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分子生物学细胞。2006年9月；17(9): 4063–4068.
数字对象标识：10.1091/桶。E06-03-200
预防性维修识别码：项目经理1556385
PMID：16822836

酵母Sec61p的插入结构域对有效的蛋白质转移很重要，但对细胞活力不是必需的

蒂娜·朱恩, 托尔斯滕·施威德, Veit Goder公司,*和马丁·施皮斯通讯作者
里德·吉尔摩，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Sec61/SecY转座子介导蛋白质跨膜转运和膜蛋白整合到脂质双层。转座子的结构显示，内腔侧有一个堵塞孔。它被认为是重要的门控蛋白质传导通道和维持其未被占用状态的通透性屏障。在这里，我们分析了在酵母中引入插入域的不稳定点突变或其部分或完全缺失的影响。出乎意料的是，即使删除了整个插入域，细胞仍能存活，没有生长表型。它们对诊断信号锚定蛋白的信号序列定向有影响，在共翻译中有轻微缺陷，在翻译后易位中有显著缺陷。突变蛋白的稳定状态水平降低，当与野生型Sec61p共表达时，缺乏塞子的突变体对复杂伴侣的竞争能力较差。结果表明，塞子对封闭酵母中的易位孔不太重要，但在易位子形成期间，塞子在稳定Sec61p中发挥了作用。

简介

蛋白质在内质网（ER）膜上的转运和整合均由Sec61转座子复合物介导(Johnson和van Waes，1999年). 蛋白质通过疏水信号序列靶向这个复合物(冯·海因（von Heijne），1990年). 未分离的信号和随后的多肽疏水片段作为跨膜螺旋整合到双层中。无论是膜中蛋白质拓扑结构的决定因素还是整合的机制都没有被完全理解。膜内蛋白质拓扑学最简单的例子是信号序列进入转座子时的方向。信号序列可能会移位C端（可切割信号和信号锚定）或N端（反向信号锚定器）。信号定向的最佳确定因素是信号疏水核两侧带电残基的分布。根据“积极内部规则”(冯·海因（von Heijne），1986年;哈特曼等., 1989)，阳性端通常为胞质。其他决定因素是序列N末端折叠为内部信号，这可能会阻碍N移位(登策尔等., 1995)以及非极性信号核的疏水性(阪口等., 1992;Wahlberg和Spiess，1997年;欧塞比奥等., 1998;哈雷等., 1998;罗什等., 2000;戈德与间谍，2003年).

Sec61转座子由具有10个跨膜结构域的Sec61α（酵母中的Sec61p）和单一跨越蛋白Sec61β（Sbh1p）和Sec61γ（Sss1p）组成，在细菌中对应于SecY复合物（SecY/SecG/SecE）。古细菌SecY复合体的最新晶体结构詹氏甲烷球菌(范登伯格等., 2004)揭示了一个惊人紧密的螺旋束，具有潜在的亲水通道孔和由跨膜段TM2和TM7组成的横向出口位置，与先前的交联数据一致(普拉斯等., 1998). 这表明易位通道是由单个异源三聚体形成的。该结构清楚地代表了闭合状态，因为中央通道被管腔塞域和中央收缩环阻塞。要打开，塞需要向外移动，环必须膨胀以加宽中央通道。通过半胱氨酸诱变和二硫键交联，证明易位多肽确实定位于SecY的中心大肠杆菌(加农炮等., 2005). 插入结构域可能参与信号序列触发的转锁子的门控，以允许多肽进入和转运，并在空闲时封闭通道(Tam公司等., 2005).

在对Sec61p中的保守带电残基进行的系统分析中，这三个残基（R67、R74和E382）是负责正内侧规则的候选残基，被鉴定为符合标准，即当突变时，具有更多正N末端侧翼电荷的模型信号锚蛋白的N移位增加，而具有相反电荷差的模型蛋白的N易位减少(戈德等., 2004). 根据古细菌SecY复合体的结构，E382位于跨膜段TM8的细胞质末端，R67和R74都位于插入域，这些位置似乎适合影响进入封闭通道的信号的方向。为了测试插入结构域在信号定向中的作用及其对转座子功能和细胞活性的重要性，引入了特定突变来干扰其结构，包括完全缺失。令人惊讶的是，尽管易位效率和转座子形成降低，但插入结构域的突变或缺失并不影响存活率或生长。

材料和方法

酵母菌株和模型蛋白构建

酵母菌株RSY1293(matα,乌拉3-1,图2-3-112,他的3-11,15,trp1-1型,ade2-1,加拿大1-100,第61秒：：HIS3，[pDQ1]）是R.Schekman（加州大学伯克利分校，加利福尼亚州伯克利分校）的礼物(皮隆等., 1997). pDQ1是YCplac111(LEU2欧洲标准)包含第61节除了密码子2-6被编码H的序列所取代之外6RS.此标记的Sec61p在功能上对应于野生型Sec61p(皮隆等., 1997). 在菌株VGY61中，pDQ1被YCPlac33取代(URA3欧洲标准化委员会)用同样的第61节基因，用于引入突变体第61秒使用适当的诱变引物和Vent聚合酶（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）在YCplac111中通过PCR产生(LEU2欧洲标准)使用5-氟代甲酸（5-FOA）进行质粒改组(戈德等., 2004). VGY61中断SSH1号机组如前所述(Goder公司等., 2004).

模型蛋白40[Leu16]（+5）、60[H1]（+1）和[Leu16]（-3）如前所述(戈德等., 2004). 模型蛋白在pRS426中表达(URA3 2μ)带有甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GPD）启动子。为了分析二肽基氨基肽酶B（DPAPB）的膜插入DAP2号机组经PCR扩增，融合到C末端三重血凝素（HA）表位标签上，并用GPD启动子克隆到pRS426中。表达细胞脉冲标记后，用小鼠单克隆抗HA抗体免疫沉淀DPAPB。使用兔抗CPY抗血清分析内源性羧肽酶Y（CPY）的易位。

标记和免疫沉淀

对于体内脉冲标记，将过夜酵母培养物稀释并培养至OD600～1.将相当于1.5 OD的细胞重新悬浮在200μl培养基中，在30°C下培养15分钟，并用100μCi/ml标记5分钟[35S] 蛋氨酸（英国白金汉郡Little Chalfont GE Healthcare）。在4°C下，向细胞补充10 mM叠氮化物，造粒，再悬浮在50 mM Tris中，pH 7.5，5 mM EDTA，1 mM苯甲基磺酰氟中，并在搅珠器中用玻璃珠溶解7 min，补充1%SDS，并在95°C下加热5 min。通过在微型离心机中离心10 min，去除细胞残留物，上清液用抗HA抗体进行免疫沉淀。用蛋白A-Sepharose（GE Healthcare）分离免疫复合物，并通过SDS-gel电泳和放射自显影术进行分析。使用磷光成像仪（GE Healthcare）对信号进行量化。为了进行脱糖基化，免疫复合物在50 mM柠檬酸钠、pH 6、1%十二烷基硫酸钠中煮沸，并与1 mU endo-β-D孵育-N个-乙酰氨基葡萄糖苷酶H在凝胶电泳前在37°C下放置1小时。

Sec61p稳定性分析

通过免疫印迹分析测定Sec61p的稳态水平，10 OD600用玻璃珠在SDS样品缓冲液中溶解相当于酵母细胞的样品，并煮沸10分钟。用SDS-gel电泳分离等量总蛋白的等分样品，在硝酸纤维素上印迹，并用兔抗血清修饰Sec61p的C末端，这是C。斯特林（曼彻斯特大学，曼彻斯特，英国；斯特林等., 1992). 使用辣根过氧化物酶结合的抗鼠二级抗体和增强化学发光试剂盒（GE Healthcare）检测抗体。基于单独凝胶的考马斯蓝染色，蛋白质负载量相等。

为了比较同时表达野生型和突变体Sec61p的细胞中的蛋白质水平，YTX57(matα,乌拉3-1,图2-3-112,他的3-11,15,trp1-1型,ade2-1,加拿大1-100)用YCplac111转化相应野生型菌株RSY1293(LEU2欧洲标准)含有Δplug（密码子52–74被甘氨酸取代）或ΔTM2第61秒突变体（密码子77–107的缺失），并进行上述免疫印迹分析。为了测试Sec61复合体过度表达的β和/或γ亚基的影响，将产生的菌株与YEplac195一起转化(URA3 2μ)包含SBH1型，YEplac112年(TRP1 2μ)包含SSS1型或两者，或使用pRS426(URA3 2μ)或YEplac112(TRP1 2μ)包含SBH1型和SSS1型分别由GPD启动子驱动。

为了确定Sec61p的半衰期，将表达野生型或突变型Sec61p细胞培养过夜，稀释至OD600=0.5，并在30°C下与100μg/ml环己酰亚胺孵育8 h。通过每2 h再添加50μg/ml来保持环己酰酮的封闭浓度。

增长分析

在系列稀释实验中，酵母菌株在YPDA培养基中以30°C至中对数相培养，并稀释至0.1 OD600将等分的五倍系列稀释液转移到YPDA平板上，加入或不加入0.3μg/ml衣霉素或4 mM二硫苏糖醇，并在15、30或39°C下培养。或者，液体培养物接种并在30°C和OD下培养600被测量为时间的函数。

序列比对与蛋白质结构建模

UniProt数据库中鉴定了76个Sec61p真核生物同源物（6.1版；贝罗奇等2005年)通过使用BLAST(阿尔特舒尔等., 1997)，并使用T_COFFEE生成多序列比对(Notredame公司等., 2000). 使用ScoreCons，使用默认PET91替代矩阵的Valdar01评分方案，对残留物保守性进行量化(瓦尔达尔，2002年).

酵母Sec61异源三聚体复合物的比较蛋白质结构模型是建立在M（M）.詹纳什基SecYEβ转座子(范登伯格等., 2004; PDB公司1赫兹)通过x射线晶体学以3.5Å分辨率求解。酵母Sec61靶点与M（M）.詹纳什基所有三条链（Sec61p、Sbh1p和Sss1p）的模板序列基于T_COFFEE生成的多重序列比对(Notredame公司等., 2000)使用10个中间同源序列。Sec61p、Sbh1p和Sss1p的酵母目标和古菌模板之间的序列一致性分别为37%、23%和31%。使用DeepView目视检查结构上下文中对齐插入和删除的位置(Guex和Peitsch，1997年). 针对路段Sec61p 54-57、140-149、201-239、318-333、403-412和469-480导出了备选路线，并使用SWISS-MODEL生成三维模型(施韦德等., 2003)和建模器(萨利和布伦德尔，1993年). Sec61p中的P200-E212和D227-N240段无法可靠建模，因此被排除在最终模型之外。使用Molscript生成图形表示(克劳利斯，1991年)，使用MSMS计算分子表面(桑纳等., 1996)，并使用Raster3D渲染组合图形对象(梅里特和培根，1997年).

结果

Sec61p插入域的中断或删除不会影响生存能力和增长

基于的实验结构M（M）.詹纳什基建立了酵母Sec61复合物的比较结构模型SecYEβtranslocon(图1). 在插入域中，突变R67E和R74E先前已被证明以符合正内侧规则的电荷效应的方式影响拓扑。这两个精氨酸在M（M）.詹纳什基SecY，但在接近Sec61p的R74对应位置处有一个精氨酸（SecY中的R66）。有趣的是，酵母模型中的R67和R74以及SecY的R66似乎正面临插入结构域下方的溶剂，这增加了它们的正电荷可能不会直接作用于信号序列，并且它们的突变可能通过干扰插入结构而起作用的可能性。为了验证这一假设，引入了预期会破坏塞子的特定突变。L63、L66和L70形成了塞子结构域的疏水核心，分别或组合被天冬酰胺取代，天冬酰胺较小且亲水，但不带电（L63N、L66N、L70N和LLLNNN）。此外，删除了L70（ΔL70），或者删除了塞子尖端的六个残基（残基67-72）或整个塞子域（残基52-74；在图1)被甘氨酸残基取代（分别为Δtip和Δplug）。

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酵母Sec61复合物的插入域。酵母Sec61复合物结构的立体表示，模拟了M（M）.詹纳什基SecYEβ转座子(范登伯格等., 2004)细胞溶质面朝上。该模型显示为带有插入结构域（残基52–74）的立体主干，该插入结构域被Δ插入突变体中的甘氨酸取代，显示为充满空间的轮廓。Sbh1p以红色显示，Sss1p以橙色显示，Sec61p从N到C末端以蓝色到黄色显示。模型中不存在Sec61p的P200-E212和D227-N240段。

野生型第61节在缺乏由Ssh1p、Sbh2p和Sss1p组成的第二个非必需转座子复合物的酵母细胞中，这些插入突变体被替换，因为SSH1号机组令人惊讶的是，产生的突变细胞都是活的，在任何温度下都没有生长缺陷(图2). 衣霉素的存在也没有生长差异，这会导致内质网中的蛋白质错误折叠，并增加逆行移位。因此，对于一般Sec61p功能来说，插入域不是必需的。

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插入域中的突变没有生长缺陷。（A） 测量液体培养物的生长曲线Δssh1表达野生型Sec61p或所指示的插入突变的细胞。（B）Δssh1将表达野生型Sec61p的细胞或缺乏整个插入域（Δplug）或TM2（ΔTM2）的突变体细胞以系列稀释液接种到YPDA平板上，并在15或39°C下培养3d，或接种到含有0.3μg/ml衣霉素的YPDA平板，并在30°C下孵育3d。

插入缺失影响信号定向和蛋白质转运

为了分析与信号定向有关的插入突变体，我们确定了它们对三种模型蛋白的影响，它们以混合定向插入，因此是拓扑发生变化的敏感报告者(戈德等., 2004). 构造[Leu16]（−3）(图3A） 有一个由16个连续亮氨酸组成的N端信号锚，具有正的N端和负的C端侧翼电荷[Δ（C–N）=−3，根据哈特曼等1989年]. 构造40[Leu16]（+5）和60[H1]（+1）分别具有内部信号锚和+5和+1的相反电荷差。由此产生的拓扑结构反映在糖基化模式中。添加两个或三个聚糖代表具有易位C末端的多肽。栓结构域中的所有突变导致糖基化[Leu16]（−3）减少约15%(图3以及糖基化40[Leu16]（+5）的类似增加。其作用与之前观察到的突变R67E和R74E的作用基本相同(戈德等., 2004). 这些结果表明，干扰塞结构相当于删除整个域。

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所有插入突变对模型蛋白的拓扑结构具有相同的影响。（A） 用于分析拓扑变化的诊断蛋白底物以深灰色（Leu16)或黑色（去唾液酸糖蛋白受体H1），侧翼电荷为+和−，糖基化位点为黑点。它们的名称表示信号前N末端亲水序列的长度，括号中的疏水信号核心（H1或Leu16），以及根据哈特曼等. (1989)括号中。（B） 这三种底物表达于Δssh1带有野生型、Δplug或ΔTM2 Sec61p、脉冲标记5分钟的电池[35S] 蛋氨酸，并通过免疫沉淀、SDS-gel电泳和放射自显影术进行分析。与含有零、一、二或三个聚糖的多肽相对应的形式用箭头表示。破折号表示37-kDa分子量标准的位置。（C） 所示Sec61p突变体对模型蛋白取向的影响通过荧光成像仪定量标记实验（如B所示）来确定。二倍和三倍糖基化物种共同代表具有易位C末端的多肽。它们占总数的比例（在60[H1]（+1）的情况下，不包括未糖基化的非整合产品）表示为与野生型值的偏差（以百分点为单位）。显示了单次测定（无误差条）或两到六次测量（SD平均值）的结果。带有野生型Sec61p的C-末端易位产物的绝对分数，[Leu16]（−3）为29.1%，40[Leu16（+5）为46.3%，60[H1]（+1）为60.2%。

由于60[H1]（+1）的N末端延伸包含一个糖基化位点，该结构还区分了具有易位N末端（一旦糖基化）的产物和根本没有整合到膜中的产物（未糖基化蛋白）。在含有野生型Sec61p的细胞中，5.3±1.4%（n=8）的产物未糖基化。塞子突变体产生的非整合水平略微增加，为～9%（Δ塞子；9.5±2.4%；n=4），表明存在轻微的插入缺陷。由于我们底物蛋白的信号锚的疏水性，它们很可能以共翻译的方式插入。对已建立的转座子共翻译底物DPAPB的分析同样揭示了在表达Δplug的细胞中产生一些未糖基化多肽(图4、A和B）。在将糖基化位点引入N-末端结构域后，它们仍保持未糖基化状态（我们未发表的数据），证实了插入缺陷而非反向整合。然而，CPY的翻译后易位受到塞子缺失的严重损害，因为几乎一半的产物仍然是未糖基化的前CPY(图4、A和B）。CPY易位缺陷也反映在这些细胞中成熟CPY稳态水平的降低(图4C） 。

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Sec61p突变的共翻译和翻译后整合缺陷。在Δ中分析了DPAPB作为共翻译底物和CPY作为Sec61转译子翻译后底物的整合ssh1型背景脉冲标记5分钟[35S] 蛋氨酸、免疫沉淀、凝胶电泳和放射自显影术（A）。不同的产物对应于DPAPB的糖基化（g）和非糖基化（u）形式，以及CPY的糖基化第一前体（p1）和非糖基化前体（pp）。作为对照，在用内糖苷酶H（EndoH）脱糖基后，分析来自表达野生型Sec61p（wt）的细胞的标记蛋白。未糖基化形式对应于未整合的多肽，并被量化为B中总多肽的一部分。在C中，通过免疫印迹分析测定成熟CPY（m）的稳态水平。在通道2-4中分析等量的细胞裂解物。

插入域连接跨膜段TM1和TM2。TM2是信号和停止转移序列横向离开转座子进入脂质膜的退出位点的一部分。信号序列已经交联到TM2和TM7，这导致了这些TM在转座子中形成信号结合位点的模型(普拉斯等., 1998). 有趣的是，之前有报道称，删除TM2（残基73-107）或TM3（残基108-143）后，Sec61p功能保留，但二者均未删除(威尔金森等., 2000). 我们确认了TM2缺失的这一发现。Sec61p缺乏残基77-107（ΔTM2）的细胞是有活力的，除了在39°C下，生长几乎与野生型一样好(图2B） ●●●●。此删除仅影响[Leu16]（−3）的拓扑结构(图3)产生一些未糖基化的DPAPB，并且CPY易位严重不足(图4). 根据转化细胞失去野生型的能力判断，插入结构域和TM2的联合缺失是致命的第61节质粒在5-FOA板上并通过四分体分析。

塞子缺失会损害易位子的稳定性

通过免疫印迹分析，与野生型相比，Δplug缺失的Sec61p稳态水平降低(图5A） ，但与ΔTM2类似（之前通过威尔金森等., 2000). 这可能是折叠效率降低和/或折叠蛋白质半衰期缩短的结果。为了估计半衰期，在用环己酰亚胺抑制新合成后测定Sec61p水平(图5B） ●●●●。尽管野生型蛋白质的半衰期为～2 h，但ΔTM2的消失速度是野生型蛋白质降解速度的两倍以上。相反，删除塞子结构域后，半衰期没有变化，这表明组装成转locon复合体后，Δ塞子与野生型Sec61p一样稳定。

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插头缺失会损害转座子水平。（A） 通过等量蛋白质的免疫印迹分析测定野生型和突变型Sec61p的稳定量。（B） 通过在存在翻译抑制剂环己酰亚胺的情况下培养0、1、2、4或8小时的细胞的免疫印迹分析，估计野生型Sec61p和Δplug和ΔTM2突变体的半衰期。显示了Δ插头和ΔTM2与野生型的类似启动信号。（C） Sec61p水平通过免疫印迹分析确定，细胞同时表达来自染色体的野生型Sec61p第61节基因和Δplug或ΔTM2突变体欧洲标准化委员会质粒（分别为wt/Δplug和wt/△TM2）。细胞不含额外的质粒（−），或含有SBH1型(+β),SSS1型（+γ），或两者（+β+γ）及其天然启动子，或2μ质粒第1页或SSS1型带有GPD启动子（分别为+β*和+γ*）。或者，用0.3μg/ml衣霉素（+Tun）培养细胞3小时，以诱导未折叠蛋白反应。作为对照，分析仅表达野生型Sec61p（泳道1、9、11、13和15）或Δplug或ΔTM2突变体（分别为泳道2和16）的细胞。第9-14道来自相同的免疫印迹。

之前已经观察到，ΔTM2突变体在存在野生型第61节也就是说，在杂合子情况下，几乎无法检测到(威尔金森等., 2000). 我们还发现，这就是插头删除的情况(图5C、 通道1–8），表明突变体与野生型Sec61p竞争限制成分。明显的候选基因分别是转座子复合物的β亚基和γ亚基Sbh1p和Sss1p。事实上，两者的表达SBH1型和不锈钢1来自2μ质粒或带有强GPD启动子的编码序列将Δplug和ΔTM2的稳态水平增加到可检测水平。这不是产生过多未组装亚单位限制蛋白质降解能力的间接影响，因为用衣霉素处理并没有挽救Δplug Sec61p（9–14巷），衣霉素会进一步增加ER相关降解的负荷。然而，增加SBH1型和SSS1型没有将Δ塞水平恢复到野生型Sec61p的水平，这表明它们不是唯一的限制成分。结果表明，插入结构域的缺失降低了Sec61p通过与伙伴蛋白（其中包括β和γ亚基）相互作用形成稳定转座子的能力。

讨论

令人意外的是，插入结构域的完全缺失在任何温度下都不会影响存活率或生长。即使塞域和铰链段的一级序列没有很好地保存，结构本身也很好地保持了。塞子似乎在空闲状态下将小孔封闭起来，不让小分子进入。在E类.大肠杆菌的综合致命性prlA3（SecY的插入域中的F67C）prlG3（S120C位于SecE周质末端）支持这一观点(花等., 1995;Harris和Silhavy，1999年)这是因为两个半胱氨酸之间形成了一个二硫键桥，将塞子锁定在了外部的永久打开状态。在酵母中，内质网离子泄漏的后果尚不清楚，因为主要的钙2+贮存物是液泡和高尔基体，钙的活性增加可以弥补渗漏2+ATP酶。此外，仅收缩环可能会阻断离子通道，在哺乳动物系统中有证据表明，管腔伴侣BiP可以替代性地封闭转座子(哈曼等., 1998;海格和约翰逊，2002年;阿尔德等., 2005).

塞结构域也被认为在多肽易位的易位通道门控中发挥作用。这一功能似乎不是必需的，但它的缺失可能是对模型蛋白质拓扑结构的影响的原因。塞子或塞子接口处的突变很可能通过干扰塞子与腔腔的配合来破坏转座子的闭合状态。与影响拓扑学的一般机制一致，所分析的所有插入突变，包括完全缺失，对信号定向具有类似的影响。此前，插头中的R67和R74被鉴定为有助于根据阳性内部规则定向信号(戈德等., 2004)它们在结构中的一般位置似乎与信号序列上的电荷效应兼容。由于干扰塞子的任何突变也会影响这些精氨酸的正确定位，因此无法从形式上区分拓扑效应是由于电位改变和/或转座子闭合状态的不稳定所致。

然而，由于突变转座子结构的灵活性增加，底物多肽的亲水部分可能更容易插入孔中、打开孔并通过，疏水片段可能更容易进入脂质双层。因此，多肽进入转座子的初始取向可能是有利的。对于构建物[Leu16]（−3）的N末端信号锚定物，有证据表明，在哺乳动物细胞中，它最初与N末端的转座子结合外显（exo）/C类细胞周期方向（胞质外N末端，胞质C末端），在其反转方向之前(戈德与间谍，2003年). 插入突变确实会导致N增加外显（exo）/C类细胞周期[Leu16]（−3）的产物(图3)与这一预期一致。由于没有关于内部信号最初如何进入转座子的实验数据，因此无法预测转座子灵活性增加对其集成的影响。

我们对Sec61p突变体稳定性的研究结果也指出了塞子的不同作用。在晶体结构所示的闭合状态下，转座子是一个紧密的螺旋束，由塞域从内部支撑和加固。相反，在活动状态下，它必须具有相当大的灵活性，因为跨膜螺旋移动以扩大中央收缩并侧向打开以允许接触脂质。插头移出时，会伴随甚至触发向打开状态的转换。删除塞子会降低Sec61p的稳态水平，但组装蛋白的半衰期不会降低。因此，这种删除不会使最终的转座子对退化更敏感。相反，折叠和异构化的效率似乎降低了。Δplug突变体在野生型Sec61p存在时基本上无法检测到，除非寡聚伴侣Sbh1p和/或Sss1p过度表达。没有插入结构域的Sec61p似乎与野生型蛋白质在限制性成分（其中包括β和γ亚基）方面竞争很差，并且很快被降解。同样，组装的无塞易位子的灵活性增加可能会损害与Sec62/63/71/72复合物的翻译后易位的关联，并解释CPY易位的缺陷。

毫不奇怪，TM2在结构上更剧烈的缺失对转座子组装和翻译后插入有类似且更严重的影响。据报道，ΔTM2和ΔTM3与Sec62复合物的结合减少，并产生对温度敏感的合成致命性第62–1秒(威尔金森等., 2000). 此外，组装的ΔTM2转座子的半衰期也有所缩短。

总之，Sec61p对突变具有惊人的抵抗力，因为它可以耐受整个跨膜片段（TM2或TM3；威尔金森等., 2000)或者整个插入结构域，或者许多保守的残基的突变(戈德等., 2004;程等., 2005)没有显著的生长缺陷。这些突变充分保留了转座子的基本功能，以提供穿过膜进入脂质双层的通道，并连接到核糖体和Sec62/63/71/72复合物，以靶向共翻译和翻译后底物。

致谢

我们感谢E.Hartmann博士、H.Riezman博士、K.Römisch博士、R.Schekman博士和C.Stirling博士提供的菌株和试剂；Lorenza Bordoli博士负责序列比对；和蒂埃里·施密德林批判性地阅读手稿。这项工作得到了瑞士国家科学基金会3100A0-109424/1号拨款的支持。

使用的缩写：

5-视野5-氟代甲酸
CPY公司羧肽酶Y
DPAPB公司二肽基氨基肽酶B
急诊室内质网
全球采购部甘油醛-3-磷酸脱氢酶

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E06-03-0200)2006年7月5日。

参考文献

  • Alder N.N.，Shen Y.，Brodsky J.L.，Hendershot L.M.，Johnson A.E.内质网Sec61转座子BiP介导门控的分子机制。《细胞生物学杂志》。2005;168:389–399. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Altschul S.F.、Madden T.L.、Schaffer A.A.、Zhang J.、Zhang Z.、Miller W.、Lipman D.J.Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序。核酸研究。1997;25:3389–3402. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bairoch A.等人，《通用蛋白质资源》（UniProt）核酸研究。2005;33：D154–D159。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cannon K.S.，Or E.，Clemons W.M.，Jr.，Shibata Y.，Rapoport T.A.SecY和易位多肽之间二硫桥的形成将易位孔定位在SecY的中心。《细胞生物学杂志》。2005;169:219–225. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cheng Z.，Jiang Y.，Mandon E.C.，Gilmore R.鉴定参与核糖体结合和共翻译易位的Sec61p细胞质残基。《细胞生物学杂志》。2005;168:67–77. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Denzer A.J.、Nabholz C.E.、Spiess M.信号锚蛋白的跨膜取向受折叠状态的影响，但不受氨基末端结构域的大小的影响。EMBO J。1995;14:6311–6317. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Eusebio A.、Friedberg T.、Spiess M.疏水结构域在ER膜内自然信号序列定向中的作用。实验细胞研究。1998;241:181–185.[公共医学][谷歌学者]
  • Flower A.M.、Osborne R.S.、Silhavy T.J.。prlA-prlG双突变体的等位基因特异性合成致死性预测SecY和SecE的相互作用域。EMBO J。1995;14:884–893. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Goder V.、Junne T.、Spiess M.Sec61p有助于根据正内侧规则确定信号序列方向。分子生物学。单元格。2004;15:1470–1478. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Goder V.，Spiess M.内质网中信号序列定向的分子机制。EMBO J。2003;22:3645–3653. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Guex N.、Peitsch M.C.SWISS-MODEL和SWISS-PdbViewer：比较蛋白质建模环境。电泳。1997;18:2714–2723.[公共医学][谷歌学者]
  • Haigh N.G.，Johnson A.E.BiP的一个新作用：在蛋白质整合到内质网膜中的过程中关闭水转运孔。《细胞生物学杂志》。2002;156:261–270. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hamman B.D.、Hendershot L.M.、Johnson A.E.BiP通过在易位前和易位早期封闭易位孔的腔端来维持内质网膜的通透性屏障。单元格。1998;92:747–758.[公共医学][谷歌学者]
  • Harley C.A.、Holt J.A.、Turner R.、Tipper D.J.酵母中的跨膜蛋白插入方向取决于跨膜片段之间的电荷差异、它们的总疏水性及其分布。生物学杂志。化学。1998;273:24963–24971.[公共医学][谷歌学者]
  • Harris C.R.、Silhavy T.J.通过使用合成表型和体内交联绘制SecY（PrlA）和SecE（PrlG）的界面。《细菌学杂志》。1999;181:3438–3444. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hartmann E.、Rapoport T.A.、Lodish H.F.预测真核生物跨膜蛋白的取向。程序。国家。阿卡德。科学。美国。1989;86:5786–5790. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Johnson A.E.、van Waes M.A.《转座子：内质网膜的动态网关》。每年。Rev.细胞发育生物学。1999;15:799–842.[公共医学][谷歌学者]
  • Kraulis P.J.MOLSCRIPT：一个生成蛋白质结构详细和示意图的程序。J.应用。结晶器。1991;24:936–950. [谷歌学者]
  • Merritt E.A.、Bacon D.J.Raster3D：真实感分子图形。方法酶制剂。1997;277：505–524。[公共医学][谷歌学者]
  • Notredame C.、Higgins D.G.、Heringa J.T-Coffee：快速准确多序列比对的新方法。分子生物学杂志。2000;302:205–217.[公共医学][谷歌学者]
  • Pilon M.、Schekman R.、Römisch K.Sec61p介导错误折叠的分泌蛋白从内质网向胞浆的输出以进行降解。EMBO J。1997;16:4540–4548. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Plath K.，Mothes W.，Wilkinson B.M.，Stirling C.J.，Rapoport T.A.，酵母ER膜翻译后蛋白质转运中的信号序列识别。单元格。1998;94:795–807.[公共医学][谷歌学者]
  • Rösch K.，Naeher D.，Laird V.，Goder V.，Spiess M.未带电氨基酸对内质网中信号序列定向的拓扑学贡献。生物学杂志。化学。2000;275:14916–14922.[公共医学][谷歌学者]
  • Sakaguchi M.、Tomiyoshi R.、Kuroiwa T.、Mihara K.、Omura T.信号和信号锚序列的功能由疏水段和N端电荷之间的平衡决定。程序。国家。阿卡德。科学。美国。1992;89:16–19. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sali A.，Blundell T.L.通过满足空间限制进行比较蛋白质建模。分子生物学杂志。1993;234:779–815.[公共医学][谷歌学者]
  • Sanner M.F.、Olson A.J.、Spehner J.C.简化表面：计算分子表面的有效方法。生物聚合物。1996;38:305–320.[公共医学][谷歌学者]
  • Schwede T.、Kopp J.、Guex N.、Peitsch M.C.SWISS-MODEL：自动化蛋白质同源建模服务器。核酸研究。2003;31:3381–3385. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stirling C.J.、Rothblatt J.、Hosobuchi M.、Deshaies R.、Schekman R.在将完整膜蛋白插入内质网时出现缺陷的蛋白质易位突变体。分子生物学。单元格。1992;三:129–142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tam P.C.、Maillard A.P.、Chan K.K.、Duong F.研究SecYEG易位通道的SecY堵塞运动。EMBO J。2005 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Valdar W.S.Scoring残留物保护。蛋白质。2002;48:227–241.[公共医学][谷歌学者]
  • van den Berg B.，Clemons W.M.，Jr.，Collinson I.，Modis Y.，Hartmann E.，Harrison S.C.，Rapoport T.A.蛋白质传导通道的X射线结构。自然。2004;427:36–44.[公共医学][谷歌学者]
  • von Heijne G.细菌内膜蛋白中带正电残基的分布与跨膜拓扑结构相关。EMBO J。1986;5:3021–3027. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • von Heijne G.信号肽。J.成员。生物。1990;115：195–201。[公共医学][谷歌学者]
  • Wahlberg J.M.，Spiess M.多个决定簇指导信号锚定蛋白的定向：疏水信号域的拓扑学作用。《细胞生物学杂志》。1997;137:555–562. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wilkinson B.M.、Tyson J.R.、Reid P.J.、Stirling C.J.酵母Sec61p内的不同结构域参与翻译后易位和蛋白质错位。生物学杂志。化学。2000;275:521–529.[公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会