临床投资杂志。2003年5月15日；111(10): 1519–1527.
低氧诱导因子-2α杂合缺失可保护小鼠在长时间缺氧期间免受肺动脉高压和右心室功能障碍的影响
,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,1和1
科恩·布鲁塞尔曼
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工医学院肾脏科
Veerle Compernolle公司
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工学院肾脏科
马克·特伊瓦
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学维尔乔校区Klinikum Charité肾病和医学重症监护系三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工医学院肾脏科
迈克尔·S·威森纳
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工医学院肾脏科
帕特里克·H·麦克斯韦
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工医学院肾脏科
德西雷·科伦
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工医学院肾脏科
皮特·卡梅里特
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工医学院肾脏科
1比利时鲁汶卡托利克大学鲁汶佛兰德斯大学间生物技术研究所转基因技术和基因治疗中心2德国柏林洪堡大学弗丘校区Klinikum Charité肾脏病和重症监护科三英国伦敦哈默史密斯校区帝国理工学院肾脏科
收稿日期：2002年3月21日；2003年3月11日接受。
摘要
慢性缺氧导致肺血管重塑，导致肺动脉高压、右心室肥厚和心力衰竭。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）杂合性缺失，通过增加红细胞生成和血管生成相关基因的表达，调节细胞对缺氧的反应，此前已被证明可以延缓低氧诱导的肺动脉高压。HIF-2α是HIF-1α的同源物，在肺部大量表达，但其在肺动脉高压中的作用尚不清楚。因此，我们分析了WT和活性杂合HIF-2α缺陷患者的肺反应(Hif2α+/–)暴露于10%O后的小鼠2持续4周。与WT小鼠相比，Hif2α+/–小鼠对肺动脉高压和右心室肥厚具有完全保护作用，揭示了HIF-2α在低氧诱导的肺血管重塑中的关键作用。肺内皮素-1和血浆儿茶酚胺水平在WT中分别增加了3倍和12倍，但在WT中没有增加Hif2α+/–小鼠缺氧后，表明HIF-1α介导的这些血管收缩因子的上调有助于缺氧肺血管重塑的发展。
介绍
肺动脉高压是一个严重的健康问题，因为它经常导致右心室肥厚和心力衰竭(1,2). 目前的治疗包括给氧、支气管扩张剂、血管扩张剂（如前列环素、一氧化氮和内皮素-1拮抗剂），以及最终的机械通气(2–4). 然而，由于氧合和血管扩张仅仅延缓了该病的进展，因此需要更好地了解其发病机制(2). 低氧性肺动脉高压的病理生理学是复杂的，目前尚不清楚。其特征是血管收缩剂血管紧张素II和内皮素-1（ET-1）水平升高，血管扩张剂NO和前列环素的生成受损，影响VSMC生长、迁移和分化的因素产生不平衡，包括FGF-2、PDGF-B、TGF-β、IGF-I和-II以及EGF(5,6). 结果，正常情况下非肌肉的外周动脉肌肉化，中层和外膜增大(5–7). eNOS丢失(8)或前列环素受体(9)加重缺氧性肺血管病，而ET-1受体阻断(4)，前列环素过度表达(10)和iNOS的基因转移(11)减少低氧诱导的肺动脉高压。此外，血清素转运体（一种在缺氧期间上调的肺VSMC有丝分裂原）的缺乏也会减轻缺氧性肺动脉高压(12). 此外，丝氨酸弹性蛋白酶、纤溶酶原和基质金属蛋白酶通过降解细胞外基质和释放有丝分裂原或分化因子参与血管平滑肌细胞的生长和迁移(13). 蛋白酶参与肺动脉高压的病理过程，因为缺乏纤溶酶原或尿激酶型纤溶酶酶原激活物的小鼠可以部分保护其免受肺血管重塑的影响(14). 最近，VEGF的基因转移也显示可以降低大鼠的肺动脉高压(15).
低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞缺氧适应的关键调节因子(16). 缺氧期间，HIF-1α通过将HIF-1β作为异二聚体与这些靶基因启动子中的低氧反应元件（HRE）结合，上调许多参与红细胞生成、糖酵解和血管生成的基因的表达(16,17). 缺氧和/或低血糖导致HIF-1α或HIF-1β基因表达受损，并在胚胎期10.5天左右导致胚胎死亡(16,17). 最近，一种新的同源物，HIF-2α（也称为EPAS1[参考文献。18]，HLF[参考。19]，或HRF[参考。20])经鉴定，其也作为异二聚体与HIF-1β结合到靶基因启动子中的HRE。基因激活研究显示HIF-2α在胚胎心血管发育和血管生成中的作用(21,22)但其在成人病理中的作用尚不清楚。
HIF-1α最近被证实参与慢性缺氧的肺反应，因为肺动脉高压在杂合性缺陷中延迟Hif1α+/–老鼠(23). 此外，Hif1α+/–肺动脉肌细胞对慢性缺氧的电生理反应受损(24). 虽然HIF-2α在肺部大量表达(19,20,25)，其在肺动脉高压中的作用迄今尚未被研究。我们之前禁用了Hif2α胚胎干细胞中的基因(26)并用它们产生转基因小鼠(25). 由于纯合缺陷Hif2α–/–小鼠在妊娠期或出生后立即死亡(21,22,25)，活杂合子Hif2α+/–本研究使用小鼠分析HIF-2α在肺动脉高压和血管重塑中的作用。
方法
动物协议。
动物实验得到了机构审查委员会的批准，并按照之前的描述进行(14)根据NIH动物实验指南。称重8周龄小鼠（同窝小鼠；混合背景瑞士/129Sv），并将其置于常压缺氧（10%O2)持续流入2 l/min N2和2 l/min正常空气（21%O2). 对照组小鼠置于正常空气中（21%O2). 在缺氧暴露指定时间后，称重小鼠，并立即用于测定RV肥大、红细胞压积、血浆儿茶酚胺水平、基因表达和组织学。对于血液动力学测量，小鼠首先在室内空气中平衡1小时。
慢性缺氧暴露后的血流动力学测量。
如前所述进行血流动力学测量(14). 为了避免急性血管舒缩反应，首先将小鼠放回室内空气中1小时，使其达到平衡(11,23)然后用氨基甲酸乙酯（1.4 mg/kg）麻醉。在对小鼠进行通气时（Minivent 845；Hugo Sachs Elektronik，March-Hugstetten，德国；150次/分钟，容量250μl），在受控正常体温下，使用1.4F高保真压力微压计（SPR-671；Millar Instruments Inc.，美国德克萨斯州休斯顿）通过经胸穿刺测量RV压力。在每次测量之前，校准压力计参考设置。通过压力读数验证右心室压力计的正确位置，并通过尸检确认。血液动力学稳定后，对压力测量值进行放大（西门子压力放大器863；西门子Elema AB，瑞典索尔纳）和未经滤波的数字化（Dataq DA Convert DI-205；Dataq Instruments Inc.，美国俄亥俄州阿克伦）（采样率2000 Hz）。如前所述，记录并分析数字文件（WinDaq软件；Dataq Instruments Inc.）(14). 对于每次测量，计算十次连续跳动的平均值。收缩性能指标包括心室压力最大等容发展率（dP/dt最大值)和收缩性（dP/dt最大值P） ●●●●。我们通过拟合RV压力的衰减（从dP/dt最小值)假设渐近线为零的单指数方程：P（P）(t吨) =P（P）(0).e（电子）–t/τ(27). 如前所述，对慢性肺动脉高压患者的右心室进行功能评估(28).
正常小鼠对急性缺氧和激动剂的血流动力学反应。
用氨基甲酸乙酯麻醉正常小鼠，通风，并保持在控制的正常体温。在每次测量之前，对1.4F微压计参考设置进行校准。如前所述引入压力计(29). 简单地说，压力导管是通过右颈静脉引入RV腔的。在首次使用室内空气通风（15分钟）和使用低氧气体混合物通风（7%O）期间，连续记录压力参数2，93%2; 20分钟）或服用激动剂后。急性缺氧性血管收缩被定义为右心室收缩压的变化，以基线的百分比表示。如前所述评估血管抑制剂反应(30). 简言之，静脉注射前列腺素F可诱导血管收缩2α（0.3微克/千克）。3分钟后，静脉注射缓激肽（1μg/kg），测量血管抑制反应，即注射缓激素时的RV收缩压减去3分钟后的RV收缩期压力。
红细胞压积和血浆儿茶酚胺分析。
从腔静脉采集血样，并使用自动细胞计数器分析红细胞压积（cell-Dyn 1330；美国伊利诺伊州雅培公园雅培实验室）(14). 如前所述，在大学医院实验室（比利时鲁汶Katholieke Universiteit Leuven）通过HPLC定量血浆去甲肾上腺素水平(22).
右心室肥大测量。
心脏被解剖，心房切除后从左心室和中隔取出右心室壁(14). 在55°C下干燥心室（直到连续两天之间的重量差小于0.1 mg）并称重。结果表示为右心室重量与左心室重量加隔膜重量之比[RV/（LV+S）]或右心室重量和总体重之比（RV/B）。
组织学分析。
如前所述(14)，我们进行了组织准备；Hart弹性蛋白染色，用于显示内外弹性层（IEL和EEL）；小鼠抗SMCα-actin抗体对平滑肌细胞的染色；用兔抗血栓调节蛋白抗体对内皮细胞进行染色。为了评估肺血管重塑，我们统计了位于支气管远端的非肌化（仅IEL）、部分肌化（IEL加上不完全EEL）和完全肌化（EEL和完全EEL。使用Quantimet Q600成像系统（Leica imaging Systems Ltd.，Cambridge，United Kingdom）量化血管数量，并表示每100个肺泡(14,31). 完全肌肉化肺小动脉（直径小于80μm）的壁厚计算为EEL直径减去IEL直径除以EEL直径的百分比(14,31). 如前所述测量毛细管密度和毛细管间距离(14)，使用Quantimet Q600成像系统。
基因表达分析。
如前所述进行蛋白质提取和蛋白质印迹分析(17,26). 简单地说，冷冻组织在提取缓冲液中均质化，提取物通过Bio-Rad DC蛋白质分析进行定量（德国慕尼黑Bio-Rad Laboratories GmbH）。用6%SDS-PAGE分离50微克总蛋白，转移到Immobilon-P膜上（Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts，USA），并与eNOS抗体（Calbiochem-Novabiochem Corp.）或HIF-1α或HIF-2α抗体（之前生成的[ref。32]). 采用化学发光法（SuperSignal West Dura；Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA）和HRP结合的次级抗体进行检测。ET-1蛋白水平通过ELISA测定（德国汉堡免疫生物实验室）。如前所述，进行了肺和心脏RNA提取和TaqMan定量实时RT-PCR（比利时伦尼克应用生物系统公司）(26). 基因表达被确定为每100个mRNA拷贝的mRNA拷贝数高效放射治疗基因（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），用作内部控制。我们使用了以下正向（F）和反向（R）引物，以及标记有荧光染料（FAM或JOE）和猝灭剂（TAMRA）的探针（P）：高效放射治疗，F，5′-TTACAGACTGAGAGAGCTACTGTAAATGATC-3′，R，5′-TTACCAGTGCAATTATCTTCAACAATC-3′，和P，5′-JOE-TGAGAGATCCCACAATACTTACTGTCC-TAMRA-3′；对于电子NOS，F，5′-AGCCCGGGACTTCATCAATC-3′，R，5′-TGAAGCCTCTCATGAG-3′，和P，5′-FAM-ACTATAACTCACAAAAGGAGTCCACG-TAMRA-3′；对于电子技师-1，F，5′-CTCTGCCACCTGACATCA-3′，R，5′-CTCCAGTCCATCGGTACGA-3′，和P，5′-FAM-CTGGGTCAACACTCCGAGCGC-TAMRA-3′；对于血小板衍生生长因子-B，F，5′-CGTCCAGGTGAGAAGATTG-3′，R，5′-CGTCCATTGGCTCGCTGCTC-3′，和P，5′-FAM-CCCATCTTCAAGAAGCCACAGTGACCT-TAMRA-3′；对于HIF-1α，F，5′-TGAGCTCACATCTTGATAAGCTTCT-3′，R，5′-GGGCTTTCAGATAAACAGTCCAT-3′，和P，5′-FAM-AGACCACCGACACAGATCTCA-TAMRA-3′，用于HIF-2α，F，5′-CCTGGCCATCAGCTT-3′，R，5′-CTGGTCGCCTCAGCTC-3′，和P，5′-FAM-CACATAAGCTCCCAGTCTCAGTCTGA-TAMRA-3′。
统计分析。
数据表示为平均值±SEM。使用非参数Mann-Whitney进行数值比较U型测试。
结果
杂合HIF-2α缺陷型（Hif2α）的产生+/–)老鼠。
为了研究HIF-2α在体内的作用，我们之前将其灭活HIF-2α同源重组胚胎干细胞中的基因(26)随着第二外显子的缺失，编码基本的螺旋-环-螺旋结构域，这对DNA结合和二聚体至关重要(16,18,22). 缺少单一基因的转基因小鼠HIF-2α等位基因(Hif2α+/–)如前所述，通过二倍体胚胎聚集和随后的高比例嵌合体繁殖产生(25).Hif2α+/–小鼠存活且健康，经宏观和微观分析，心脏（见下文）和肾脏（每个肾脏纵切面的传入和传出小动脉：170±4 inHIF-2α+/+小鼠（以下简称WT小鼠）和168±10英寸Hif2α+/–老鼠；n个= 3–5;P（P）=NS）。一半的Hif2α–/–胚胎在妊娠期间死亡，而剩下的胚胎Hif2α–/–小鼠出生时死亡，与之前的报告一致(21,22,25).
分析WT和WT中HIF-1α和HIF-2α的表达Hif2α+/–老鼠。HIF-2α转录水平，以每100个mRNA拷贝数表示高效放射治疗mRNA拷贝数减少了50%Hif2α+/–小鼠肺部（WT小鼠23±4和20±2 vs.12±2和11±1 inHif2α+/–小鼠分别处于常氧和缺氧状态；n个= 6;P（P）<0.05）和心脏（WT小鼠为3.3±0.7和3.0±0.5，而WT小鼠则为1.7±0.3和1.6±0.4英寸Hif2α+/–小鼠分别处于常氧和缺氧状态；n个= 6;P（P）< 0.05). 由于HIF-1αmRNA水平（mRNA拷贝数/100高效放射治疗mRNA拷贝数）在肺中的两种基因型中具有可比性（WT小鼠为16±2和12±1，而WT小鼠为13±1和13±3Hif2α+/–分别处于常氧和缺氧状态的小鼠；n个= 6;P（P）=NS）和心脏（WT小鼠55±3和39±5，而WT小鼠48±9和44±3英寸Hif2α+/–小鼠分别处于常氧和缺氧状态；n个= 6;P（P）=NS）。Western blot分析显示，正常氧和缺氧状态下肺组织HIF-2α蛋白水平在Hif2α+/–小鼠与WT小鼠的比较（图a） 。HIF-1α蛋白在正常氧和缺氧肺中均未检测到（数据未显示），与之前的报告一致(23).
(一)Western blot分析显示肺HIF-2α蛋白水平在Hif2α+/–小鼠在常氧（N）和缺氧（H）1周后与WT小鼠进行比较。如前所述，接触常氧或缺氧（1%氧气，4小时）的PC12细胞提取物(17,26)，用作对照。(b条)WT和Hif2α+/–小鼠常氧或低氧暴露后。血流动力学分析显示在常压下RV压力无差异；然而，在缺氧4周后，WT小鼠的RV压力升高，但Hif2α+/–老鼠没有。(c（c）)WT和Hif2α+/–小鼠在常氧条件下无差异。低氧暴露4周后，WT小鼠的右心室重量与左心室加隔膜重量之比[RV/（LV+S）]增加，但在WT小鼠中没有增加Hif2α+/–老鼠。(d日)慢性缺氧6天后，WT小鼠肺ET-1转录水平升高，缺氧4周后仍升高。相反，慢性缺氧未能诱导肺组织ET-1的表达Hif2α+/–老鼠。数据表示右心室收缩压（mmHg；n个= 4–7) (b条)，右心室质量与左心室加隔膜质量之比[RV/（LV+S）；n个= 6–7] (c（c）)和ET-1 mRNA每100个拷贝的拷贝数高效放射治疗(n个= 5–6) (d日). *具有统计学意义(P（P）<0.05）与对照组（WT，常氧）。
Hif2α+/–小鼠在严重缺氧的长期暴露下存活。
为了研究HIF-2α在慢性缺氧反应中的作用，研究了8周龄WT和Hif2α+/–窝友被安置在常压缺氧（10%O2)持续4周。两种基因型的对照组均保持在正常空气中（21%O2). 实验开始时，两种基因型的小鼠看起来都很健康，在笼子里活动自如，体重相当（约26克）。在常氧条件下4周后，WT小鼠的体重增加超过Hif2α+/–小鼠（WT小鼠22%±3%，WT小鼠10%±3%Hif2α+/–老鼠；n个= 6–8;P（P）= 0.04). 当暴露于缺氧条件下时，大多数WT小鼠变得不活动，体重减轻了29%±2%，但缺氧4周后没有一只小鼠死亡。相反，Hif2α+/–小鼠没有任何不适的迹象，行为正常，活动活跃，缺氧4周后体重仅减轻了16%±2%(P（P）<0.001 vs.WT小鼠；n个= 15–17).
Hif2α+/–小鼠对肺动脉高压有保护作用。
在正常氧水平下，未观察到右心室收缩压的基因型差异（图b） ●●●●。慢性缺氧增加了WT小鼠的右心室收缩压，但在Hif2α+/–鼠标（图b） ●●●●。额外的血液动力学测量表明，常氧小鼠暴露于急性缺氧（7%O2)在20分钟内，WT小鼠的右心室收缩压也有类似的增加（25%±9%；n个=5）和Hif2α+/–小鼠（29%±7%；n个= 4;P（P）=NS）。此外，缓激肽诱导的血管抑制反应在WT和Hif2α+/–小鼠（WT小鼠2.0±0.2 mmHg，WT小鼠2.2±0.2 mm汞Hif2α+/–老鼠；n个= 4;P（P）=NS）。这些数据表明，在WT和Hif2α+/–老鼠和保护Hif2α+/–小鼠抗肺动脉高压不是由于急性血管舒缩反应的差异。综上所述，这些结果表明，由于低氧诱导的血管收缩而导致的RV压力的任何可能的额外增加可能确实也有助于WT小鼠的RV肥大，但显然对肺血管重塑和RV肥厚没有影响Hif2α+/–老鼠。
RV收缩性，通过RV压力校正后的最大dP/dt测量最大值P） ，在正常氧条件下，两种基因型具有可比性（180±32 s–1WT小鼠vs.160±29 s–1在里面Hif2α+/–老鼠；n个= 4–5;P（P）=NS）。缺氧4周后，WT小鼠的RV收缩力趋于受损（110±27 s–1;n个= 4;P（P）=NS与正常毒性WT小鼠），而在Hif2α+/–小鼠（290±41秒–1;n个= 6;P（P）<0.02 vs.常氧WT和Hif2α+/–老鼠）。通过测量舒张时间常数τ来评估RV舒张功能，这两种基因型在正常氧条件下具有可比性（WT小鼠的τ=9±1 ms，而WT小鼠为7±1 ms）Hif2α+/–老鼠；n个= 4–5;P（P）=NS）。相比之下，缺氧4周后，WT患者的RV舒张功能显著受损，但WT患者没有Hif2α+/–小鼠（WT小鼠τ=17±5 ms，WT小鼠为6±1 msHif2α+/–老鼠；n个= 4–6;P（P）= 0.01). WT和Hif2α+/–小鼠处于常氧状态和缺氧后（数据未显示）。
Hif2α+/–小鼠对RV肥大有保护作用。
为了评估右心室肥大，测定了右心室和左心室加间隔（LV+S）的重量。在正常氧水平下，RV/（LV+S）体重比没有观察到基因型差异（图c） ●●●●。缺氧4周后，WT的RV/（LV+S）重量比增加，但在Hif2α+/–鼠标（图c） ●●●●。当RV重量标准化为总体重（B）时，也获得了类似的结果。然而，在正常氧条件下，RV/B重量比没有差异（WT小鼠为0.25±0.02 mg/g，而WT小鼠则为0.24±0.01 mg/gHif2α+/–老鼠；n个= 7–10;P（P）=NS），WT的RV/B重量比高于Hif2α+/–低氧后小鼠（WT小鼠为0.44±0.03 mg/g，WT小鼠0.27±0.02 mg/g）Hif2α+/–老鼠；n个= 6–7;P（P）= 0.001).
由于低氧诱导的WT小鼠RV肥大，RV心肌壁冠状血管发生了显著变化：毛细血管间距增大（常氧时为11±0.3μm，缺氧时为14±0.1μm；n个= 5;P（P）<0.05），而毛细血管密度下降（毛细血管数/mm2：常压下7200±240 vs.低氧下5600±390；n个= 5;P（P）< 0.05). 由于没有代偿性血管生成，毛细血管/心肌细胞比率正常（常氧时为1.2±0.08，缺氧时为1.1±0.04；n个= 5;P（P）=NS），肥大的心肌细胞可能遭受了一定程度的缺血。相反，在Hif2α+/–小鼠（毛细血管间距：常氧时为12±0.3μm，缺氧时为11±0.3μm.毛细血管/mm2：正常缺氧时为7000±310，缺氧时为7600±410；毛细血管/心肌细胞比率：常氧1.1±0.05，缺氧1.2±0.08；n个= 5;P（P）=NS）。
Hif2α缺乏肺血管重塑+/–老鼠。
因为肺动脉高压通常与肺动脉的血管重塑有关(5,6)，我们研究HIF-2α是否影响肺血管重塑。弹性蛋白染色后对肺泡和肺泡导管水平的血管进行计数，结果显示，WT和Hif2α+/–正常氧条件下的小鼠（表). 缺氧4周后，WT小鼠有更多厚壁肌肉化血管，其中包含IEL和完整的EEL（表). 相反，缺氧时血管重构没有发生Hif2α+/–小鼠，其中带有IEL和完整EEL的肌肉化血管的比例与正常毒性WT和Hif2α+/–老鼠（表; 图，a–e）。完全肌肉化肺小动脉的壁厚，用EEL直径减去IEL直径除以EEL直径的百分比来测量，在正常氧条件下，两种基因型的肺小动脉壁厚是相似的（WT小鼠为7.6%±0.5%，而WT小鼠则为8.0%±0.5%）Hif2α+/–老鼠；n个= 5;P（P）=NS）。低氧增加了WT小鼠完全肌肉化小动脉的壁厚，但在WT小鼠中没有增加Hif2α+/–小鼠（WT小鼠为16%±0.4%，而WT小鼠则为7.4%±0.2%Hif2α+/–老鼠；n个= 5;P（P）= 0.02). 肺切片上SMCα-肌动蛋白的免疫染色证实了血管重构的基因型差异。与相比Hif2α+/–在低氧暴露后，WT小鼠的血管明显更加肌肉化，完全被SMC包围。在Hif2α+/–低氧暴露后，大多数肺血管仅部分被SMC包围（表; 图，f–j）。
(一–e（电子）)Hart的弹性蛋白染色显示，在正常氧（N）WT的肺中，肺泡和肺泡导管水平的支气管远端存在血管，其中仅包含一个IEL（或一个IEL+一个不完整的EEL）（箭头）(一)和Hif2α+/–老鼠(b条). 低氧（H）WT小鼠的肺部显示存在包含IEL和完整EEL的厚壁血管（箭头所示）(c（c）和d日)，而在Hif2α+/–鼠标（箭头）(e（电子）). (（f）–j个)SMCα-肌动蛋白染色显示正常肺组织中存在部分肌肉化的外周血管（箭头）(（f）)和Hif2α+/–老鼠(克). 慢性缺氧导致WT小鼠的肺血管重塑，如肌肉化血管的存在所示（箭头所示）(小时和我)，但不在Hif2α+/–鼠标（箭头）(j个). 所有面板中的Bar=50μm。
Hif2α的正常红细胞压积水平+/–老鼠。
WT和Hif2α+/–正常氧条件下的小鼠（WT小鼠为36%±1%，而WT小鼠则为34%±1%Hif2α+/–老鼠；n个= 6;P（P）=NS）。缺氧4周后，两种基因型的红细胞压积水平都有相应增加（12只WT小鼠的红细胞比积为46%±1%，16只WT鼠的红细胞比容为46%？%Hif2α+/–老鼠；P（P）=NS）。这些发现表明Hif2α+/–小鼠并不是因为缺氧时红细胞生成减少导致血管阻力降低。
HIF-2α在肺和心脏基因表达中的作用。
ET-1可能通过刺激VSMC的生长和增殖而促进肺血管收缩和肺血管重塑(33)而ET-1受体阻断可改善肺动脉高压(4). 此外，ET-1基因的启动子含有HIF结合位点，ET-1在体外和体内缺氧肺中受到缺氧上调(4,16). 因此，通过定量RT-PCR测定肺组织ET-1的表达。在正常氧条件下，肺ET-1转录水平无基因型差异。缺氧6天和4周后，WT组的肺ET-1转录水平升高，而WT组没有升高Hif2α+/–鼠标（图d） ●●●●。ELISA法测定ET-1蛋白水平证实，缺氧时肺ET-1蛋白的上调在Hif2α+/–小鼠（pg ET-1/mg蛋白在常氧和缺氧时，分别为：WT小鼠为10±2和31±2，而WT小鼠则为11±3和19±3Hif2α+/–老鼠；n个= 4;P（P）缺氧时<0.05）。因为NO在肺血管舒张和抑制VSMC生长中起着关键作用(34)，我们还测定了肺中eNOS的表达。在常氧和缺氧6天后，两种基因型的肺eNOS转录水平具有可比性（每100拷贝的mRNA拷贝数高效放射治疗正常氧和缺氧状态下的mRNA：WT小鼠分别为4.3±0.5和3.7±0.1，而WT小鼠为3.2±0.4和3.1±0.4Hif2α+/–老鼠；n个= 6;P（P）=NS）。Western blot分析（未显示）显示WT小鼠的肺eNOS蛋白因缺氧而增加（与之前的研究结果一致；参考文献。35); 肺eNOS蛋白在Hif2α+/–小鼠（数据未显示），表明缺氧时肺eNOS的表达不受HIF-2α的调节。
ET-1也与心肌肥厚有关(36). 心脏ET-1转录水平在正常氧水平下具有可比性（每100拷贝的mRNA拷贝数高效放射治疗mRNA：WT小鼠90±10 vs.100±10 inHif2α+/–老鼠；n个= 6;P（P）=NS），但在WT中上调至比在Hif2α+/–缺氧4周后的小鼠（WT小鼠240±20 vs.160±30Hif2α+/–老鼠；n个= 5;P（P）< 0.05). ELISA测定表明，缺氧时心脏ET-1蛋白的上调在Hif2α+/–小鼠（正常氧：WT小鼠3.9±0.3 pg/mg蛋白质，WT小鼠4.4±1.4 pg/mg蛋白Hif2α+/–老鼠；n个= 4;P（P）=NS；低氧：WT小鼠的蛋白质为7.1±0.3 pg/mg，而WT小鼠为5.1±1.5 pg/mgHif2α+/–老鼠；n个= 4;P（P）< 0.05). 心脏PDGF-B的表达也因WT缺氧而升高，但在WT中没有升高Hif2α+/–小鼠（每100拷贝的mRNA拷贝数高效放射治疗正常氧状态下的mRNA：WT小鼠0.5±0.1 vs.0.5±0.1 inHif2α+/–老鼠；n个= 6;P（P）=NS；每100份的mRNA拷贝数高效放射治疗低氧状态下的mRNA：WT小鼠为1.2±0.3 vs.0.5±0.1 inHif2α+/–老鼠；n个= 5;P（P）< 0.05).
HIF-2α在儿茶酚胺稳态中的作用。
酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺生物合成的关键基因，其表达受缺氧上调(16). 此外，低氧和慢性阻塞性肺病和/或肺动脉高压患者的血浆儿茶酚胺水平升高(37,38). 由于HIF-2α的缺失会损害胎儿儿茶酚胺的产生(22)去甲肾上腺素（NE）刺激离体肺动脉的血管收缩(39)大鼠肺移植体中的肺微血管(40)，测定血浆NE水平。在常压下，两种基因型的血浆NE水平具有可比性（WT小鼠0.5±0.1 ng/ml，WT小鼠0.6±0.1 ng/mlHif2α+/–老鼠；n个= 5;P（P）=NS）。慢性缺氧4周使WT小鼠血浆NE升高12倍，但仅使WT小鼠血浆NE升高3.5倍Hif2α+/–小鼠（野生型小鼠为5.8±1.5 ng/ml，野生型小鼠为2.2±0.5 ng/mlHif2α+/–老鼠；n个= 5;P（P）= 0.022). 缺氧4天后，当在WT小鼠中未观察到肺血管重构时（数据未显示），WT小鼠血浆NE水平已增加3.5倍（1.8±0.3 ng/ml），表明WT小鼠的血浆NE升高发生在肺血管重构之前。
讨论
本研究的主要发现是，HIF-2α杂合缺陷可保护小鼠在长期缺氧条件下免受肺动脉高压、RV肥大和功能障碍的影响。这些发现揭示了HIF-2α在肺血管重构中的关键作用，可能是通过上调ET-1和NE。
肺血管重塑。
低氧导致WT小鼠肺阻力血管的新肌肉化显著增加，SMCs完全覆盖且包含IEL和完整EEL的肺血管比例增加证明了这一点。由于慢性缺氧期间肺静脉的结构变化极小(31)厚壁肺血管的增加可能与肌化小动脉的增加相对应。值得注意的是，血管肌肉化Hif2α+/–缺氧后的小鼠与Hif2α+/–或正常氧后的WT小鼠。类似于杂合子缺陷Hif1α+/–老鼠(23)，杂合子缺失Hif2α+/–小鼠也能抵抗肺血管重塑。尽管我们的数据表明，慢性缺氧期间的肺动脉高压是由HIF-2α介导的，但血管重塑是由HIF-2α在血管壁中的直接作用引起的，还是由HIF-2α介导的肺小动脉压力增加间接引起的，仍有待确定。另一个有趣的问题是为什么HIF-2α水平降低Hif2α+/–小鼠足以维持胚胎发育，但不会诱发肺动脉高压，这表明不同的生物学过程可能需要不同的HIF-2α表达阈值。以前曾在血管生成中观察到类似现象，胎盘生长因子似乎影响病理性血管生成，但不影响血管发育(41).
肺血管重塑是一个复杂的、尚不清楚的过程。肺血管对局部缺氧作出反应，通过上调血管活性物质来收缩，这是使氧合/灌注比率正常化的自然反应的一部分。当缺氧持续和普遍存在时，肺血管会发生显著的结构变化，包括细支气管和肺泡导管末端小动脉的新肌肉化和中层增厚。阻断HIF-1α的NAPDH氧化还原酶抑制剂(16)，减少肺血管收缩(42)提示缺氧诱导的肺血管收缩可能由缺氧诱导因子介导。此外，众所周知的HIF-1α靶基因ET-1的肺表达水平(16)，在肺动脉高压患者中增加(4,7)ET-1或其受体的抑制可预防低氧诱导的肺动脉高压和血管重塑(4). 通过引起血管收缩，ET-1最初可能会增加剪切应力并启动肺血管重塑(7). 因为已知ET-1可以刺激VSMC的生长(4,33)，它也可能有助于缺氧时肺血管的肌肉化。由于肺ET-1水平在WT缺氧期间显著上调，但在WT中没有上调Hif2α+/–小鼠HIF-2α可能通过上调ET-1，至少部分调节肺动脉高压的发生。而ET-1是已知的HIF-1α靶基因(16)现在，我们的研究结果表明，ET-1的表达也可由HIF-2α诱导。这并不完全令人惊讶，因为HIF-1α和HIF-2α在ET-1启动子中都与相同的HRE结合(18,19)HIF-2α在肺部大量表达(19,20). 虽然我们的研究结果表明HIF-2α通过调节ET-1的表达参与肺动脉高压，但显然不排除HIF-2β调节其他血管活性物质的表达。
右心室肥大和功能障碍。
肺动脉高压导致右心室肥大和功能障碍，最终发展为右心室衰竭（肺心病）(1,2). 当WT小鼠长期暴露于低氧环境中时，RV压力显著增加，导致RV肥大。RV压力甚至可能被低估，因为它们是在小鼠与室内空气平衡1小时后测量的，这可能会减少或消除低氧诱导的血管收缩反应。WT小鼠还出现右心室收缩和舒张功能障碍的迹象，可能表示心肌对血流动力学应激的长期增加适应不足。相反，低氧时右心室舒张功能保持不变，而右心室收缩功能改善Hif2α+/–小鼠与正常小鼠的比较。这一点值得注意，因为低氧突变小鼠的右心室负荷保持正常，这表明肺血管阻力血管和正常右心室压力缺乏重塑。可能，当在低氧环境中长期维持时，这些小鼠的心脏功能得到增强，以补偿周围组织的低氧血症和氧合受损。ET-1和PDGF-B的表达先前与心肌肥厚有关(36,43)，在低氧WT小鼠肥厚心脏中增加，这表明这些分子可能至少部分促成了肥厚诱导的心肌细胞肥大。此外，已知ET-1通过增强体外培养的大鼠心肌细胞中肌肉特异性基因的表达来诱导肥大(36). 虽然HIF-2α可以直接刺激ET-1基因转录，但到目前为止，在PDGF-B启动子中还没有发现HIF结合位点，这表明PDGF-B的上调是间接发生的。然而，ET-1和/或PDGF-B在心脏的表达增加也可能是RV压力增加的直接影响。
儿茶酚胺稳态。
HIF-2α与发育过程中儿茶酚胺生物合成的调节有关(22)，但到目前为止，尚未报道在成年生活中可能发挥的作用。低氧使WT小鼠血浆NE水平上调12倍，但在WT小鼠中仅上调3.5倍Hif2α+/–老鼠。慢性阻塞性肺疾病和/或肺动脉高压患者血浆NE水平上调(37,38). 由于NE刺激孤立肺动脉的血管收缩(39)成年大鼠肺移植体的肺微血管(40)由于NE也被认为可以刺激肺SMC的生长(44)低氧条件下NE上调受损也可能导致肺血管重塑受损和高血压Hif2α+/–老鼠。虽然我们不能排除NE水平因肺动脉压升高而上调，但WT小鼠缺氧4天后，即显著肺血管重塑开始之前，血浆NE水平已经升高。WT和Hif2α+/–小鼠在急性缺氧期间右心室收缩压也有类似的增加，这表明急性缺氧血管收缩反应不太可能由HIF-1α介导。相反，HIF-2α在慢性缺氧条件下对ET-1和NE的上调至关重要，从而介导SMC增殖和肺血管重塑。
红细胞压积。
Yu等人记录了红细胞增多症在Hif1α+/–老鼠(23). 我们没有观察到Hif2α+/–小鼠缺氧4周后。至少在目前条件下，低氧诱导促红细胞生成素表达可能更依赖HIF-1α而不是HIF-2α。这与HIF-2α在低氧上调ET-1和NE以及诱导肺动脉高压和血管重塑中的重要作用形成对比。虽然我们不能排除HIF-2α的部分缺失可能导致早期红细胞增多症的延迟，但可比较的红细胞压积水平与血管重塑受损相结合Hif2α+/–缺氧4周后的小鼠表明，这些小鼠的血管阻力降低不是由于红细胞压积水平降低所致。
体重减轻。
两种基因型在实验开始时的体重相当（约26克）。WT组的体重变化比WT组明显Hif2α+/–小鼠-常压下体重增加和缺氧下体重减轻。因此，WT小鼠在缺氧4周后体重为18克，在常氧4周后重32克，而相应的体重为Hif2α+/–小鼠缺氧22g，常压29g。另一个值得注意的观察是Hif1α+/–和Hif2α+/–小鼠在常氧状态下体重增加较少，而Hif1α+/–老鼠，不像Hif2α+/–小鼠在缺氧期间比WT小鼠减重更多(23). 这些发现表明，这两种HIF具有不同的作用。这可能与它们不同的细胞特异性表达有关。可能HIF-1α缺乏会损害缺氧时的糖酵解，从而降低Hif1α+/–老鼠。相反，我们最近发现HIF-2α在糖酵解基因低氧上调中的作用不如HIF-1α重要(26)表明HIF-1α在低氧调节影响体重增加的特定过程中可能比HIF-2α发挥更重要的作用。慢性阻塞性肺病患者的体重减轻也有记录(45).
医学意义。
HIF-2α在肺动脉高压和RV功能障碍发展中的作用可能具有临床相关性。总的来说，Hif2α+/–小鼠对低氧应激的耐受性比WT小鼠好得多，因为它们减重更少，保持更活跃，并且没有肺血管重塑或高血压。因此，我们的数据将有助于评估HIF-1α抑制剂对该疾病的可能治疗潜力。以前已经证明，通过阻断辅因子p300与HIF-1α和HIF-2α的相互作用，逆转录病毒介导抑制HIF可以抑制肿瘤生长(46). 考虑目前肺动脉高压治疗的局限性(2,三)抑制HIF可能被认为可以预防或减少低氧诱导的肺动脉高压。由于HIF-2α杂合缺陷已经对小鼠起到保护作用，因此部分抑制低氧诱导因子可能就足够了。
致谢
作者感谢S.Janssens（转基因技术和基因治疗中心）的有益讨论，以及A.Bouché、K.Bijnens、E.Gils、S.Jansen、L.Kieckens、A.Manderveld、K.Maris、T.Vancoetsem、A.Vandenhoeck、B.Vanwetswinkel和S.Wyns（均来自转基因技术和转基因治疗中心）提供的技术援助。这项工作得到了欧洲BIOMED赠款（编号：PL963380）和Interuniversitaire Attractiepolen赠款的支持。
脚注
利益冲突：提交人声明不存在利益冲突。
使用的非标准缩写：右心室；内皮素-1（ET-1）；低氧诱导因子-1α（HIF-1α）；低氧反应元件（HRE）；内弹性板；外弹性层（EEL）；平滑肌细胞；去甲肾上腺素（NE）。
工具书类
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