6的Epstein-Barr病毒永生化淋巴母细胞系中分离的RNA进行RT-PCR并没有发现外显子21的异常剪接。随后，我们分析了完整的CEP290公司mRNA通过RT-PCR，使用21组重叠引物。使用设计用于扩增外显子26-29的引物集检测到异常剪接产物(图2A类). 测序结果显示，在第26和27外显子之间插入了一个128-bp的隐秘外显子，该外显子在第26外显子下游引入了一个终止密码子(图2B类). 值得注意的是，受影响个体中仍存在少量野生型产品。在8名对照个体中未检测到异常剪接产物(图2A类).

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图2

分子特征CEP290公司受LCA影响的近亲家庭中的突变。A、，的反转录CEP290公司mRNA和随后的PCR使用位于两个受累家族成员（IV-6和IV-7）第26–29外显子的引物，显示出一个正常大小的片段和一个较大的异常片段(上部面板). 8名对照个体（C1–C8）未出现异常片段。使用位于隐匿外显子（X）和外显子29的引物进行RT-PCR，发现LCA患者中有一个异常片段，但对照组中没有(下部面板). 车道M包含100-bp标记。B、，对异常RT-PCR产物进行测序，显示一个隐秘外显子（X）剪接在外显子26和27之间。隐秘外显子在第26外显子下游引入了一个提前终止密码子。C、，隐秘外显子X位于外显子26下游1.5 kb处。对外显子X周围的基因组DNA（gDNA）进行测序，发现隐秘外显子下游5 bp处发生突变（c.2991+1655A→G）。该突变引入了一个强剪接位点。隐秘外显子中的核苷酸以大写字母表示，内含子序列以小写字母表示。D、，等位基因特异性PCR显示，c.2991+1655A→G突变与该家族疾病分离。所有受影响的家庭成员（IV-6、IV-7、IV-8和IV-9）均为突变纯合子，而未受影响的个体为杂合子或未携带突变。通道C代表一个控制个体。

该隐秘外显子的序列位于外显子26下游1.5kb的内含子26中，包含一部分Alu公司元素。在野生型序列中，外显子前面有一个强剪接受体位点（剪接预测得分0.93），但没有预测剪接受体位置（NNSPLICE版本0.9；基于神经网络的BDGP拼接位点预测网站）。¹⁵我们对患者IV-6隐匿外显子周围的基因组DNA进行了测序，并在隐匿内显子下游5 bp处检测到A→G转换（c.2991+1655A→G）(图2C类). 该突变产生了一个强大的剪接单体位点（剪接预测分数0.90），这可能导致隐秘外显子高效剪接到CEP290公司mRNA。突变与家族疾病分离(图2D类).

为了确定这种突变是否是LCA的常见原因，我们通过等位基因特异性PCR筛选了76名不相关的LCA患者的c.2991+1655A→G突变。¹⁶先前通过基于微阵列的突变检测排除了这些患者中已知LCA基因的参与⁶和/或全面的异源双链分析。引人注目的是，4名患者为突变纯合子，12名患者为c.2991+1655A→G杂合子(表1). 223名法裔加拿大对照者中未检测到该突变，248名荷兰对照者中有1人被发现为该突变的杂合子。

这些结果表明，c.2991+1655A→G突变是LCA的重要原因，可能解释高达21%的LCA病例。假设白人中LCA总发病率为1/100000CEP290公司Hardy-Weinberg方程预测，10%的LCA患者的突变总数CEP290公司突变等位基因频率为1/1000，携带者频率为1/500。假设c.2991+1655A→G变异体占所有突变等位基因的三分之二，预测携带频率为1/750个体。如果CEP290公司30%的LCA病例中存在变异，预计携带频率为1/433人。

对12名c.2991+1655A→G杂合的患者进行了分析，以确定其53个编码外显子和剪接连接的额外突变CEP290公司通过异源双链分析和/或直接测序。在所有患者中，我们检测到其他等位基因的杂合突变(表1). 五个突变引入一个提前终止密码子，六个导致移码，一个影响外显子3剪接位点的恒定GT二核苷酸。

在九个家庭中，其中两个CEP290公司检测到突变，家族成员可用于分离分析。在所有9个家系中，观察到常染色体隐性遗传预期的变异分离(图3). 患者没有典型的Joubert综合征神经症状，认知功能正常，没有肾脏疾病的临床症状。患者21393本体感觉异常，但其他方面健康。四名代表性患者的临床详细信息如下所示。

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图3

分离分析CEP290公司九个受LCA影响的家族中的突变。在所有9个家族中，突变的分离符合常染色体隐性遗传。每个家庭都标明先证者(箭头). M1=c.2991+1655A→G；M2=p.Glu1956X；M3=p.Arg1272X；M4=p.Thr89AsnfsX1；M5=c.180+1G→T；M6=p.Leu517X；M7=p.Ile1372LysfsX3；M8=p.Glu1656X；+=野生型。

患者27245是一名男性婴儿，我们在他10个月大的时候第一次看到他。一位儿科医生发现他的头围很大，并对他的大脑进行了核磁共振成像和超声波检查，一位儿科神经放射科医生发现这是正常的。两个肾脏的超声检查结果也正常。在眼科评估中，我们发现该儿童没有固定，也没有跟随近靶点。他表现出眼指征，屈光显示出明显的远视。视网膜检查显示血管狭窄，视网膜色素上皮斑驳，视网膜内有多个白色斑点。视网膜电图（ERG）检测显示出无法检测到的视杆和视锥反应。

27242号患者的脑部CT也完全正常。在7个月大时的眼部检查中，没有看到任何视觉行为，也没有固定，也没有跟踪目标。她表现出眼指征、眼球震颤和高度远视。视网膜外观基本正常，血管轻度衰减。ERG信号无法检测到。

在18个月大时，患者27246没有表现出视觉行为，出现游走性眼球震颤、眼指征、高度远视和无法检测到的ERG信号。视网膜外观基本正常。27250名患者出生时也是盲人，有光感视力，我们记录了后极白内障、圆锥角膜和无法检测到的ERG信号。

这个CEP290公司在76例无血缘关系的LCA患者中，16例（21%）检测到c.2991+1655A→G突变，因此是迄今为止发现的LCA最常见的原因之一。携带这种突变的患者来自不同的地理区域，包括加拿大、德国、荷兰和意大利。突变导致异常剪接，但仍存在少量正确剪接的产物，这表明这可能足以维持正常的小脑和肾功能，但不足以维持感光细胞的正常功能。两者功能完全丧失CEP290公司等位基因导致Joubert综合征，而LCA患者有少量残留CEP290公司活动。这种剂量依赖性机制与早期发现的ABCA4型该基因与Stargardt病、圆锥肌营养不良和色素性视网膜炎有关美国H2A该基因与非综合征性视网膜色素变性和Usher综合征相关。^17,18

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