美国国家科学院院刊。2006年7月25日；103(30): 11399–11404.
调节突触蛋白在质膜中丰度和定位的因素
和*
杰里米·迪特曼
马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系02114
约书亚·M·卡普兰
马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系02114
马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系02114
彼得罗·德卡米利（Pietro V.De Camilli）编辑，耶鲁大学医学院，康涅狄格州纽黑文，2006年6月5日批准
作者贡献：J.S.D.和J.M.K.设计的研究；J.S.D.进行研究；J.S.D.贡献了新的试剂/分析工具；J.S.D.分析数据；J.S.D.和J.M.K.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
突触囊泡融合后，囊泡蛋白必须与质膜蛋白分离并回收，以维持功能性囊泡池。我们监测了突触素的分布，突触素是一种胞吐所需的囊泡蛋白秀丽隐杆线虫利用pH敏感的突触素GFP融合蛋白synaptopHfluorin检测运动神经元。我们估计30%的突触素存在于质膜中。通过使用一组内吞和外吐突变体，我们发现大多数表面突触短肽来源于突触小泡的融合，并且在稳定状态下，突触短肽在整个轴突中平衡。表面突触素在活性区附近富集，其空间范围受网格蛋白AP180调节。这些结果表明，突触素存在一个质膜贮存器，由突触囊泡循环提供，并可在整个轴突中回收。蓄水池的大小由外吞和内吞的相对速率决定。
关键词：AP180，内吞，pHfluorin，突触囊泡
突触释放的神经递质来源于突触小泡（SV）的循环池(1–三). 神经递质分泌需要几个过程，包括SV的生物生成、与质膜的对接、SV的ATP依赖性启动以使其具有融合能力、钙诱发融合和内吞再循环(4–6). 融合步骤被认为是由SNARE复合物介导的，SNARE复合体是一种四螺旋线圈结构，由囊泡SNARE（v-SNARE）、synaptobrevin/VAMP和质膜上的两个靶膜SNARE蛋白syntaxin 1和SNAP-25组成(7–10).
SNARE到囊泡和质膜的准确分类对于SV融合的协调至关重要(11,12). t-SNAREs syntaxin和SNAP-25在质膜中丰富，但被排除在循环SV之外(13,14)虽然在一些细胞内的隔室中发现了syntaxin(13,15–17). 几项研究记录了内源性突触短肽的显著部分(14)或synaptobrevin GFP(18,19)在质膜中。表面突触素可能来自SV前体融合，通过组成性分泌途径进行顺行运输(20–23). 另外，表面突触素可以反映囊泡融合后质膜内的扩散(19)或无法进行内吞作用的“滞留”囊泡(24). 最后，一些作者认为，表面突触素是由于错误分类造成的，尤其是突触素过度表达的情况下(22).
关于synaptobrevin的表面池仍有几个问题。这个池是由v-SNARE产生的吗？它们在胞吐后逃避检索？哪些内吞途径调节着突触素池？表面突触蛋白的空间分布是否受到某种限制？为了解决这些问题，我们使用了synaptopHfluorin（SpH），一种对pH敏感的GFP变体，融合到synaptobrevin的管腔结构域(25–29)，分析线虫中调节v-SNARE表面库的基因秀丽隐杆线虫.
结果
为了开发表面突触素的光学报告物，我们在胆碱能运动神经元中表达了SpH。在细胞体和腹侧和背侧神经索的轴突突起中均观察到荧光。我们使用两个标准来确定SpH的行为是否与内源性表达的突触素相似。首先，SpH要求unc-104号机组KIF1A运动蛋白的突触定位，如内源性突触蛋白（数据未显示）(30,31). 其次，SpH的泛神经元表达挽救了胆碱酯酶抑制剂涕灭威缺陷的运动和敏感性snb-1型突触蛋白突变体（数据未显示）(32,33). 因此，SpH在功能上取代了神经肌肉接头处的突触素。
SpH对pH高度敏感，因此荧光预计会在SV管腔的酸性环境中熄灭，而位于质膜上的SpH则不会受到抑制，每SpH分子的荧光增加20倍(25). 对单个动物进行解剖，将背部神经索20至100μm区域的轴突荧光聚焦到光电二极管上。为了测定轴突SpH的表面分数，我们测量了中和细胞内隔间（pH 7.4 NH）引起的SpH荧光变化4Cl）和淬火表面SpH（pH 5.6 Mes）(A类图6，作为支持信息发布在PNAS网站上）。根据这些测量结果，我们估计30%的轴突SpH位于细胞表面。这个数量与之前在培养的海马神经元中测定的表面丰度相似(25)和中鱼雷轴突(14). 表面分数计算假设SV呈酸性，如果SV接近中性pH值，则可能低估真实表面百分比，如果蝇属端子(34). 然而，这里使用的比率法给出了表面百分比估计值，这在很大程度上与囊泡pH值无关（参见支持方法和图7，作为支持信息发布在PNAS网站上）。
测量胆碱能运动神经元的表面和囊泡SpH。(A类)野生型动物的代表性实验。当按照指示交换细胞外溶液时，每隔15秒从荧光点进行光电二极管电流测量（参见方法). 注意，有大量背景光汇集到光电探测器上（参见支持方法详细信息）。(B类)一组突触突变体中SpH表面比率的总结：野生型编号122,里克-4SNAP-25，unc-64号机组合成蛋白，unc-13号机组Munc13、，unc-18号机组Munc18，dpy-23型μ2 AP2，dyn-1型dynamin、，unc-57号机组嗜内蛋白A和2011年11月AP180.参见方法用于计算表面比率。数据显示为平均值±SEM.*，P（P）<0.01（按学生）t吨测试，与野生型相比。
为了确定表面SpH池是否依赖于突触传递，我们在各种SV胞吐和胞吞突变体中重复测量。对于胞吐突变体，我们检测了缺乏t-SNARE突变体中的SpH荧光里克-4SNAP-25或unc-64号机组syntaxin 1，以及缺乏两个syntaxin-binding蛋白的突变体，unc-13号机组Munc13和Sm蛋白unc-18型Munc18/NSC1号机组(35–39). 所有四个突变体都显著降低了SpH的表面池，在unc-13号机组和unc-18号机组分别是突变体(B类). 在t-SNAREs突变体中观察到SpH表面比率的适度降低，可能是因为分析了低形态等位基因，因为零等位基因会导致致死表型(36,40).
网格蛋白适应2011年11月AP180和dpy-23型AP2μ2和内吞蛋白unc-57号机组嗜内蛋白A和动态-1SV内吞需要动态蛋白(41–46). 在所有研究的四个内吞突变体中，表面SpH显著增加（70-160%）(B类).
为了证实这些突变体中SpH的表面分数发生了改变，我们检测了野生型、，unc-18号机组、和2011年11月突变体。向更猝灭的SpH（例如，胞吐突变体）的转变将被预测为减缓漂白速率，而相反的转变将加速漂白速率。这一预测在实验上得到了证实（见图8，该图作为PNAS网站上的支持信息发布），从而进一步证明囊泡pH值与细胞外pH值存在显著差异。
这些实验表明，大部分SpH存在于质膜上。该表面池由SVs的胞吐提供，并通过网格蛋白介导的内吞作用进行再循环。此外，即使假设酸性SV管腔低估了绝对表面分数，在突触突变体组中观察到的表面SpH的相对位移也是稳健的。
囊泡和表面突触的空间组织。
GFP标记的synaptobrevin被广泛用作突触前标记物，其在突触的富集被认为与SV池相对应。因此，我们想知道表面突触短肽是否也可能在突触附近富集。检测的空间特征体内突触蛋白分布，我们在完整的动物中观察到两种不同形式的GFP标记突触蛋白。首先，为了分析总突触蛋白（即表面和内部）的分布，我们在完整动物的运动轴突中成像了一个N末端GFP标记的突触蛋白。在NGFP-SNB中，GFP被附加到突触素的细胞质域；因此，SVs和质膜中的NGFP-SNB分子具有相同的荧光。NGFP-SNB荧光明显呈点状，但我们也观察到点状之间有少量弥漫性轴突荧光，可能代表表面突触蛋白(澳大利亚).
完整动物的突触素成像。(澳大利亚)N端子标签放置GFP(NGFP-sb基因)在细胞质中。(抗体)表达C末端pHfluorin-tagged synaptobrevin的运动神经元(转速（SpH）)将荧光团置于囊泡腔中。（比例尺，5μm）(文学士)脊髓腹侧SpH的表达。神经肌肉接头位于脊髓底部（*）。(Bb公司)UNC-10 RIM1:：RFP在脊髓腹侧的表达。(密件抄送)SpH（绿色）和UNC-10（红色）的显色。(C类)野生型动物SpH的线扫描。使用自动化软件定位峰值（红色箭头）和基线（虚线），如支持方法.
我们发现70-90%的SpH荧光源于未被抑制的表面池，假设囊泡pH值在5.6到6.3之间（参见支持方法，等式。11); 因此，SpH图像主要反映表面突触蛋白。在野生型动物中，SpH荧光中度点状，表明表面SpH受到空间限制(抗体). 这些SpH点与突触前活动区标记物共定位联合国气候变化框架10边缘1(47,48)这表明在活动区附近有一个表层SpH的局部聚集区(B类). 如其他突触所述，这种SpH表面簇可能对应于一个特殊的内吞区，其中v-SNARE被再循环到SV池(49–51).
在胞吐中测量总突触蛋白和表面突触蛋白的分布(unc-13号机组Munc13）和内吞作用(联合国协调委员会11AP180）突变体的定量荧光显微镜(C类，请参阅方法). 在unc-13号机组突变体，NGFP-SNB点状荧光增加40%(抗体 左侧). 点状荧光增强表明SV池增加，因为先前的超微结构研究表明unc-13号机组突变体在神经肌肉接头处发现的胆碱能SV数量增加了74%(35). SV胞吐减少也会导致表面突触素减少，这在我们的实验中很明显。这个unc-13号机组突变体降低了NGFP-SNB轴突荧光，SpH荧光几乎消失，特别是在点状突变体之间的轴突(抗体 赖特). 这些发现与解剖中测得的SpH表面比率下降一致unc-13号机组突变体(B类).
突触突变体对突触蛋白分布的影响体内. (A类)野生型背索的代表性图像(一),unc-13号机组蒙克13(b条)、和2011年11月AP180型(c（c）)突变动物。(左侧)NGFP-SNB公司. (赖特)转速（SpH）. (B类)九种菌株的绝对SpH荧光峰值：编号122,里克-4,unc-64号机组,unc-13号机组,unc-18号机组,dpy-23型,dyn-1型,unc-57号机组、和2011年11月. (C类)Axon绝对荧光。将单个图像标准化为荧光珠标准（参见方法). (D类)测量的九种菌株中每种菌株的峰值荧光百分比变化与轴突荧光百分比变化图B类和C类数据的线性回归得出斜率为0.9，年8.2%的截距和PearsonR（右）2第0.99页(P（P）< 0.001). 所有数据均归一化为野生类型；条为平均值±SEM。**，P（P）<0.01（按学生）t吨测试，与野生型相比。请注意，有些误差条太小，无法在此刻度上显示。
tomosyn的丢失增加了表面突触蛋白的丰度。(A类)野生型菌株背索的代表性图像(上部)和来自tomosyn突变体东京-1(下部). （比例尺，5μm）(文学士)绝对峰值荧光（相对于荧光珠标准，参见方法)对于野生型和东京-1. (Bb公司)绝对轴突荧光。数据归一化为野生型；条为平均值±SEM。**，P（P）<0.001（学生）t吨测试，与野生型相比。
相反，在2011年11月突变体显著增加NGFP-SNB和SpH的轴突荧光(交流电)与解剖动物中观察到的表面SpH比率增加（160%）一致(B类). 点状SpH荧光也以类似的程度增加，表明突触周围表面簇可以持续存在，尽管总表面丰度大幅度增加。因此，当胞吐和胞内吞被破坏时，观察到完整动物的质膜SpH发生了巨大的双向变化，这与解剖动物的pHfluorin测量结果一致().
突触周围性SpH与轴突性SpH处于平衡状态。
如果SV成分在特定的内吞区再循环，我们可能会预计突触周围和轴突SpH的再循环会受到不同的调节。为了验证这一观点，我们量化了八个外细胞和内细胞突变体的突触前和轴突SpH( B类和C类). 突触轴面和突触周面SpH通常在整个突变组中受到同等影响。通过绘制每个突变的峰值与轴突荧光的相对变化来量化这种相关性(D类). 突触周和轴突表面SpH紧密相关(R（右）=0.99），回归斜率为0.9，表明在稳态条件下，两个地面水池之间建立了平衡。
Tomosyn调节表面突触蛋白丰度。
在迄今为止所检测的所有突变体中，囊泡融合或内吞的破坏改变了稳态表面突触蛋白的丰度。如果突触短肽的表面丰度是活性依赖性的，我们预计囊泡融合率增加的突变体也会改变表面突触短肽水平。为了验证这个想法，我们想象东京-1突变体，缺乏tomosyn，一种高度保守的130-kDa细胞质蛋白，最初被发现是syntaxin的结合伙伴(52,53). tomosyn的羧基末端SNARE基序与SNAP-25和syntaxin形成一个核心复合物，被认为是syntobrevin的竞争性抑制剂。tomosyn在神经内分泌细胞中的过度表达抑制囊泡融合(53,54)中的、和秀丽线虫tomosyn基因突变，东京-1，增强神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放(55). 峰和轴突表面SpH在东京-1突变体(). 因此，可以通过增加递送速度和降低提取速度来增加突触蛋白的表面池。
AP180调节突触周围SpH簇的大小。
我们通过测量突触周围SpH点的宽度，研究了破坏内吞作用的突变对表面突触蛋白空间限制的影响(). 野生型动物的平均点状宽度≈1μm，在dpy-23型AP2，动态-1dynamin，或unc-57号机组内白素A突变体（全部P（P）> 0.05). 在2011年11月AP180突变体，平均SpH点宽度增加35%( A类和B类以及图9，这是作为PNAS网站上的支持信息发布的），并且点状宽度的整个分布向更大的值转移(C类) (P（P）< 10−10). SpH点状宽度的这种变化不太可能是由2011年11月AP180突触，因为SpH点宽度>1μm，因此没有衍射限制；用共焦显微镜测量了类似的穿孔宽度（数据未显示）。我们不能排除几何变化导致突触静脉曲张亮度增加的可能性；然而，之前的超微结构研究(44)没有观察到突触膜几何形状在2011年11月突变体。表达50%以下SpH的转基因动物显示出相同的穿孔宽度（见图10，该图在PNAS网站上发布为支持信息）。最后，由于大多数SpH荧光在细胞内2011年11月突变体可以用酸性盐水淬灭（图11，作为支持信息发表在PNAS网站上）。这些结果表明，在2011年11月突变体不太可能由SpH丰度或细胞内细胞器分布的变化引起。因此，我们认为AP180可能在限制活性区附近的表面突触池中发挥重要作用。
内吞突变体对表面突触体点状宽度的影响。(A类)以下菌株（动物数量）的内吞突变对SpH点宽度的影响总结：野生型，dpy-23型μ2 AP2，dyn-1型dynamin、，unc-57号机组嗜内蛋白A和2011年11月AP180(B类)野生型代表性punta的分类(上部)和2011年11月AP180突变(下部)动物。（比例尺，1μm）(C类)点宽度直方图（测量为最大值一半时的全宽，见方法)对于野生型（黑色）和2011年11月（红色）动物。宽度以0.2-μm的间隔进行分类，并归一化为野生型峰值。数据来自野生型的1672只孔雀鱼（90只动物）和野生型的414只孔雀鸟（35只动物）2011年11月.所有数据均归一化为野生型；条为平均值±SEM。**，P（P）<0.01（按学生）t吨测试，与野生型相比。
讨论
我们的结果得出了四个主要结论。首先，在脑内胆碱能运动轴突的质膜上有大量突触素秀丽线虫这种表面突触素来源于SV池，以AP180调节的方式聚集在活性区附近。其次，突触素的表面池主要通过依赖于氯氰菊酯和动力的内吞作用进行再循环。第三，突触周表面突触调节蛋白与非突触轴索表面突触调控蛋白处于平衡状态。第四，增加分泌速率（东京-1突变体）导致表面池的净增加。
质膜突触素的来源。
利用免疫荧光、电子显微镜、生化分离和GFP融合蛋白在多种神经细胞类型的质膜中观察到突触体蛋白(14,18,19,56). 原则上，该质膜池有两个可能的来源：(我)融合SV和(ii（ii）)SV前体细胞向神经末梢顺行运输的胞吐。我们的结果支持前一个假设。正如在培养的海马神经元中观察到的那样，为了使表面突触素从SV中积累，一些囊泡蛋白必须在内吞过程中逃脱提取，并从突触周围内吞区扩散出去(19,56). 表面突触素在缺乏UNC-13和UNC-18的突变体中几乎被消除，这些蛋白对活性区SV的胞吐至关重要，但对组成性分泌途径并不需要。突触乙酰胆碱分泌增强东京-1tomosyn突变体增加了synaptobrevin的表面丰度，进一步证实了这种表面成分的突触起源。因此，synaptobrevin的表面池主要来源于神经末梢的SV融合。
Synaptobrevin检索路径。
有人提出了几种内吞途径来介导v-SNARE再捕获。在1–30秒的时间范围内，SV内吞被认为发生在邻近活动区的特殊内吞区。此处观察到的突触周围表面突触蛋白的富集可以反映这些内吞区的空间范围。在较慢的时间尺度上，非突触膜的组成性内吞和胞饮作用将捕获轴突突触蛋白，因此，可能有助于整个轴突的再循环(50,57,58). 我们观察到，在稳态条件下，在表面SpH浓度变化5倍的情况下，突触周围表面簇与非突触轴突SpH的数量之间存在紧密的相关性。这种相关性可能是两个隔间平衡的结果。由于我们在稳定状态下观察到局部（突触周膜）和全局（轴突膜）对表面突触蛋白的平行影响，所有这些内吞途径都可能有助于调节表面突触肽池。SVs质膜突触蛋白的分类取决于其细胞质域中的靶向序列(22). 无论突触蛋白的初始位置如何，这种分类信号都可以自主地将突触蛋白导向SV(20,21,59,60). 这些研究表明，非突触素突触素可以有效地分类为SV，从而提供了一种将表面丰度与囊泡池的补充耦合的方法，并提高了囊泡循环的再循环效率。
如图所示，轴突表面突触蛋白的平衡与之前的几项研究一致(19,56). 艾勒斯玛等。(61)报道称，囊泡融合后不到1秒，GFP标记的突触蛋白在1μm范围内达到平衡2膜区。快速形式的内吞作用，如“kiss-and-run”事件，可能会限制突触素的侧向扩散，而囊泡膜完全塌陷后再由氯氰菊酯介导的内吞可能导致相对较大的侧向扩散。据报道，哺乳动物中枢突触在胞吐后1秒内发生快速内吞事件(62). 在这个时间尺度上，假设扩散系数为2.5μm，内源性突触素预计扩散≈3μm2/秒(56,63). 然而，在更剧烈的活动期后，再循环时间减慢至20秒以上，理论上可以使突触素分子从其释放位置扩散10–15微米。由于在蠕虫神经索中每10μm中发现三到四个突触，这些结果支持我们的结论，即SV胞吐产生的表面突触蛋白在整个轴突中迅速平衡。
地面v-SNARE水池的维护。
血浆膜突触素的稳态丰度源于SV融合插入速率和内吞清除速率之间的平衡。在海马神经元中，胞吐速率的增加（在室温下超过2Hz的阈值水平）使回收机制不堪重负，并导致表面突触短肽的平行增加(64). 当缺乏抑制性SNARE tomosyn的突变体胞吐增加时，我们观察到类似的现象（表面SpH增加30-35%）。由于本研究中测试的所有突变体都会影响表面与囊泡突触结合蛋白的比率，因此我们得出结论，SV的胞吐与胞吞并非密不可分。综上所述，这些结果表明突触素的表面池由SV的胞吐和胞吞速率决定，因此与最近的突触活动相关。
AP180在表面突触素回收中的作用。
AP180定位于突触前内吞区，被认为在网格蛋白组装期间调节脂质双层的局部曲率(43,65,66). AP180缺失导致突触周围表面SpH簇增宽35%。Nonet公司等。(44)据报道，AP180突变体选择性地破坏了突触素从质膜的恢复，表明AP180作为突触素伴侣发挥作用。AP180还调节突触结合蛋白和半胱氨酸串蛋白的突触定位，这两种额外的SV相关蛋白(43). 我们的观察提供了证据，证明AP180的功能是将表面突触聚集在活性区附近。然而，AP180对于维持稳态梯度并不是必不可少的；我们仍然在2011年11月AP180突变体。
表面v-SNARE的功能意义。
我们认为突触蛋白的质膜池是SV循环的组成部分。几个结果与这一想法一致。首先，我们和其他人已经证明，突触蛋白总量的很大一部分是在细胞表面发现的(56). 此外，突触素的表面池来自SV的胞吐，并在整个轴突中平衡。在培养的啮齿动物神经元中，一个突触释放的突触蛋白可以在相邻的突触中循环，以补充其囊泡池(19). 在这些例子中，突触蛋白的表面丰度受突触活动的调节，而质膜池在从胞吐恢复过程中提供了v-SNARE的来源(67). 综上所述，这些结果表明表面突触素是SV循环的重要组成部分。还需要进一步的实验来确定表面突触蛋白的丰度是否调节突触效能。
方法
菌株和质粒。
如参考文献所述，进行菌株维护和遗传操作。68。动物在20°C的琼脂线虫生长培养基上培养，接种HB101细菌。本研究中使用的菌株列于支持方法.菌株KP#557编码一种pHfluorin-tagged蠕虫synaptobrevin（SNB-1），其中超黄道pHflucorin被插入在表达于snb-1型发起人。KP#558是在acr-2型发起人。KP#704编码一个GFP标记的SNB-1，其中GFP被插入N末端（NGFP-SNB），在acr-2型发起人。KP#930编码2010年11月用单体红色荧光蛋白（mRFP）串联重复序列标记的cDNAacr-2型发起人。
在体内显微镜和图像分析。
GFP和pHfluorin表达动物被安装在琼脂糖垫上，并在Zeiss-Axiovert显微镜上用Olympus PlanApo 100×NA 1.4物镜观察，如参考文献所述。69使用哈马松光电ORCA数码相机拍摄图像，并使用IGOR Pro（WaveMetrics，俄勒冈州奥斯韦戈湖）中的定制软件分析线扫描。在每次成像过程中拍摄500-nm荧光结合珠（分子探针）的图像，以提供比较动物之间绝对荧光水平的荧光标准。分析前减去背景信号（电荷耦合器件暗电流和载玻片自荧光）。自动行扫描分析如所述支持方法.
蠕虫解剖和荧光显微镜。
盐溶液配方列于支持方法将表达SpH的动物粘在Sylgard涂层的盖玻片（Dow-Corning）上，解剖并放置在灌注室中，进行细胞外盐水的重力灌注。在氙弧灯的落射荧光照射下激发背神经索的20至100μm区域，并将发射荧光聚焦到定制的光电二极管上，以建立基线荧光值。光电二极管电流每15秒采样30毫秒，以10 kHz（德克萨斯州奥斯汀National Instruments）数字化，数字滤波，并使用IGOR Pro（WaveMetrics）定制软件进行分析。对于大多数实验，NH的应用4将Cl和Mes pH 5.6重复至少一次，并对结果进行平均。在一些实验中，应用的顺序颠倒了，结果类似。全日空航空公司4施加Cl和Mes溶液，直到观察到稳定的荧光水平（至少5分钟）。表面积分计算的推导见支持方法.
致谢
我们感谢G.Garriga（加州大学伯克利分校）和秀丽线虫菌株遗传库中心，J.Rothman（纽约哥伦比亚大学）试剂，J.Madison咨询，J.Bai和S.Cotman协助共焦成像，Kaplan实验室成员对本手稿发表评论。这项工作得到了国立卫生研究院GM54728（给J.M.K.）和Damon Runyon博士后奖学金（给J.S.D.）的支持。
缩写
| SV公司 | 突触小泡 |
| v-SNARE公司 | 囊泡陷阱 |
| t-陷阱 | 靶膜SNARE |
| 转速（SpH） | 突触Hfluorin |
| NGFP-SNB公司 | N-末端GFP标记的突触短肽。 |
脚注
利益冲突声明：未声明冲突。
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
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