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摩尔生物细胞。2006年9月；17(9): 3989–4001.
数字对象标识：10.1091/桶。E06-03-0239号
预防性维修识别码：项目经理1556381
PMID：16837550

Fab1磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶控制胞内受体的贩运但不沉默

托尔·埃里克·勒斯滕,* 利纳·M.W.·罗达尔,* 克鲁帕·帕蒂尼,* 卡米拉·恩格伦德,† 克里斯托斯·萨马科夫利斯,† 斯蒂芬·多夫,‡ 安德烈亚斯·布雷奇,*和哈拉尔德·斯坦马克通讯作者*
Jean Gruenberg，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

内吞受体通过含有磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns（3）P]的内体转运被认为会减弱其信号传导。在这里，我们证明PtdIns（3）P5-激酶Fab1/PIKfyve控制着细胞内吞受体的贩运，但不抑制其沉默。果蝇fab1突变体含有检测不到的磷脂酰肌醇3,5-二磷酸水平，细胞和器官尺寸显著增加，并在蛹期死亡。突变幼虫含有高度放大的多泡体和酸化无效的晚期内体。的克隆工厂1突变细胞积累Wingless和Notch，类似于缺乏Hrs、Vps25和Tsg101的细胞，后者是泛素化膜蛋白内体分选机制的组成部分。然而，鉴于小时,第25版、和tsg101型突变细胞克隆积累泛素化的货物，但情况并非如此工厂1突变体。即使内吞受体贩运在工厂1突变体、Notch、Wingless和Dpp信号不受影响。我们的结论是，尽管Fab1对内胚体功能很重要，但它并不需要受体沉默。这与Fab1在内吞受体运输的晚期发挥作用的可能性相一致，即在信号终止时。

简介

细胞生长、存活、增殖和分化受激活细胞表面同源受体的信号控制。重要的例子包括可溶性配体Wnt（及其果蝇属同源Wingless）和膜结合配体Delta，分别与受体细胞上的G蛋白偶联受体和Notch受体结合。在发育和正常生理过程中，配体及其受体的水平在时间和空间上受到严格控制(Sorkin和Von Zastrow，2002年;Gonzalez-Gaitan，2003年;皮迪尼和文森特，2003年;马球等。, 2004).

细胞表面的受体密度是信号反应的一个重要决定因素，有慢机制和快机制可降低受体水平。转录下调是一种缓慢而持久的机制，而翻译后修饰和/或内化是减少细胞表面功能受体数量的快速方法。许多受体（包括Notch和Wnt受体）的内化之后，它们从内体运输到溶酶体，在溶酶体中降解，导致细胞接收信号的能力暂时降低。使信号调节更加复杂的是，配体结合受体也可能从内胚层膜发出信号，并且它们从内胚体的信号输出可能不同于从质膜触发的输出(Ceresa和Schmid，2000年;Sorkin和Von Zastrow，2002年).

通过对干扰内吞运输的突变体的分析，强调了内吞途径在细胞信号传导中的关键作用。Hrs提供了这样一个例子，Hrs是一种将泛素化受体分类为多泡体（MVB）管腔内小泡的蛋白质，目的是在溶酶体中降解。果蝇小时数突变体显示受体在MVB中的分类受损，导致其在早期内体中积聚(劳埃德等。, 2002;Jekely和Rorth，2003年). 在高分辨率分光计突变体、Dpp（一种转化生长因子-β同源物）和表皮生长因子受体信号传导增强，可能是因为激活的受体在内体的限制膜中停留时间延长。同样e（电子）内体秒运动c（c）复合体第页需要用于吨转运（ESCRT）-I和-II、Tsg101和Vps25被认为在Hrs的下游发挥作用，由于Notch信号的增加，导致受体的内胚体堆积和肿瘤样的细胞非自主过度增殖(莫伯格等。, 2005;汤普森等。, 2005;Vaccari和Bilder，2005年). 这支持了适当的内吞交通具有重要的抗肿瘤功能的观点(巴赫等。, 2004;马球等。, 2004).

Hrs通过结合磷脂酰肌醇（PI）磷脂酰肌糖醇（PtdIns）3-磷酸[PtdIns（3）P]被招募到内体膜上，该磷酸是由III类PI 3-激酶磷酸化PtdIns形成的(赖堡等。, 2001). PtdIns（3）P特异性定位于内胚层膜(吉洛利等。, 2000)不仅招募Hrs，还招募其他一些含有FYVE或PX结构域的蛋白质(埃尔森等。, 2002;斯滕马克等。, 2002). 因此，III类PI 3-激酶和PtdIns（3）P是内吞运输、介导内体融合以及降解分选、再循环和逆行运输到生物合成途径的关键调节因子(Lindmo和Stenmark，2006年). PtdIns（3）P通过去磷酸化和溶酶体脂肪酶代谢(斯坦马克和吉洛利，2001年). 此外，该PI可以在肌醇头部的5位磷酸化，产生磷脂酰肌醇3,5-二磷酸[PtdIns（3,5）P2](鸽子等。, 1997;库克，2002年;伊夫等。, 2005). 催化这种磷酸化的激酶Fab1首先在酵母中被鉴定。酿酒酵母 工厂1突变体的液泡异常增大，并显示泛素化羧肽酶S向液泡腔的运输受损(奥多里齐等。, 1998). Fab1在进化上是保守的，据报道，哺乳动物Fab1同源物PIKfyve的激酶头突变体在培养细胞中的过度表达可抑制内吞标记物的液相转运，但不能再循环/降解内吞受体或对促甲状腺素D的分选(伊科诺莫夫等。, 2001,2003). 此外，在胰岛素刺激后，PIKfyve被PI3-激酶调节的蛋白激酶PKB磷酸化，并且PIKfy与含有胰岛素反应性氨基肽酶的囊泡的高运动性亚群共存(伯威克等。, 2004).

这些发现表明，Fab1/PIKfyve在控制特定的膜转运过程中发挥作用，但其在信号终止和多细胞生物生理学中的功能尚不清楚。为了解决这个问题，我们生成了果蝇fab1突变体，并研究其与生存、生长、膜运输和细胞信号转导相关的表型。我们发现果蝇属Fab1对发育和细胞体积控制至关重要，其失活导致Wingless和Notch的内胚体积累。值得注意的是，这种积累并没有伴随着信号的增加，这表明Fab1与Hrs和ESCRT-I和-II不同，不参与受体沉默。

材料和方法

分子生物学与转基因系的产生

pUASp-工厂1 P-通过克隆工厂1使用AscI/XbaI将cDNA（GH01668；Research Genetics，Huntsville，AL）导入pUASp(罗思等。, 1998). 这个P（P）-元素载体pCaSpeR4携带普遍表达的微管蛋白通过将来自pEGFP-C2（Clontech，Mountain View，CA）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）添加到NotI和XbaI位点来修改启动子(Basler和Struhl，1994年). 通过PCR从pGEX-4T1-Atg18中扩增出Atg18(鸽子等。, 2004)通过使用分别编码5′和3′XbaI和StuI位点的特异性引物，连接到XbaI/StuI消化的pCaSpeR4-EGFP中，生成pCaSpeR4-EGFP-Atg18（这里称为tGFP-Atg18）。质粒被注入w个1118用于转化的胚胎。在每种情况下，至少建立并测试了四条独立线路。基因突变工厂18,工厂121、和工厂131通过对每个病例中从纯合子突变基因组DNA扩增的至少两个重叠PCR产物进行测序，确定等位基因。可根据要求提供引物序列。为了生产抗体，在pMAL-C2（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）中制备了包含Fab1 N末端400残基的构建物，作为与麦芽糖结合蛋白（MBP）的C末端融合物。

果蝇种群与遗传学

果蝇属包括股票UAS-GFP-Rab5型,UAS-GFP-Rab7型,UAS-myc-GFP-2xFYVE公司(恩切夫等。, 2000),英国国防部(2R型)第30页(Mohr和Gelbart，2002年),nub-Gal4合金(卡列哈等。, 1996),高分辨率分光计28，UAS-hrp-Lamp1(劳埃德等。, 2002)，和无人机hrp wg(杜布瓦等。, 2001). 有关其他等位基因和平衡染色体的描述，请参阅FlyBasehttp://flybase.bio.indiana.edu/在25°C下进行杂交（除非另有规定），当hs-flp用作Flip重组酶源时，通过在37°C下对第一期（L1）和第二期（L2）幼虫进行热休克1小时来生成影像盘和卵巢克隆。

抗体生成

多克隆抗血清果蝇属Lamp1（CG3305）是通过向兔子注射一种由22个氨基酸组成的合成肽产生的，该合成肽对应于C端细胞质尾部SYLCARRRSTSRGYMSF。通过将纯化的细菌表达的MBP-Fab1融合蛋白注射到兔子体内，制备了针对Fab1 N端400氨基酸的多克隆抗血清。

免疫组织化学、葡聚糖摄取和显微镜检查

如前所述，在影像盘上进行葡聚糖和牛血清白蛋白（BSA）摄取实验(恩切夫等。, 2000). 使用以下抗体通过标准程序固定和染色成像椎间盘和卵巢：小鼠抗Notch（1:40）、Dl（1:20）、Cut（1:50）、Hindsight（1:40-果蝇属Lamp1（1:1000）、兔抗辣根过氧化物酶（HRP）（1:400）（Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）、亲和纯化兔抗Fab1（1:250）、大鼠抗Spalt（Sal；1:500）(De Celis和Barrio，2000年)，豚鼠抗Senseless（Sens；1:1000）(诺洛等。, 2000)，兔抗磷酸化母亲对抗Dpp（Mad；1:1000）(谷本等。, 2000)，豚鼠抗Hrs（Hrs；1:1000）(劳埃德等。, 2002)豚鼠抗眼病药（Eyg；1:1000）(奥尔达兹等。, 2003)，大鼠抗远距离（Dll；1:500）(瓦雄等。, 1992)，和小鼠抗多肽和单泛素（Affiniti Research Products，Exeter，英国）。Cy2-、Cy3-和Cy5-结合二级抗体（1:1000）来自Jackson ImmunoResearch Laboratories（宾夕法尼亚州西格罗夫）。使用Phalloidin（1:50）检测肌动蛋白，使用Toto-3（1:100）染色DNA，使用LysoTracker Red DND-99（1:200）检测酸性成分（均来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen）。使用蔡司LSM510 Meta显微镜记录共焦图像，并在配备徕卡DC480相机的徕卡MZ FLIII徕卡显微镜上获得成人结构的图像（Leica，Wetzlar，德国），并使用Adobe Photoshop 7.0版（加利福尼亚州山景城Adobe Systems）进行处理。使用Adobe Photoshop 7.0版在相同条件下获得的图像测量每个基因型的八只眼睛（4只动物）的小眼面积。

电子显微镜

根据以下方案制备用于常规塑料包埋的花环细胞和翼盘。在室温下，将细胞和组织固定在2%戊二醛中的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中1 h。在1%OsO中进行固定4和1.5%KFeCN（1小时），然后在4%乙酸铀酰中进行整块染色（30分钟），在分级酒精浓度下脱水，并用Epon 812包埋。在徕卡Ultracut上切割超薄切片，用1%柠檬酸铅复染，并在60–80 kV的Philips CM10中观察。表达HRP-Lamp或HRP-wg的眼盘中的底物反应如下。初始戊二醛固定后，在磷酸盐缓冲液中清洗磁盘，用5 mg/ml二氨基联苯胺（DAB）培养5分钟，然后用添加到H中的DAB培养45分钟2O（运行）2最终浓度为0.02%。清洗后，按照上述要求对样品进行进一步处理以进行固定。在4%甲醛和0.1%戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液中固定后，也制备翼片用于冷冻切片。将眼盘嵌入10%的明胶中，然后注入2.3 M蔗糖（1 h），安装在银针上，并在液氮中冷冻。在−110°C下获得超薄切片，用2.3 M蔗糖和2%甲基纤维素的1:1混合物进行采集。然后用2%甲基纤维素和0.4%乙酸铀酰包埋切片，并如上所述在显微镜下观察。

结果

果蝇含有功能性Fab1同源物，该同源物定位于内切体，对生存能力和细胞大小控制是必要的

一张单人床工厂1同源（CG6355，此处命名工厂1)在黑腹果蝇基因组。一个6千碱基（kb）cDNA克隆GH01668与基因组序列之间的序列比较显示了FlyBase联盟预测的九个外显子的基因结构(图1A） ●●●●。最长的开放阅读框编码一个含有1809个氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质具有保守的N末端FYVE结构域和C末端PtdIns（3）P 5-激酶（5K）结构域。

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果蝇fab1结构、等位基因、表型和GFP-Atg18向胞内结构募集失败工厂1突变体。（A） 代表果蝇fab1cDNA（外显子为黑色，内含子为白色）和预测的蛋白质结构，包括N末端FYVE结构域、伴侣蛋白样结构域和C末端激酶结构域。带有相关数字的垂直条表示导致相应等位基因中提前终止密码子的点突变的位置，工厂18（Q1308停止），工厂131（L1321停止），以及工厂121（Q1521停止）。互补表显示工厂1在一个小的，英国国防部(2R型)周30和更大的缺陷，英国国防部(2R型)氯化铅7亿这两者都揭示了工厂1轨迹。指出了各转基因组合的致死期。pa，法拉特成虫；wL3，游走L3幼虫；nd，未确定。（B）工厂1突变的法利特成虫和解剖的腿比处于类似发育阶段的对照动物大（蛹的腹侧和背侧视图用箭头表示身长）。（C和D）头部和眼睛显示头部主要由以下部分组成的动物的组织过度生长工厂1突变细胞（眼睛中的突变细胞缺乏红色色素；参见材料和方法). 小眼的平均大小是年的1.25倍工厂1突变眼（n=828眼小眼，8眼）比对照眼（n=952，8只眼）。（E–E〃）共聚焦图像，在L3幼虫的未固定视盘中，可以看到GFP-Atg18的募集到点状结构（箭头）以及用LysoTracker标记的晚期内体和溶酶体（箭头）。（F–F〃）标记有20分钟TRD在固定眼成像盘中摄取的顶端内体共焦图像。请注意，TRD单独（星号，可能代表早期内体）或GFP-Atg18（箭头）可以看到结构。一些结构仅用GFP-Atg18标记（箭头）。（G–G〃和H–H〃）共聚焦图像概述，在共聚焦图像中，可以在对照组和工厂1变异眼盘。虽然可以清楚地看到GFP-Atg18集中在控制盘的亚细胞结构上，但在突变组织中没有发现这种亚细胞积累；在对照动物中，12.6±3.6%的GFP-Atg18结构也被标记为TRD（n=583个内体，5个眼影像盘），而在对照动物体内没有观察到GFP-Atg 18结构（0%）工厂1突变盘（n=303个内体，5个眼影像盘）。（一） 动画展示了通过PI 3-激酶（PI3K）将PtdIns转化为PtdIn（3）P以及随后转化为PddIns（3,5）P2由Fab1制作。FYVE结构域和酵母蛋白Atg18可以特异性地结合PtdIns（3）P或PtdIns（3,5）P2分别用作体内检测这些脂质的探针。棒材，1μ（C–E）和2μ（F–H）。基因型为工厂131/英国国防部(2R型)周30和+/英国国防部(2R型)周30（B） ，yw公司,ey-flp型,GMR-LacZ/Y公司;FRT42D型,第页[迷你-w]，我(2)11氯/FRT42D型,工厂121,yw公司,ey-flp型,GMR-LacZ公司/Y（Y）;FRT42D型,第页[迷你-w]，我(2)11氯/+（C和D中的突变体和对照头），w个1118; tGFP-Atg18/+（E–G），以及工厂131/英国国防部(2R型)周30; tGFP-Atg18/+（H）。

四个甲基磺酸乙酯诱导的单一互补组等位基因在工厂1细胞学位置54F的区域，被一个小缺陷覆盖，国防部(2R型)周30(英格兰人等。, 1999). 三个等位基因的基因组测序我(2)SJB公司8,我(2)三交所21、和我(2)三交所31发现了无意义的突变工厂1编码区，导致预测的截短蛋白质缺乏功能性激酶结构域(图1A） ●●●●。三个等位基因中任意一个的杂合子英国国防部(2R型)周30或英国国防部(2R型)氯化铅7亿，这两者都删除了工厂1基因座，在孵化过程中作为晚期蛹或罕见的法老成虫死亡(图1、A和B）。此外我(2)三交所8/我(2)三交所21,我(2)三交所8/我(2)三交所31，或我(2)SJB公司31/我(2)三交所21与的相同我(2)三交所8,我(2)三交所21，或我(2)三交所31结束英国国防部(2R型)周30表明它们都代表零或接近零的等位基因(图1A） ●●●●。我们在下文中提及工厂1等位基因as工厂18,工厂121、和工厂131分别是。

我们注意到工厂1尽管如此，蛹还是比对照动物大工厂1幼虫没有表现出延长的幼虫期(图1B） 。在比较工厂1从蛹中分离出的纯合子为野生型蛹。这些腿的长度是正确的，但比对照动物的腿要粗得多。损失工厂1可以自主导致组织特异性过度生长，因为马赛克成虫(新闻社等。, 2000)头部主要包括工厂1突变细胞存活，头部和眼睛明显增大(图1、C和D）。幼虫组织中的过度生长表型也不同工厂1突变体。与野生型相比，唾液腺、肠道组织、脑叶和影像盘看起来更大、肿胀（我们未发表的数据）。

为了确定Fab1是否是产生PtdIns（3,5）P的负责激酶2在内胚体结构方面，我们利用了酵母绿色荧光蛋白（GFP）-Atg18/Svp1融合蛋白可以作为体内探针检测PtdIns（3,5）P2内体上的脂类(鸽子等。, 2004). 在表达GFP-Atg18的转基因果蝇中，在普遍表达的微管蛋白启动子的控制下，优先在眼成像盘细胞的顶端细胞质中观察到点状结构(图1，E–G）。LysoTracker观察到部分共定位(图1E） 标记晚期酸性内体和溶酶体，内体标记内化的德克萨斯红右旋糖酐（TRD）(图1，F和G），证明GFP-Atg18可以在晚期酸性内体结构上发现。与之前的报告类似工厂1酵母突变体，GFP-Atg18的点状定位在工厂1突变细胞，而是广泛出现在细胞质中(图1H） ●●●●。因此，Fab1似乎是唯一产生PtdIns（3,5）P的激酶2关于内胚体膜(图1一） ●●●●。

为了检测内源性Fab1，我们产生了针对重组Fab1 N末端部分的多克隆抗体。从流浪L3对照动物分离的Garland细胞中标记出明显的点状结构，而在英国国防部(2R型)w个30/英国国防部(2R型)氯化铅7亿幼虫，证明抗体的特异性(图2、A和B）。我们使用抗体来确定Fab1相对于翼想象盘和Garland细胞内吞机制标记的亚细胞定位。在Garland细胞内化5分钟后，Fab1与液相标记物俄勒冈州绿右旋糖酐（OGD）几乎没有共定位(图2C） ，而在40分钟追逐后有显著的共定位(图2D） ●●●●。此外，Fab1与早期（GFP-Rab5；图2E） 晚期内体（GFP-Rab7；图2H） ●●●●。有趣的是，在Fab1和Hrs之间只观察到有限的共定位，但仍然接近(图1F） 以及PtdIns（3）P（GFP-2xFYVE）专用探针；图1G） ，可能反映了PtdIns（3）P在内胚层膜子集上的快速转换(吉洛利等。, 2000;劳埃德等。, 2002;武赫尔芬尼希等。, 2003). 这一发现与Fab1在哺乳动物细胞中的分布相一致，其中Fab1、Hrs和PtdIns（3）P出现在内胚层膜的不同微域上(卡贝萨斯等。, 2006). 仔细检查未固定工厂1突变的Garland细胞显示，这些细胞的直径是正常细胞的3倍(图2一） ●●●●。翼盘上皮的影像学研究工厂1突变幼虫表明，整体细胞极性完整，而细胞较大，相对于野生型翼盘，细胞核分布紊乱(图2、J和K）。再加上增加的器官大小工厂1突变体(图1，B–D），这表明Fab1对细胞大小起负控制作用，但对上皮极化不需要。

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Fab1亚细胞定位及其对溶酶体酸度的影响。（A和B）Fab1的点状亚细胞染色在来自L3游荡对照动物的分离Garland细胞中观察到，但来自L3的未观察到英国国防部(2R型)周30/英国国防部(2R型)氯化铅7亿缺少工厂1基因组区域。虚线表示细胞膜。（C和D）OGD内化于Garland细胞5 min，0（C）和40 min（D）后用Fab1进行免疫定位。40分钟后，当OGD主要标记晚期内体/溶酶体时，Fab1与OGD广泛重叠。（E–H）在翼想象盘上皮细胞的共焦切片中，早期的GFP-Rab5和晚期的GFP-Rab7也观察到广泛重叠，但Fab1似乎与GFP-2xFYVE和Hrs在分类内体/晚期内体时相似，而不是在同一区域。（一） LysoTracker发射强度是对细胞内晚期内体和溶酶体酸度的测量。图片显示的是在相同的共焦扫描设置下拍摄的突变动物的Garland细胞，与对照组相比，其平均酸度显著降低。（J和K）在翅膀想象盘上皮的光学Z切片中，与对照相比，在突变组织中可以观察到TOTO-3标记的细胞核之间有更多的空间和不规则组织。肌动蛋白聚集的顶端粘连连接的组织和含有大圆盘（Dlg）的基底部稍局限的隔膜连接似乎正常。棒材，5μm（A和B）、2μm（C和D）、1μm（E–H）、50μm（I）和5μm。基因型为w个1118（A、C、D、F、I和J），w个1118/+;ptc-镀锌4/UAS-GFP-Rab5型（E） ，w个1118/+;ptc-镀锌4/UAS-myc-GFP-dbFYVE公司（G） ，w个1118/+;ptc-镀锌4/UAS-GFP-Rab7型（H） 、和工厂131/英国国防部(2R型)周30（I和K）。

Fab1对于内体酸化和有效的液相运输到溶酶体是必要的

与酵母和哺乳动物的研究结果类似工厂1突变细胞(奥多里齐等。, 1998;伊科诺莫夫等。, 2001)，我们发现在工厂1突变Garland细胞(图2一） ●●●●。为了研究Fab1在液相转运中的作用，研究了荧光标记的内化葡聚糖在游走三龄Garland细胞中的转运。在对照细胞中摄取5分钟后，在靠近质膜的明显点状内吞结构中观察到OGD(图2C和​和3A）。三A） ●●●●。追踪40分钟后，OGD的主要部分到达了标记有pH-敏感活性染料LysoTracker的更中央的溶酶体隔室(图3B） 。OGD主要停留在细胞的外围，未能被转运到细胞的弱酸性隔室工厂1突变细胞，表明向溶酶体的液相转运失败(图3、C和D）。这与激酶头PIKfyve突变的过度表达抑制人类胚胎肾细胞内吞HRP的溶酶体转运的发现一致(伊科诺莫夫等。, 2003).

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年前溶酶体隔间内改变的液相运输和货物堆积工厂1突变体。（A和B）OGD在摄取5分钟后积聚在小的外周小泡中，并在40分钟的追逐期后到达晚期内胚体/溶酶体室（箭头所示）。（C和D）输入工厂1相比之下，突变体OGD在追逐后未能到达酸化的隔室（注意，红色通道的探测器增益增加，以允许在工厂131/英国国防部(2R型)周30单元格）。（E–J）对照（E–G）和工厂1（H–J）花环细胞。（E和H）低倍镜显示对照细胞中正常大小的内体，以及fab1细胞中大大放大的内体（两张显微照片中的箭头）。为了进一步描述内吞途径，我们用BSA-Gold（所有显微照片中的箭头）培养细胞，持续培养40分钟。（F和G）在对照细胞中，我们在内胚体结构和溶酶体室中观察到BSA-gold（F和G放大插图中的箭头）。（一） 在工厂1突变体，BSA-gold定位于显著增大的内体，在致密溶酶体结构中未观察到。请注意，仅描述了内体的一部分。（J） I中方框区域的放大图显示了与内体致密物质相关的金颗粒。n、 细胞核；e、 内体；和l，溶酶体。棒材，2μm（A–D）、1μm（E和H）、100 nm（F）和200 nm（G和I）。基因型为w个1118（A、B和E–G）和工厂131/英国国防部(2R型)第30页（C、D和H–J）。

研究金标BSA的液相摄取，通过电子显微镜（EM）显示内吞途径，发现对照细胞摄取40分钟后溶酶体中存在内吞示踪剂(图3，E–G）。在工厂1突变细胞(图3（H和I），金颗粒积聚在大大增大的内体中（与荧光显微镜一致），而大多数溶酶体缺乏金示踪剂。我们得出的结论是，与酵母和哺乳动物细胞的情况类似，Fab1是溶酶体酸化所必需的果蝇属这种酸化失败也适用于Rab7-阳性MVB（我们未公布的数据）。有趣的是，在高分辨率分光计突变Garland细胞(劳埃德等。, 2002)，但在这些细胞中，液相示踪剂向溶酶体的运输是完整的（我们未发表的数据）。EM观察到的内吞液相示踪剂未能进入电子致密结构，免疫荧光观察到的LysoTracker阳性结构表明内吞物质未能到达溶酶体，或内吞体未能成熟进入功能性降解室。

fab1突变细胞显示受体的内体积累而泛素的内体积聚

由于内吞贩运和信号传递之间的拟议关系(劳埃德等。, 2002;Gonzalez-Gaitan，2003年;皮迪尼和文森特，2003年)，我们询问在工厂1变异的极化上皮组织。受体Notch（N）和PVR以及配体Wingless（Wg）、Delta（Dl）和Boss积聚在点状内部结构中，特别是在工厂1FLP/FRT技术产生的突变细胞(Golic，1991年;Xu和Rubin，1993年)或在从工厂1突变体(图4A–F、K和L；我们未发布的数据）。重要的是，与高分辨率分光计和第25版突变体细胞，显示泛素阳性结构的显著积累(Jekely和Rorth，2003年;杰克利等。, 2005;汤普森等。, 2005) (图4M） ，工厂1与相邻的对照细胞相比，突变细胞没有积累任何更高的泛素水平(图4N） ●●●●。配体和受体的强蓄积，但泛素在工厂1突变体表明与tsg101型,第25版、和小时突变体，其中泛素化货物保留在早期Rab5/PtdIns（3）P阳性内体中(Jekely和Rorth，2003年;莫伯格等。, 2005;汤普森等。, 2005;Vaccari和Bilder，2005年).

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细胞内受体和配体的自主积累工厂1突变体。（A–C和I）Wg表达于翼囊和凹槽中的细胞中央条纹中，并在邻近细胞中被吸收，在距源20μm的胞内小泡中可以观察到（I，50个共焦叠加的投影，相距1μm）。（D、E、G、H和J）英寸工厂1突变的翼盘，可以在扩大的细胞内小泡中看到Wg积聚，无论是在翼囊中还是在距源40μm处可见的凹槽中（J，像I中的投影）。这种堆积物在全长表达后被特意保存在翼囊中工厂1在翼袋下面节点-Gal4对照组（G和G′），而非空白组（H）。（F） Wg的细胞自主积累见于工厂1克隆（虚线），标记为不存在GFP，位于Wg生产源之外（插图中显示了概述）。（K） 细胞内小泡中也可见类似的Notch积聚工厂1形态发生沟（箭头）后面眼盘的突变细胞。（五十） Notch配体Delta（Dl）在工厂1毛囊细胞突变。（M和N）泛素化蛋白在高分辨率分光计但不在工厂1翼盘中的突变克隆（用虚线勾勒）。棒材，10μm（A、B、D、E、G和H）和50μm（I和J）。基因型为w个1118（A–C和I），工厂131/英国国防部(2R型)周30（D、E和J），工厂131,nub-Gal4合金/英国国防部(2R型)周30;第页[迷你-w,UAS工厂1]/+（G和H），yw公司,热休克蛋白70-flp/+;FRT42D型,第页[迷你-w,ubi-GFP公司]/FRT42D型,工厂121（F、K、L和N），以及yw公司,热休克蛋白70-flp/+;FRT40A型,第页[迷你-w,ubi-GFP蛋白]/FRT40A型,高分辨率分光计28天（M） ●●●●。

fab1突变细胞含有巨MVB，并在晚期内切体中积累受体和配体

描述贩运/退化缺陷工厂1突变体，我们跟踪Wg的贩运和Wg受体细胞的降解。Wg是由翼囊中的中央条纹细胞分泌到细胞外空间，并作为一种形态原控制翼缘的规格和生长。在翼盘的接收细胞中，Wg被Arrow/Frizzled2受体复合物带入细胞并降解(皮迪尼等。, 2005). 通过免疫定位，在离翅囊和窝源20μm处的受体细胞内识别出0.5至1μm大小的内吞结构中的细胞内Wg(图4A–C和I）。离体翼型影像盘Wg的检测工厂1突变体显示，在离翼囊中产生细胞源40μm的内囊泡中有显著的Wg积累(图4、D、E和J）。异常的Wg积聚是由于Fab1的缺乏引起的，因为全长Fab1特异性地表达于工厂1突变体动物显示翅膀囊中的缺陷几乎完全修复(图4G） 。Wg在接受细胞中的选择性积累表明生物合成途径在工厂1突变细胞。此外，Wg在工厂1突变细胞而不是杂合细胞或野生型双点细胞，它们与信号源的距离相似，这表明Wg蛋白的过量存在于工厂1接收细胞内吞运输缺陷产生的细胞(图4F） ●●●●。

共聚焦Z截面的比较显示，尽管在两种细胞的接收细胞的顶部和底部都可以观察到0.5至1.5μm的小泡工厂1突变体和控制翼盘，较大的含Wg结构（直径高达2-5μm）位于核周区域的更远位置（我们的未发表数据）。类似于控制细胞(图5在Hrs-和2xFYVE（dbFYVE-）阳性早期内体中以及在Rab7-阳性内体中观察到Wg工厂1突变组织(图5、B、D和F）。这些内体的直径似乎是对照细胞的1.5到2倍，有些内体的管腔中含有Wg，这强烈表明MVB可以在工厂1突变体和Wg可以被分类到它们的内囊泡。在对照细胞中，在GFP-Rab7–和GFP-2xFYVE–阴性的细胞内隔室中很少观察到Wg，这表明它在运输到后期溶酶体结构后迅速降解(图5、C和E）。较大的2-至5-μm Wg-阳性囊泡工厂1用抗晚期内体/溶酶体标记Lamp1的抗体标记突变细胞，并含有HRP-Lamp1转基因融合蛋白(图5、H和I）。这表明，虽然Wg在工厂1突变体，其降解被抑制。

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受体和配体在晚期扩大的内体结构中积累工厂1突变体。在对照组和工厂1变异的翼盘。（A–D）单个共聚焦切片和单独的扩大通道显示Wg在扩大的Hrs-阳性早期内体和Rab7-阳性MVB的内腔中的定位工厂1变异的翼盘。（E和F）Wg在对照细胞和突变细胞中与2xFYVE共定位（箭头）。在突变的椎间盘（箭头）中，一个额外的大Wg囊泡池非常突出。（G和H）突变组织中最大的Wg阳性结构（2-5μm）与人Lamp1-HRP融合蛋白的管腔HRP部分共定位，而对照组织中Wg和HRP-Lamp1之间几乎没有重叠。（一） 内源性Lamp1在含有Lamp1阳性内体的大Wg的限制膜上的点状结构中被检测到。（J） 与Wg一样，含有2至5μm大小缺口（N）的大结构中含有Lamp1，该结构似乎是工厂1突变克隆（−/−），而杂合对照细胞（+/-）几乎没有重叠。（K） 大型含缺口结构与TRD共定位。（L和M）在dpp-Gal4控制下，对表达HRP-Wg的翼盘中的Wg和HRP表位进行免疫检测（左侧概述，右侧有重叠和分离通道的放大），显示Wg和HRP在大结构中广泛共定位，在突变组织中，许多细胞直径远离来源。在对照组织中，HRP主要在小结构中单独检测。基因型为w个1118（A） ，工厂131/英国国防部(2R型)第30页（B、I和K），w个1118;pUAS-GFP-Rab7型;dpp-镀锌4/+（C），工厂131/英国国防部(2R型)周30,pUAS-GFP-Rab7型;dpp-镀锌4/+（D），w个1118;pUAS-myc-GFP-dbFYVE公司/+;dpp-镀锌4/+（E） ，工厂131/英国国防部(2R型)周30,无人机-无人机-myc-GFP-dbFYVE;dpp-镀锌4/+（F）中，w个1118,dpp-镀锌4/UAS-hrp-灯1（G） ，w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)第30页;dpp-镀锌4/UAS-hrp-灯1（H） ，yw公司,热休克蛋白70-flp/+;FRT42D型,第页[迷你-w,ubi-GFP公司]/FRT42D型,工厂121（J） ，w个1118/+;dpp-镀锌4/无人机hrp-Wg（五十） 、和w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)周30;dpp-镀锌4/无人机hrp Wg（M） ●●●●。棒材，5μm（A–H和K）、2μm（I和J）和1μm（L和m）。

与Wg相似，Notch也出现在中度增大的Hrs-阳性结构中工厂1突变细胞（我们尚未公布的数据）。含有Notch的大囊泡也显示出Lamp1免疫反应性，这为它们代表晚期内体提供了证据(图5J） ●●●●。为了验证积聚Notch的扩大结构确实是内吞中间体，我们在工厂1通过10分钟摄取TRD，然后进行40分钟的追逐期，突变体眼盘。TRD在大（2-5μm）结构中积累，经常与Notch重叠，表明许多含有Notch的大囊泡是内吞的(图5K） ●●●●。这些结果表明，Fab1需要建立或维持适当大小的内胚体小泡，并用于降解Wg和Notch，但不用于将这些蛋白质运输到晚期内胚体。

为了进行更详细的分析，我们使用dpp-Gal4驱动程序，将Wg和Lamp1与HRP垂直地表达为翼盘内内源性Wg表达模式。融合蛋白的HRP部分对溶酶体降解具有相对较高的抗性，这使得HRP信号可以在内源性Wg被有效降解的接收细胞的晚期内吞隔室中检测到，从而可视化整个内溶酶体系统(杜布瓦等。, 2001). 事实上，在对照翼盘中，HRP的免疫定位可以在许多缺乏Wg的结构中检测到(图5五十） ●●●●。相反，在工厂1在接收细胞中可以检测到充满HRP和Wg的突变圆盘，大结构，高达5μm。这表明内溶酶体Wg降解在工厂1突变组织(图5M） ●●●●。

HRP-Lamp1和HRP-Wg融合蛋白的HRP部分在固定组织中具有酶功能，允许二氨基联苯胺底物转化为黑色沉淀后通过EM原位检测(塞夫里奥科夫等。1999年;杜布瓦等。, 2001). 与之前的调查结果一致(塞夫里奥科夫等。, 1999)，我们通过EM检测MVB中的HRP-Lamp1融合(图6、A和B）。管腔内小泡中含有HRP-Lamp1的正常大小和增大的MVB在工厂1突变体组织，显示腔内小泡的形成依赖于心率(劳埃德等。, 2002)不需要Fab1功能(图6，C–F）。尽管对照细胞中的MVB通常为0.5–1μm，但HRP-Lamp1阳性结构在工厂1突变细胞为1～5μm。这些较大的MVB可能对应于共焦显微镜观察到的Lamp1/Wg/Notch结构(图5，I–K）。对表达HRP-Wg的细胞的研究表明，野生型幼虫正常大小的内体中含有丰富的HRP(图6、G和H）以及工厂1突变体(图6、I和J）。在这两种情况下，均在限制膜和腔内小泡上发现标记。因此，HRP-Wg和HRP-Amp1都通过EM标记了相似的MVBs和晚期内吞区室。这些结果表明，在野生型和工厂1翼盘。

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贩运和分类HRP-Lamp1和HRP-Wg工厂1突变体。电子显微镜显示在dpp-Gal4控制下表达的酶转化HRP-Lamp1和HRP-Wg在翼盘上皮内的定位。（A和B）HRP-Lamp1位于控制翼盘中的典型MVB中（A中的箭头）。（C和D）输入工厂1突变圆盘，HRP-Lamp1积聚在形态可变的较大囊泡（C中的箭头）中。一些具有大小不等的不规则腔内小泡（D中的箭头），而另一些似乎具有更规则的多泡形态（D中箭头）。（E和F）野生型（E）和工厂1突变细胞（F）在冷冻切片制备的组织中变得更加明显。（G和H）在控制翼盘中，HRP-Wg主要在200至600 nm直径范围内的MVB中观察到（我们未公布的数据）。（I和J）英寸工厂1突变圆盘，HRP-Wg积聚在更大的囊泡内，表明配体从限制膜上发生了分选。基因型为dpp-镀锌4/无人机hrp放大器1（A和B），w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)周30;dpp-镀锌4/无人机hrp放大器1（C和D），w个1118（E） ，工厂131/英国国防部(2R型)周30（F） ，w个1118;dpp-镀锌4/无人机hrp-Wg（G和H），以及w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)周30;dpp-镀锌4/无人机hrp-Wg（I和J）。

fab1突变克隆的Wg、Dpp和Notch信号正常

先前的研究表明，Hrs和ESCRT蛋白分别需要沉默Dpp和Notch信号(Jekely和Rorth，2003年;莫伯格等。, 2005;汤普森等。, 2005;Vaccari和Bilder，2005年)，而Wg信号传导在高分辨率分光计突变体(皮迪尼等。, 2005). 观察到Wg和Notch贩运在工厂1因此，我们询问受损的内吞运输是否与增强的受体信号有关。翼囊中Wg的表达在远离来源的嵌套模式中以不同的信号阈值激活目标基因，并提供信号活动的敏感读数（如图所示图7一） ●●●●。镶嵌或整体调查工厂1突变动物在高阈值靶基因Senseless（Sens）、Cut和Hindsight（Hnt）或低阈值靶基因Distalless（Dll）的表达上没有可测量的缺陷(图7，A–K）。这证明Wg信号在工厂1突变体。

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Wg靶基因激活工厂1和高分辨率分光计突变细胞。在花叶病或突变动物中评估Wg信号在不同阈值（总结在I中）激活的靶基因表达。（A–H和K）在工厂1突变细胞与对照细胞比较。（J） 与之前报道的一样(皮迪尼等。, 2005),高分辨率分光计突变细胞显示正常的Dll水平。基因型为w个1118（A–D），工厂18/国防部(2R型)周30（E–H），hsflp/+；FRT40A、Ubi-GFP/FRT40A、，高分辨率分光计28天（J） 和hsflp/+；FRT42D、Ubi-GFP/FRT42D、，工厂131（K） ●●●●。

在高分辨率分光计突变细胞，Dpp受体Thickvein积聚在早期泛素阳性内体中。这与卵巢的翼囊和卵泡细胞中Dpp信号活性增加有关(Jekely和Rorth，2003年). 相反，我们没有检测到低水平Dpp靶基因Spalt（Sal）在工厂1翅囊克隆，也不是磷酸化母亲对Dpp（p-Mad）的克隆工厂1卵泡细胞的克隆(图8，A–F）。这表明Dpp信号在工厂1突变体。

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Dpp和Notch靶基因激活工厂1突变细胞。（A和B）野生型卵泡细胞中Dpp激活的核磷酸化pMAD（箭头，光学Z截面；B）的两个细胞行的范围。（C和D）pMAD激活范围在工厂1突变卵室（箭头，光学Z截面；D）。（E和F）对于剥落（Sal）以梯度激活，以响应翼囊中的Dpp信号（E中的方框在F中放大）。（G） Notch靶点Eyg在工厂1眼盘中的突变克隆。基因型为w个1118（A和B），hsflp/+；FRT42D、Ubi-GFP/FRT42D、，工厂131（C–F）和hsflp/+；FRT42D、Ubi-GFP/FRT42D、，工厂121（G） 。

在tsg101型或第25版突变细胞、Notch和Dl在早期内吞室积聚，导致异位Notch信号传导。在眼盘克隆中，这导致下游靶基因的直接转录激活，未成对的和眼睁睁的(眼睛) (Jekely和Rorth，2003年;莫伯格等。, 2005;汤普森等。, 2005;Vaccari和Bilder，2005年). 未观察到Eyg的异位表达工厂1眼盘中的突变克隆(图8G） 这表明，尽管Dl和Notch在内体中大量积累，但Notch信号在正确的空间和时间继续存在。

在翼盘中，短程Notch信号在定义背腹侧边界组织者方面具有指导意义。一个直接的下游结果是沿着边界的细胞条纹中Wg的表达。因此，Wg的表达也可作为翼囊中Notch信号活动的标记(文森特和杜布瓦，2002年). 尽管Wg条纹在工厂1突变盘，这显然是由于内吞小泡中Wg的积累，而不是由于产生Wg的细胞面积更大，这很容易被识别，因为生物合成途径中存在大量Wg（我们的未发表数据）。此外，敏感的Notch-controlled鬃毛模式和皮肤角质层的感觉器官细胞规格没有缺陷工厂1观察到突变体(图1、B和C）。这支持以下结论：Notch信号在工厂1突变体。总之，上述结果表明，Wg、Dpp和Notch信号传导在工厂1突变细胞。因此，Fab1不具备Hrs、ESCRT-I和-II介导受体沉默的能力。

讨论

PI激酶在细胞生物学和生理学中具有重要功能，是抗肿瘤和自身免疫疾病药物的诱人靶点(罗等。, 2003;Murthy和De Camilli，2003年). 然而，PtdIns（3）P5-激酶在多细胞生物中的功能尚未被研究。在本研究中，我们确定Fab1是一种重要的PtdIns（3）P5-激酶果蝇属具有深厚的膜交通功能。虽然Fab1在内吞膜稳态中的重要性之前已经被酵母和哺乳动物细胞培养的研究所强调(奥多里齐等。, 1998;伊科诺莫夫等。, 2001,2003;博南基里诺等。, 2002)，其未能介导受体沉默是意料之外的。我们的数据将Fab1放在Hrs和ESCRT-I和-II的下游，已知这两种基因可介导内体中的受体沉默。

以下研究表明，泛素化货物的内体分选具有重要的生理意义果蝇属两个ESCRT亚基Tsg101和Vps25的突变体。这些蛋白质的丢失产生受体和泛素的内胚体积累，类似于高分辨率分光计突变体。重要的是，由于Notch介导的信号增强，细胞克隆中Tsg101和Vps25的丢失导致邻近组织的肿瘤样过度增殖(莫伯格等。, 2005;汤普森等。, 2005;Vaccari和Bilder，2005年). 我们无法检测到任何此类影响工厂1突变克隆（我们未发表的数据）与Notch信号（以及Wg和Dpp信号）在工厂1突变体。因此，与Hrs和ESCRT-I和-II蛋白不同，Fab1似乎在受体沉默中不起任何作用，尽管它对受体降解很重要。这让人想起ESCRT-III亚单位hVps24，它介导表皮生长因子受体的降解但不沉默(巴赫等。, 2006). 此外，值得注意的是，Hrs、Tsg101或Vps25功能受损会导致泛素化蛋白在内胚体中大量积累(主教等。, 2002;Jekely和Rorth，2003年;汤普森等。, 2005)，而在工厂1突变克隆。这些结果，再加上Fab1主要定位于晚于Hrs的内吞结构，表明Fab1在内吞贩运中的作用晚于Hr和ESCRT-I/-II，超出了受体去平衡和信号终止。

对酵母和哺乳动物细胞的研究表明Fab1在内吞膜稳态中发挥作用，尽管其确切功能尚不清楚。事实上，共聚焦和EM显示了较大的晚期内体在工厂1突变体果蝇属细胞，与之前的研究一致工厂1酵母和激酶头PIKfyve在哺乳动物细胞中的过度表达。增大的液泡工厂1激酶头PIKfyve过度表达细胞中的酵母突变体和晚期内体含有很少的内部囊泡，这表明Fab1可能介导此类囊泡的形成(奥多里齐等。, 1998;伊科诺莫夫等。, 2001). 与此一致工厂1突变体果蝇属我们经常观察到细胞内体增大，腔内小泡很少或没有。然而，在工厂1我们还观察到突变体的MVB高度增大，充满大量正常大小的腔内小泡。这表明，与已报道的Hrs相比，在不存在Fab1的情况下，不能用管腔内小泡的抑制形成来解释内体尺寸的增加(劳埃德等。, 2002). 一个更可能的解释是晚期内体在工厂1生物合成和早期内吞途径逆行膜通量受抑制的突变体(鸽子等。, 2004;伊夫等。, 2005).

细胞和器官大小由遗传、激素和环境输入控制(哈芬和斯托克，2003年). 特别是，胰岛素信号传导对生长很重要，下游I类PI 3-激酶在生长信号传导中的功能具有很好的特征。观察到的显著生长表型工厂1突变体表明PtdIns（3）P5激酶也调节细胞大小。然而，有趣的是，尽管PI3-激酶促进生长，但我们的发现表明Fab1对细胞大小有抑制作用。花环细胞在工厂1突变体，提示Fab1在负细胞大小调节中的功能。此外，工厂1该缺陷导致腿部增厚，翅膀和头部增大，表明Fab1在缩小器官大小方面发挥了作用。的过度表达果蝇属Fab1没有引起任何明显的生长抑制效应（我们未发表的数据），这与在酵母中过度表达Fab1不会导致PtdIns（3,5）P增加的发现一致2水平，可能是因为监管成分受到限制(奥多里齐等。, 1998). 我们无法检测到工厂1以及胰岛素信号通路成分的突变（我们未发表的数据），表明工厂1突变体可能不是由于该途径上调所致。相反，细胞大小和内体过度生长之间存在显著的相关性工厂1突变幼虫。因此，增加的细胞和器官大小工厂1突变可能是由于内体的体积膨胀引起的。因此，我们认为Fab1通过其对内体形态的影响，起到负调节细胞体积的作用。进一步的研究将揭示Fab1是否也通过其他机制调节细胞大小。

总之，我们对多细胞生物中的PtdIns（3）P5激酶进行了首次分析，发现Fab1对于适当的降解性受体运输至关重要，但对于终止受体信号传导来说却是不可或缺的。这使Fab1的功能处于内吞受体运输的晚期，表明信号终止不需要受体降解。

致谢

我们感谢安·玛丽·沃伊（Ann Mari Voie）协助准备转基因苍蝇，感谢雨果·贝伦（Hugo Bellen）、斯蒂芬·科恩（Stephen M.Cohen）、何塞·德塞利斯（Jose F.de Celis）、马科斯·冈萨雷斯-盖坦（Marcos Gonzalez-Gaitan）、赫尔穆特·克雷默（Helmut Krämer）、佩尼尔·沃思（Pernille。我们还感谢Jose F.de Celis讨论遗传实验，感谢Sébastien Wälchli批判性地阅读手稿，感谢欧洲分子生物学组织“发育过程中的细胞内吞和信号传递”实践课程的老师提供的有益意见。T.E.R.是挪威研究委员会的博士后研究员。A.B.是挪威功能基因组学项目的职业科学家。这项工作还得到了挪威癌症协会和诺和诺德基金会（给H.S.）的资助，以及瑞典研究委员会和沃伦伯格北方联盟（给C.S.）提供的资助。

使用的缩写：

英国标准协会牛血清白蛋白
相对长度单位电子显微镜
电子顺磁共振成像运输所需的内胚体分选复合体
GFP公司绿色荧光蛋白
人力资源计划辣根过氧化物酶
多功能车辆总线多泡体
OGD公司俄勒冈州绿右旋糖酐
圆周率磷脂酰肌醇
TRD公司德克萨斯红右旋糖酐。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E06-03-0239)2006年7月12日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会